تجزئة الخلايا لخلايا U937 عن طريق تنقية التدرج بكثافة isopycnic

Summary

سيسمح بروتوكول التجزئة هذا للباحثين بعزل البروتينات السيتوبلازمية والنووية والميتوكوندريا والأغشية من خلايا الثدييات. يتم تنقية الجزأين الأخيرين تحت الخليتين بشكل أكبر عبر تدرج كثافة isopycnic.

Abstract

يصف هذا البروتوكول طريقة للحصول على أجزاء البروتين تحت الخلوي من خلايا الثدييات باستخدام مزيج من المنظفات والتحلل الميكانيكي والطرد المركزي المتدرج لكثافة isopycnic. الميزة الرئيسية لهذا الإجراء هي أنه لا يعتمد على الاستخدام الوحيد للمنظفات الذائبة للحصول على كسور تحت خلوية. هذا يجعل من الممكن فصل غشاء البلازما عن عضيات الخلية الأخرى المرتبطة بالغشاء. سيسهل هذا الإجراء تحديد توطين البروتين في الخلايا بطريقة قابلة للتكرار وقابلة للتطوير وانتقائية. تم استخدام هذه الطريقة بنجاح لعزل بروتينات الغشاء الخلوي والنووي والميتوكوندريا والبلازما من خط الخلايا الأحادية البشرية ، U937. على الرغم من أنه تم تحسينه لخط الخلية هذا ، إلا أن هذا الإجراء قد يكون بمثابة نقطة انطلاق مناسبة للتجزئة تحت الخلوية لخطوط الخلايا الأخرى. تتم مناقشة المزالق المحتملة للإجراء وكيفية تجنبها وكذلك التعديلات التي قد تحتاج إلى النظر في خطوط الخلايا الأخرى.

Introduction

التجزئة تحت الخلوية هي إجراء يتم فيه تحليل الخلايا وفصلها إلى مكوناتها المكونة من خلال عدة طرق. يمكن استخدام هذه التقنية من قبل الباحثين لتحديد توطين البروتين في خلايا الثدييات أو لإثراء البروتينات منخفضة الوفرة التي لا يمكن اكتشافها بخلاف ذلك. في حين أن طرق التجزئة تحت الخلوية موجودة حاليا ، وكذلك المجموعات التجارية التي يمكن شراؤها ، فإنها تعاني من العديد من القيود التي يحاول هذا الإجراء التغلب عليها. تعتمد معظم طرق تجزئة الخلايا حصريا على المنظفات ^1,2 ، وتعتمد على استخدام مخازن مؤقتة تحتوي على كميات متزايدة من المنظفات لإذابة المكونات الخلوية المختلفة. في حين أن هذه الطريقة سريعة ومريحة ، إلا أنها تنتج كسورا غير نقية. تم تصميم هذه للسماح للباحثين بعزل واحد أو اثنين من مكونات الخلية بسهولة ، ولكنها ليست معقدة بما يكفي لعزل أجزاء متعددة تحت الخلوية من عينة في نفس الوقت. عادة ما يؤدي الاعتماد فقط على المنظفات إلى إذابة عضيات مغلقة بالغشاء وغشاء البلازما بشكل عشوائي ، مما يجعل فصل هذه المكونات أمرا صعبا. ومن المضاعفات الإضافية الناجمة عن استخدام هذه المجموعات عدم قدرة الباحثين على تغييرها / تحسينها لتطبيقات محددة ، حيث أن معظم المكونات عبارة عن تركيبات مسجلة الملكية. أخيرا ، يمكن أن تكون هذه المجموعات باهظة الثمن ، مع وجود قيود في عدد الاستخدامات تجعلها أقل من مثالية للعينات الأكبر.

على الرغم من توفر مجموعات لعزل الميتوكوندريا التي لا تعتمد على المنظفات ، إلا أنها ليست مصممة لعزل غشاء البلازما وإنتاج كميات أقل بكثير من العينة من بروتوكولات العزل القياسية ^3,4. في حين أن طرق الطرد المركزي التفاضلية تستغرق وقتا أطول ، فإنها غالبا ما تؤدي إلى كسور مميزة لا يمكن الحصول عليها باستخدام مجموعات قائمة على المنظفات^{حصريا 1}. يسمح الفصل دون الاستخدام الوحيد للمنظفات القابلة للذوبان أيضا بمزيد من التنقية باستخدام الطرد المركزي الفائق وتدرجات كثافة isopycnic ، مما يؤدي إلى تلوث أقل تبادليا. يوضح بروتوكول التجزئة هذا عزل الأجزاء تحت الخلوية من وحيدات U937 باستخدام مزيج من الأساليب القائمة على المنظفات والطرد المركزي عالي السرعة. ستسهل هذه الطريقة عزل مكونات الغشاء النووي والسيتوبلازمي والميتوكوندريا والبلازما لخلية الثدييات مع الحد الأدنى من التلوث بين الكسور.

Protocol

1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف

1. إعداد حلول جديدة من مثبطات الفوسفاتيز والبروتيازي.
   1. أضف 17.4 مجم من فلوريد فينيل ميثان سلفونيل (PMSF) إلى 1 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ لتحضير مخزون 100 مللي مم.
      ملاحظة: ارتد معدات واقية عند التعامل مع PMSF لأنها خطرة عند تناولها أو استنشاقها وعند ملامستها للجلد أو العينين. إنه تآكل للعينين والجلد.
   2. وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ، قم بإعداد كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني المتاح تجاريا (100x).
   3. أضف 91.9 مجم من أورثوفانادات الصوديوم (SOV) إلى 1 مل من الماء منزوع الأيونات لتحضير مخزون 500 mM.
      ملاحظة: ارتد معدات واقية عند التعامل مع SOV لأنه خطير إذا تم تناوله أو استنشاقه أو عند ملامسته للعينين. التعرض المفرط الشديد قد يؤدي إلى الوفاة.
2. تحضير محلول التحلل A ، المخزن المؤقت للعزل السيتوبلازمي (CI) ، المخزن المؤقت لإذابة الخلايا (CS) ، المخزن المؤقت للتحلل النووي (NL) ، المخزن المؤقت للتحلل B ، المخزن المؤقت لتجانس الخلايا (CH) ، مخفف اليوديكسانول ، والمنظفات.
   1. أضف 8.7 جم من كلوريد الصوديوم (NaCl) و 50 مل من حمض 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازين إيثان سلفونيك (HEPES ، 1 M ، درجة الحموضة 7.4) إلى 950 مل من الماء منزوع الأيونات لتحضير محلول التحلل A (التركيزات النهائية 150 mM NaCl و 50 mM HEPES).
   2. تحضير محاليل مخزون المنظفات على النحو التالي: أضف 0.1 جم من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) إلى 10 مل من محلول التحلل A (التركيز النهائي 1٪ SDS) ، أضف 0.1 جم من ديوكسي كولات الصوديوم إلى 10 مل من محلول التحلل A (التركيز النهائي 1٪) ، أضف 2.5 مجم من الديجيتونين إلى 10 مل من محلول التحلل A (التركيز النهائي 250 ميكروغرام / مل) ، وإضافة 1 مل من المنظفات غير الأيونية وغير المسوخة (انظر جدول المواد) إلى 9 مل من محلول التحلل A (التركيز النهائي 10٪ (v / v)).
   3. تحضير المخزن المؤقت CI بإضافة 10 ميكرولتر من مخزون PMSF (100 mM) ، و 10 ميكرولتر من مثبط الأنزيم البروتيني (100x) ، و 2 ميكرولتر من مخزون SOV (500 mM) ، و 100 ميكرولتر من مخزون digitonin (250 ميكروغرام / مل) إلى 878 ميكرولتر من محلول التحلل A (التركيزات النهائية ل 1 mM PMSF ، 1x مثبط الأنزيم البروتيني ، 1 mM SOV ، و 25 ميكروغرام / مل ديجيتونين). الحفاظ على الحل على الجليد حتى إضافة إلى بيليه الخلية.
   4. قم بإعداد المخزن المؤقت CS بإضافة 10 ميكرولتر من مخزون PMSF (100 مللي مول) ، و 10 ميكرولتر من مثبط الأنزيم البروتيني (100x) ، و 2 ميكرولتر من مخزون SOV (500 مللي مول) ، و 100 ميكرولتر من مخزون المنظفات غير الأيونية وغير المسخ (انظر جدول المواد) (10٪) ، و 118 ميكرولتر من مخزون هيكسيلين جلايكول (8.44 م) إلى 760 ميكرولتر من محلول التحلل A (التركيزات النهائية ل 1 mM PMSF ، 1x مثبط الأنزيم البروتيني ، 1 mM SOV ، 1٪ منظف غير أيوني ، غير معطل ، و 1 M هيكسيلين جلايكول). الحفاظ على الحل على الجليد حتى إضافة إلى بيليه الخلية.
   5. تحضير المخزن المؤقت NL بإضافة 10 ميكرولتر من مخزون PMSF (100 مللي مول) ، و 10 ميكرولتر من مثبط الأنزيم البروتيني (100x) ، و 2 ميكرولتر من مخزون SOV (500 مللي مول) ، و 50 ميكرولتر من مخزون ديوكسي كولات الصوديوم (10٪) ، و 100 ميكرولتر من مخزون SDS (1٪) ، و 118 ميكرولتر من مخزون هيكسيلين جلايكول (8.44 M) إلى 710 ميكرولتر من محلول التحلل A (التركيزات النهائية ل 1 mM PMSF ، 1x مثبط الأنزيم البروتيني ، 1 mM SOV ، 0.5٪ ديوكسي كولات الصوديوم (v / v) ، 0.1٪ SDS (w / v) ، و 1 M هيكسيلين جلايكول). الحفاظ على الحل على الجليد حتى إضافة إلى بيليه النووية.
   6. أضف 20 مل من HEPES (1 م ، درجة الحموضة 7.4) ، 0.74 جم من كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، 0.19 جم من كلوريد المغنيسيوم (MgCl 2) ، 2 مل من حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (0.5 M EDTA) ،₂ مل من إيثيلين جلايكول مكرر (β-أمينو إيثيل إيثر) -N ، N ، N '، N'-حمض رباعي الخليك (0.5 M EGTA) ، 38.3 جم من مانيتول ، و 23.9 جم من السكروز إلى 980 مل من الماء منزوع الأيونات لتحضير محلول التحلل B (التركيزات النهائية ل 20 mM HEPES ، 10 mM KCl ، 2 mM MgCl₂ ، 1 mM EDTA ، 1 mM EGTA ، 210 mM مانيتول ، و 70 mM السكروز).
   7. قم بإعداد المخزن المؤقت CH بإضافة 10 ميكرولتر من مخزون PMSF (100 mM) و 2 ميكرولتر من مخزون SOV (500 mM) إلى 988 μL من محلول التحلل B (التركيزات النهائية 1 mM PMSF و 1 mM SOV ؛ اضبط الحجم النهائي لاستيعاب عدد الخلايا التي يتم تحللها). الحفاظ على الحل على الجليد حتى إضافة إلى بيليه الخلية.
   8. تحضير مخفف اليوديكسانول بإضافة 12 مل من HEPES (1 م ، درجة الحموضة 7.4) ، 447 ملغ من KCl ، 114 غرام من MgCl 2 ، 1.2 مل من 0.5 M EDTA ،_1.2 مل من 0.5 M EGTA ، 21.3 جم من مانيتول ، و 14.4 جم من السكروز إلى 88 مل من الماء منزوع الأيونات (التركيزات النهائية ل 120 mM HEPES ، 60 mM KCl ، 12 mM MgCl₂ ، 6 mM EDTA ، 6 mM EGTA ، 1200 mM مانيتول ، و 420 mM السكروز).
   9. قم بتخزين المخازن المؤقتة عند 4 درجات مئوية والديجيتونين عند -20 درجة مئوية.

2. عزل البروتين الخلوي

ملاحظة: ستسمح الخطوات التالية بنمو وتوسع خلايا U937 متبوعة باستخراج البروتينات الخلوية. عند التركيز المستخدم ، سوف يتخلل الديجيتونين غشاء البلازما دون تعطيله ، مما يسمح بإطلاق البروتينات الخلوية والاحتفاظ بالبروتينات الخلوية الأخرى.

1. استزرع الخلايا في RPMI 1640 مع 10٪ مصل بقري جنيني عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂. تأكد من نمو الخلايا إلى إجمالي نهائي من 6 × 10⁸ خلايا.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم عد الخلايا باستخدام مقياس الدم القياسي والمجهر.
2. أجهزة الطرد المركزي للخلايا المستزرعة عند 400 × جم لمدة 10 دقائق. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في محلول ملحي مخزن بالفوسفات بدرجة حرارة الغرفة (PBS) بتركيز نهائي من 4 × 10⁶ خلايا / مل ، وماصة برفق لتفتيت الكتل.
3. جهاز طرد مركزي لتعليق الخلية عند 400 × جم لمدة 10 دقائق لتكوير الخلايا. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في محلول تحلل الجليد البارد A (المحضر في الخطوة 1.2.1) بتركيز نهائي قدره 2 × 10⁷ خلايا / مل.
4. قم بإزالة 7.5 مل من الخلايا العالقة في محلول التحلل A (3 × 10⁷ خلايا) ، واحتفظ بالثلج لاستخراج البروتين النووي (القسم 6). جهاز طرد مركزي لتعليق الخلية عند 4 درجات مئوية ، 400 × جم لمدة 10 دقائق لتكوير الخلايا.
   ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات اللاحقة عند 4 درجات مئوية أو على الجليد ، وقم بتبريد جميع المخازن المؤقتة.
5. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في المخزن المؤقت CI بتركيز نهائي قدره 2 × 10⁷ خلايا / مل ، وماصة برفق لتفتيت الكتل. قم بتدوير تعليق الخلية من طرف إلى طرف عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
6. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 4 درجات مئوية ، 400 × جم لمدة 10 دقائق ، وانقل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي نظيف. احفظ حبيبات الخلية ، وقم بتخزينها على الثلج. جهاز طرد مركزي للطافي الذي تم جمعه عند 4 درجات مئوية ، 18000 × جم لمدة 20 دقيقة لحبيبات الحطام الخلوي.
   ملاحظة: خطوة الطرد المركزي عالية السرعة هذه ضرورية لمنع تلوث الجزء الخلوي بالعضيات والبروتينات المرتبطة بالغشاء.
7. تخلص من الحبيبات بعد نقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي نظيف. كرر كلا خطوتي الطرد المركزي في الخطوة 2.6 حتى لا يتم الحصول على حبيبات بعد الطرد المركزي.
8. جمع الطاف ، وهو الجزء الخلوي. للتخزين قصير الأجل (1 شهر) ، تأكد من تخزين المادة الطافية في 4 درجات مئوية. للتخزين طويل الأجل (> شهر واحد) ، امزج المادة الطافية مع 1x Laemmli عازلة تحتوي على 1x عامل اختزال ، سخنيها عند 95 درجة مئوية لمدة 7 دقائق ، واحفظها في -20 أو -80 درجة مئوية.
9. إعادة تعليق حبيبات الخلية (من الخطوة 2.6) في المخزن المؤقت للتحلل A بتركيز نهائي قدره 4 × 10⁶ خلايا / مل ؛ ماصة بلطف لتفتيت الكتل.

3. تجانس الخلايا

ملاحظة: ستسمح الخطوات التالية بالتجانس الميكانيكي للخلايا المعالجة بالديجيتونين (من الخطوة 2.9) ، وهو أمر ضروري لعزل أجزاء بروتين الميتوكوندريا والغشاء.

1. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية في محلول التحلل A (المحضر في الخطوة 2.9) ، واحفظ الحبيبات ، وتخلص من المادة الطافية لإزالة الديجيتونين الزائد والملوثات الخلوية من حبيبات الخلية.
   ملاحظة: يمكن إجراء غسلات متكررة في محلول التحلل A لإزالة الملوثات الخلوية الزائدة.
2. أعد تعليق حبيبات الخلية في محلول CH بارد (محضر في الخطوة 1.2.7) بتركيز نهائي من 4 × 10⁶ خلايا / مل. احتضان تعليق الخلية على الجليد لمدة 30 دقيقة.
3. إذا كنت تستخدم طريقة قائمة على الخرز للتحلل الميكانيكي ، ضع 30 جم من حبات الفولاذ المقاوم للصدأ المغسولة مسبقا مقاس 3.2 مم في أنبوب ملتف سعة 50 مل ، واملأه ب 15 مل من محلول التحلل B ، وضعه على الثلج ليبرد. في حالة استخدام خالط Dounce (مع مدقة B محكمة الإحكام) ، املأ بحجم مناسب من محلول التحلل B ، وأدخل المدقة ، وضعها على الثلج لتبرد.
4. بعد الحضانة (الخطوة 3.2) ، تخلص من محلول التحلل B من أنابيب الخرز (أو الخالط Dounce) ، وانقل 15 مل من معلق الخلية إلى أنبوب الخرزة (أو حجم مناسب إلى الخالط).
5. في حالة استخدام الطريقة القائمة على الخرز ، ضع أنابيب الخرزة التي تحتوي على تعليق الخلية في جهاز الخلاط ، وقم بتكوينها للتشغيل لمدة 5 دقائق بسرعة 8. في حالة استخدام خالط Dounce ، احتفظ به على الجليد ، وقم بإجراء 40 تمريرة باستخدام المدقة باستخدام ضربات بطيئة ومتساوية (أو استخدم طريقة بديلة لتحلل الخلية الميكانيكية كما هو مفصل في قسم المناقشة).
   ملاحظة: في حالة استخدام جهاز خلاط مختلف عن الجهاز المستخدم هنا ، فقد يلزم تحديد السرعة والوقت تجريبيا.
6. انقل التجانس إلى أنبوب طرد مركزي نظيف ، وقم بجهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. نقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي نظيف وحفظها ؛ تجاهل بيليه.
   ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا وتخزين التجانس عند 4 درجات مئوية على المدى القصير (24 ساعة).

4. إزالة الحطام وعزل أجزاء الميتوكوندريا والأغشية الخام

ملاحظة: ستسمح الخطوات التالية بإزالة الحطام الخلوي عن طريق الطرد المركزي للتجانس بسرعات متزايدة. ويتبع ذلك الطرد المركزي التفاضلي لعزل أجزاء الميتوكوندريا الخام والغشاء.

1. قم بالطرد المركزي للتجانس (من الخطوة 3.6) عند 500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي نظيف ، وتخلص من أي حبيبة.
2. جهاز طرد مركزي للطافي (من الخطوة 4.1) عند 1000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي نظيف ، وتخلص من أي حبيبة.
3. جهاز طرد مركزي للطافي (من الخطوة 4.2) عند 2000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي نظيف ، وتخلص من أي حبيبة.
4. جهاز طرد مركزي للطافي (من الخطوة 4.3) عند 4000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي نظيف ، واحفظ الحبيبات ، وهي جزء الميتوكوندريا الخام.
5. جهاز طرد مركزي للطافي (من الخطوة 4.4) عند 18000 × جم لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية ، واحفظ الحبيبات ، وهي جزء الغشاء الخام.
   ملاحظة: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ، وتخزين العينات المحببة عند 4 درجات مئوية على المدى القصير (24 ساعة).

5. تنقية التدرج كثافة isopycnic

ملاحظة: تستخدم الخطوات التالية الطرد المركزي المتدرج لكثافة isopycnic لتنقية أجزاء الميتوكوندريا والأغشية الخام.

1. تحضير محلول عمل بنسبة 50٪ (v / v) من اليوديكسانول عن طريق خلط جزء واحد مخفف (محضر في الخطوة 1.1.3) إلى 5 أجزاء من اليوديكسانول (60٪ محلول مخزون (وزن / حجم)). تحضير 10٪ و 15٪ و 20٪ و 25٪ و 30٪ و 35٪ محاليل يوديكسانول (v / v) عن طريق خلط محلول عمل 50٪ (v / v) مع محلول التحلل B بكميات مناسبة.
2. أعد تعليق كريات الميتوكوندريا والأغشية الخام (من الخطوتين 4.4 و 4.5) لكل منها في 200 ميكرولتر من محلول التحلل B. اضبط على 45٪ يوديكسانول (v / v) بإضافة 1800 ميكرولتر من محلول اليوديكسانول العامل (50٪ (v / v)) إلى 200 ميكرولتر من الحبيبات المعاد تعليقها.
3. قم بإنشاء تدرج متقطع لليوديكسانول على النحو التالي (اضبط وحدات التخزين حسب الاقتضاء لسعة أنبوب الطرد المركزي الفائق): أضف 1 مل من 15٪ يوديكسانول (v / v) إلى قاع أنبوب طرد مركزي فائق 8 مل مفتوح من الأعلى ورقيق الجدران ، ضع 1 مل من 20٪ يوديكسانول (v / v) أسفل الطبقة الأولى (بواسطة تقنية البطانة السفلية) ، متبوعا بطبقة تحتية 1 مل من 25٪ ، 1 مل من 30٪ ، و 1 مل من 35٪ يوديكسانول (v / v).
   ملاحظة: يجب أن يكون هناك 2 تدرجات تم إنشاؤها في هذه الخطوة ، 1 لجزء الميتوكوندريا و 1 لجزء الغشاء.
4. في 1 تدرج ، أضف 2 مل من حبيبات الميتوكوندريا الخام (معلقة في 45٪ يوديكسانول (v / v)) باستخدام تقنية الأساس إلى أسفل الأنبوب أسفل 35٪ يوديكسانول (v / v). في التدرج الآخر ، أضف 2 مل من حبيبات الغشاء الخام (معلقة في 45٪ يوديكسانول (v / v)) باستخدام تقنية الطبقة السفلية إلى أسفل الأنبوب أسفل 35٪ يوديكسانول (v / v).
5. أضف 1 مل من 10٪ يوديكسانول (v / v) إلى الجزء العلوي من كل أنبوب متدرج عن طريق تراكبه فوق طبقة 15٪. موازنة الأنابيب في حدود 0.1 غرام من بعضها البعض عن طريق إضافة 10 ٪ يوديكسانول (v / v).
6. قم بتدوير أنابيب تدرج الكثافة عند 4 درجات مئوية لمدة 18 ساعة عند 100000 × جم. تأكد من ضبط التسارع والتباطؤ على الحد الأدنى من قيم أجهزة الطرد المركزي الفائقة المستخدمة.
   ملاحظة: في تدرج الميتوكوندريا ، سيكون هناك نطاق مرئي عند الواجهة بين 25٪ و 30٪ يوديكسانول (v / v). هذا هو جزء الميتوكوندريا النقي. في تدرج الغشاء ، سيكون هناك شريط مرئي في جزء 15٪ يوديكسانول (v / v). هذا هو جزء الغشاء النقي. قد تكون هناك نطاقات إضافية في كسور 25٪ و 30٪ يوديكسانول (v / v) في تدرج الغشاء. هذا هو تلوث الميتوكوندريا.
7. اجمع الكسور من أعلى الأنبوب في حصص 1 مل ، مع الحرص على تقليل حجم الكسر الذي يحتوي على الأشرطة المرئية وتغيير طرف الماصة بعد جمع كل طبقة. بدلا من ذلك ، قم بثقب جانب الأنبوب الرقيق الجدران بإبرة ، وجمع العصابات المرئية.
8. قم بتخزين العينات كما هو موضح في الخطوة 2.8 حتى يتم التحقق منها عن طريق فحص البروتين واللطخة الغربية.

6. عزل البروتين النووي

ملاحظة: باستخدام المنظفات الأيونية وغير الأيونية وكذلك تقنيات مثل الصوتنة والطرد المركزي ، ستعمل الخطوات التالية على إذابة جميع الأغشية الخلوية والسماح بعزل البروتينات النووية.

1. قم بالطرد المركزي للقسمة 7.5 مل من الخلايا المعلقة في محلول التحلل A (من الخطوة 2.4) ، وتخلص من المادة الطافية. أضف 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت CS المثلج (المحضر في الخطوة 1.2.4) ، وأعد تعليق الحبيبات عن طريق السحب والدوامة. احتضان العينات على الجليد (أو عند 4 درجات مئوية) لمدة 30 دقيقة لتعطيل أغشية البلازما والعضيات مع حماية البروتينات النووية.
2. جهاز طرد مركزي لمعلق الخلية عند 7000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية. أضف 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت NL المثلج البارد (المحضر في الخطوة 1.2.5) إلى الحبيبات النووية بعد تضمين 1U / μL benzonase. أعد تعليق الحبيبات عن طريق السحب برفق. احتضان على دوار طرف إلى طرف لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لتعطيل الغشاء النووي.
3. Sonicate لمدة 5 ثوان بقوة 20٪ مع أنابيب عينة مبردة في حمام جليدي (3x ، مع توقف مؤقت لمدة 5 ثوان بين النبضات) ، والتي جنبا إلى جنب مع البنزوناز (المضافة في الخطوة 6.2) ، سوف تقص الأحماض النووية.
4. جهاز طرد مركزي سونيكات عند 7800 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. جمع وحفظ الطاف ، وهو الجزء النووي. تأكد من عدم إزعاج الحبيبات غير القابلة للذوبان أثناء جمع المادة الطافية. للتخزين ، يمكن تحضير العينات كما هو موضح في الخطوة 2.8.

7. تحديد كمية البروتين وتحليل اللطخة الغربية

ملاحظة: ستحدد الخطوات التالية البروتين الكلي في كل جزء وتؤكد نقاء الكسور تحت الخلوية.

1. قم بإجراء اختبار برادفورد القياسي لتحديد البروتين الكلي في كل جزء. راجع الجدول 1 لمعرفة غلة البروتين المتوقعة.
   ملاحظة: يمكن استخدام مقايسات البروتين الأخرى مثل مقايسة حمض البيسينتشونينيك (BCA) أو الامتصاص عند 280 نانومتر لقياس البروتين الكلي بدلا من مقايسة برادفورد.
2. يمزج الكسور مع 1x Laemmli عازلة تحتوي على 1x عامل اختزال ، ويسخن عند 95 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. قم بتحميل 10 ميكروغرام من كل جزء في هلام SDS-polyacrylamide gel الكهربائي القياسي (PAGE) ، وقم بتشغيل الجل عند 20 مللي أمبير لمدة 1 ساعة.
3. انقل البروتينات المذابة إلى غشاء بولي فينيل ثنائي فلوريد (PVDF) عن طريق إجراء نقل قياسي للبقع المناعية عند 100 فولت لمدة 30 دقيقة. سد غشاء PVDF بحليب 5٪ في محلول ملحي 1x Tris (TBS) يحتوي على 0.1٪ من منظف غير أيوني (v / v) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
4. أضف الأجسام المضادة الأولية المناسبة للكشف عن بروتينات التدبير المنزلي الخاصة بكل جزء تحت خلوي ، واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. اغسل الغشاء بحليب 5٪ في 1x TBS يحتوي على 0.1٪ من المنظف غير الأيوني (v / v) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم استخدام الأجسام المضادة ضد نازعة هيدروجين الجلسرين الدهيد -3 فوسفات (GAPDH ، 1: 10000) ، هيستون H3 (1: 2000) ، قناة أنيون تعتمد على الجهد (VDAC ، 1: 1000) ، و Na ، K ⁺ -ATPase للكسور الخلوية والنووية والميتوكوندريا والأغشية ، على التوالي.
5. أضف الأجسام المضادة الثانوية المترافقة من الفجل (HRP) إلى الغشاء (تمييع وفقا لتعليمات الشركة الصانعة) ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. اغسل الغشاء بحليب 5٪ في 1x TBS يحتوي على 0.1٪ من المنظف غير الأيوني (v / v) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تطوير لطخة باستخدام التلألؤ الكيميائي القياسي.

النتائج

يلخص مخطط انسيابي تخطيطي لهذا الإجراء (الشكل 1) بصريا الخطوات التي تم اتخاذها لتجزئة خلايا U937⁵ المزروعة في التعليق بنجاح. تظهر الكسور التي تم جمعها من الجزء العلوي من تدرج كثافة isopycnic بأحجام متساوية (1 مل) تنقية كسور الميتوكوندريا والأغشية (الشكل 2

Discussion

هذه الطريقة هي نسخة معدلة من نهج منشور مسبقا للتجزئة تحت الخلوية دون استخدام الطرد المركزي عالي السرعة¹¹. تتطلب هذه الطريقة المعدلة معدات أكثر تخصصا لتحقيق أفضل النتائج ، ولكنها أكثر شمولا وقابلة للتكرار باستمرار.

كان تطوير البروتوكول الأولي ضروريا بسبب عدم ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	61-BB50-DX
digitonin	Sigma	D141
end-over-end rotator	ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma	E3889
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118
HEPES	VWR	97064-360
Hexylene glycol	Sigma	68340
Igepal	Sigma	I7771	Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl	Sigma	P9333
Mannitol	Sigma	M9647
MgCl2	Sigma	M8266
NaCl	Sigma	S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm	Seton Scientific	7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium	Sigma	D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML
refrigerated centrifuge	ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor	Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	436143
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma	567540
sonicator	ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge	ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm	Next Advance	SSB32
Sucrose	Sigma	S0389
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	97062-370
Tween 20			non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661