פיצול תאים של תאי U937 על ידי טיהור הדרגתי בצפיפות איזופיקנית

Summary

פרוטוקול פיצול זה יאפשר לחוקרים לבודד חלבונים ציטופלסמיים, גרעיניים, מיטוכונדריאליים וממברנות מתאי יונקים. שני השברים התת-תאיים האחרונים מטוהרים עוד יותר באמצעות שיפוע צפיפות איזופיקני.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר שיטה להשגת שברי חלבון תת-תאיים מתאי יונקים באמצעות שילוב של דטרגנטים, תזה מכנית וצנטריפוגה הדרגתית בצפיפות איזופיקנית. היתרון העיקרי של הליך זה הוא שהוא אינו מסתמך על השימוש הבלעדי בדטרגנטים מפריכים כדי להשיג שברים תת-תאיים. זה מאפשר להפריד את קרום הפלזמה מאברונים אחרים הקשורים לממברנה של התא. הליך זה יקל על קביעת לוקליזציה של חלבונים בתאים בשיטה ניתנת לשחזור, מדרגית וסלקטיבית. שיטה זו שימשה בהצלחה לבידוד חלבונים ציטוזוליים, גרעיניים, מיטוכונדריאליים וממברנות פלזמה מקו תאי המונוציטים האנושיים, U937. למרות שהוא ממוטב עבור קו תאים זה, הליך זה עשוי לשמש כנקודת התחלה מתאימה לפיצול תת-תאי של קווי תאים אחרים. מכשולים פוטנציאליים של ההליך וכיצד להימנע מהם נדונים כמו גם שינויים שאולי צריך לקחת בחשבון עבור קווי תאים אחרים.

Introduction

פיצול תת-תאי הוא הליך שבו תאים שוכבים ומופרדים למרכיביהם המרכיבים אותם באמצעות מספר שיטות. טכניקה זו יכולה לשמש חוקרים כדי לקבוע לוקליזציה של חלבונים בתאי יונקים או להעשרה של חלבונים בעלי שפע נמוך שאחרת לא היו ניתנים לגילוי. אמנם קיימות כיום שיטות לפיצול תת-תאי, וכך גם ערכות מסחריות שניתן לרכוש, אך הן סובלות מכמה מגבלות שהליך זה מנסה להתגבר עליהן. רוב שיטות חלוקת התאים מבוססות אך ורק על ^1,2 על דטרגנטים^, תוך הסתמכות^על שימוש במאגרים המכילים כמויות הולכות וגדלות של חומרי ניקוי כדי לבודד רכיבים תאיים שונים. בעוד ששיטה זו מהירה ונוחה, היא גורמת לשברים לא טהורים. אלה נועדו לאפשר לחוקרים לבודד בקלות מרכיב אחד או שניים של התא, אך אינם מורכבים מספיק כדי לבודד שברים תת-תאיים מרובים מדגימה בו זמנית. הסתמכות על דטרגנטים בלבד גורמת בדרך כלל לכך שאברונים סגורים בממברנה וממברנת הפלזמה מסולפת ללא הבחנה, מה שמקשה על הפרדת רכיבים אלה. סיבוך נוסף מהשימוש בערכות אלה הוא חוסר היכולת של החוקרים לשנות/לייעל אותן עבור יישומים ספציפיים, שכן רוב הרכיבים הם פורמולציות קנייניות. לבסוף, ערכות אלה יכולות להיות יקרות להחריד, עם מגבלות במספר השימושים שהופכות אותן לפחות אידיאליות עבור דגימות גדולות יותר.

למרות הזמינות של ערכות לבידוד מיטוכונדריה שאינן מסתמכות על חומרי ניקוי, הן אינן מיועדות לבודד את קרום הפלזמה ולהניב כמויות דגימה נמוכות משמעותית מפרוטוקולי בידוד^{סטנדרטיים 3,4}. בעוד ששיטות צנטריפוגה דיפרנציאליות גוזלות זמן רב יותר, לעתים קרובות הן יוצרות שברים נפרדים שלא ניתן להשיג באמצעות ערכות מבוססות דטרגנטים^{בלבד 1}. הפרדה ללא שימוש בלעדי בדטרגנטים מסיסים מאפשרת גם טיהור נוסף באמצעות שיפועים אולטרה-צנטריפוגציה וצפיפות איזופיקנית, וכתוצאה מכך פחות זיהום צולב. פרוטוקול פיצול זה מדגים את הבידוד של שברים תת-תאיים ממונוציטים U937 באמצעות שילוב של גישות מבוססות דטרגנטים וצנטריפוגות במהירות גבוהה. שיטה זו תאפשר בידוד של מרכיבי הממברנה הגרעינית, הציטופלסמית, המיטוכונדרית והפלזמה של תא יונק עם זיהום מינימלי בין השברים.

Protocol

1. הכינו מאגרים וריאגנטים

1. הכינו פתרונות טריים של מעכבי פוספטאז ופרוטאז.
   1. הוסיפו 17.4 מ"ג של פנילמתנסולפוניל פלואוריד (PMSF) ל-1 מ"ל של 100% אתנול כדי להכין ציר של 100 mM.
      הערה: יש ללבוש ציוד מגן בעת טיפול בתסמונת קדם-וסתית, שכן הוא מסוכן בבליעה או בשאיפה ובמגע עם העור או העיניים. זה קורוזיבי לעיניים ולעור.
   2. על פי הוראות היצרן, הכינו קוקטייל מעכב פרוטאז זמין מסחרית (פי 100).
   3. הוסיפו 91.9 מ"ג של נתרן אורתובנאדט (SOV) ל-1 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה כדי להכין ציר של 500 מ"מ.
      הערה: יש ללבוש ציוד מגן בעת טיפול ב-SOV מכיוון שהוא מסוכן במקרה של בליעה, שאיפה או מגע עם העיניים. חשיפת יתר חמורה עלולה לגרום למוות.
2. הכן מאגר תזה A, מאגר בידוד ציטופלסמי (CI), חיץ מסיסות תאים (CS), חיץ תזה גרעינית (NL), חיץ ליזה B , חיץ הומוגניזציה של תאים (CH), מדולל יודיקסנול ודטרגנטים.
   1. הוסיפו 8.7 גרם נתרן כלורי (NaCl) ו-50 מ"ל של חומצה 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES, 1 M, pH 7.4) ל-950 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה כדי להכין חיץ ליזה A (ריכוזים סופיים של 150 mM NaCl ו-50 mM HEPES).
   2. הכן פתרונות מלאי של דטרגנטים באופן הבא: הוסף 0.1 גרם של נתרן דודציל סולפט (SDS) ל -10 מ"ל של חיץ ליזה A (ריכוז סופי של 1% SDS), הוסף 0.1 גרם של נתרן דאוקסיכולאט ל -10 מ"ל של חיץ ליזה A (ריכוז סופי של 1%), הוסף 2.5 מ"ג של digitonin ל -10 מ"ל של חיץ ליזה A (ריכוז סופי של 250 מיקרוגרם / מ"ל), ולהוסיף 1 מ"ל של חומר ניקוי לא יוני, שאינו דנטורינג (ראו טבלת חומרים) ל-9 מ"ל של חיץ ליזה A (ריכוז סופי של 10% (v/v)).
   3. הכן את מאגר CI על ידי הוספת 10 μL של מלאי PMSF (100 mM), 10 μL של מעכב פרוטאז (100x), 2 μL של מלאי SOV (500 mM), ו- 100 μL של digitonin מלאי (250 מיקרוגרם / מ"ל) ל 878 μL של חיץ ליזה A (ריכוזים סופיים של 1 mM PMSF, 1x מעכב פרוטאז, 1 mM SOV, ו 25 מיקרוגרם / מ"ל digitonin). שמור את התמיסה על קרח עד לתוספת לכדור התא.
   4. הכן את מאגר CS על-ידי הוספת 10 μL של מלאי PMSF (100 mM), 10 μL של מעכב פרוטאז (100x), 2 μL של מלאי SOV (500 mM), 100 μL של מלאי דטרגנטים לא יוניים ולא דנטורטיביים (ראה טבלת החומרים) (10%), ו-118 μL של מלאי הקסילן גליקול (8.44 M) ל-760 μL של חיץ ליזיס A (ריכוזים סופיים של 1 mM PMSF, 1x מעכב פרוטאז, 1 mM SOV, 1% לא יוני, דטרגנט לא דנטורינג, ו-1 M הקסילן גליקול). שמור את התמיסה על קרח עד לתוספת לכדור התא.
   5. הכן את מאגר NL על ידי הוספת 10 μL של מלאי PMSF (100 mM), 10 μL של מעכב פרוטאז (100x), 2 μL של מלאי SOV (500 mM), 50 μL של מלאי נתרן deoxycholate (10%), 100 μL של מלאי SDS (1%), ו 118 μL של מלאי הקסילן גליקול (8.44 M) ל 710 μL של חיץ ליזה A (ריכוזים סופיים של 1 mM PMSF, מעכב פרוטאז אחד, 1 mM SOV, 0.5% נתרן דאוקסיכולאט (v/v), 0.1% SDS (w/v) ו-1 M הקסילן גליקול). שמור את התמיסה על הקרח עד לתוספת לכדור גרעיני.
   6. הוסף 20 מ"ל של HEPES (1 M, pH 7.4), 0.74 גרם של אשלגן כלורי (KCl), 0.19 גרם של מגנזיום כלוריד (MgCl 2), 2 מ"ל של חומצה אתילנדיאמינטטראאצטית (0.5 M EDTA),₂ מ"ל של אתילן גליקול-ביס(β-אמינואתיל אתר)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטית (0.5 M EGTA), 38.3 גרם של מניטול, ו 23.9 גרם של סוכרוז ל 980 מ"ל של מים deionized להכנת חיץ ליזה B (ריכוזים סופיים של 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 210 mM מניטול ו-70 mM סוכרוז).
   7. הכן את מאגר CH על-ידי הוספת 10 μL של מלאי PMSF (100 mM) ו- 2 μL של מלאי SOV (500 mM) ל- 988 μL של חיץ ליזה B (ריכוזים סופיים של 1 mM PMSF ו- 1 mM SOV; התאם את הנפח הסופי כך שיתאים למספר התאים הממוקמים). שמור את התמיסה על קרח עד לתוספת לכדור התא.
   8. הכינו יודיקסנול מדולל על ידי תוספת של 12 מ"ל של HEPES (1 M, pH 7.4), 447 מ"ג של KCl, 114 גרם של MgCl 2,_1.2 מ"ל של 0.5 מ"ל של 0.5 מ"ל של 0.5 M EGTA, 21.3 גרם של מניטול, ו 14.4 גרם של סוכרוז ל 88 מ"ל של מים deionized (ריכוזים סופיים של 120 mM HEPES, 60 mM KCl, 12 mM MgCl₂, 6 mM EDTA, 6 mM EGTA, 1200 mM מניטול ו-420 mM סוכרוז).
   9. אחסן מאגרים ב- 4 °C ו- digitonin ב- -20 °C.

2. בידוד חלבון ציטוזולי

הערה: השלבים הבאים יאפשרו צמיחה והרחבה של תאי U937 ולאחר מכן מיצוי של חלבונים ציטוזוליים. בריכוז המשמש, הדיגטונין יחלחל לקרום הפלזמה מבלי להפריע לו, ויאפשר שחרור של חלבונים ציטוזוליים ושמירה על חלבונים תאיים אחרים.

1. תרבית את התאים ב- RPMI 1640 עם 10% סרום בקר עוברי ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO₂. ודא שהתאים גדלים לסך סופי של 6 x 10^{8 תאים} .
   הערה: בפרוטוקול זה, התאים נספרו באמצעות המוציטומטר ומיקרוסקופ סטנדרטיים.
2. צנטריפוגה של תאים בתרבית ב 400 × גרם במשך 10 דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, יש לתלות מחדש את כדור התא בתמיסת מלח אפופית בטמפרטורת החדר (PBS) בריכוז סופי של 4 × 10^{6 תאים} למ"ל, ופיפטה בעדינות לפירוק גושים.
3. צנטריפוגה של מתלה התא ב 400 × גרם במשך 10 דקות כדי לזרוק את התאים. יש להשליך את הסופר-נטנט, ולהשהות את כדור התא במאגר A של ליזיס קר כקרח (מוכן בשלב 1.2.1) בריכוז סופי של 2 × 10⁷ תאים/מ"ל.
4. יש להסיר 7.5 מ"ל מהתאים המרחפים במאגר ליזיס A (3 × 10^{7 תאים} ), ולשמור על קרח לצורך מיצוי חלבון גרעיני (סעיף 6). צנטריפוגה של תרחיף התא ב 4 מעלות צלזיוס, 400 × גרם במשך 10 דקות כדי לזרוק את התאים.
   הערה: בצעו את כל השלבים הבאים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או על קרח, והניחו מראש את כל המאגרים.
5. יש להשליך את הסופר-נטנט, לתלות את כדור התא במאגר CI בריכוז סופי של 2 × 10^{7 תאים} /מ"ל, ולפרק בעדינות גושים. סובב את מתלה התא מקצה לקצה ב-4°C למשך 20 דקות.
6. צנטריפוגה מתלה התא ב 4 מעלות צלזיוס, 400 × גרם במשך 10 דקות, ולהעביר את supernatant לצינור צנטריפוגה נקי. שמור את כדור התא, ואחסן על קרח. צנטריפוגה של הסופר-נאטנט שנאסף בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 18,000 × גרם למשך 20 דקות כדי לזרוק פסולת תאית.
   הערה: שלב צנטריפוגה מהיר זה הוא קריטי למניעת זיהום של החלק הציטוזולי עם חלבונים הקשורים לאברון ולממברנה.
7. השליכו את הכדור לאחר העברת הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה נקי. חזור על שני שלבי הצנטריפוגה בשלב 2.6 עד שלא יתקבל כדור לאחר הצנטריפוגה.
8. לאסוף את supernatant, שהוא חלק cytosolic. לאחסון לטווח קצר (חודש אחד), ודא שהסופרנטנט מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחסון לטווח ארוך (>1 חודש), שלבו את הסופר-נטנט עם מאגר Laemmli אחד המכיל חומר מחזר אחד, מחממים ב-95°C למשך 7 דקות ומאחסנים בטמפרטורה של -20 או -80°C.
9. להשעות את גלולת התא (משלב 2.6) במאגר תזה A בריכוז סופי של 4 × 10^{6 תאים} למ"ל; פיפטה בעדינות לפירוק גושים.

3. הומוגניזציה של תאים

הערה: השלבים הבאים יאפשרו הומוגניזציה מכנית של תאים המטופלים בדיטונין (משלב 2.9), הנחוצה לבידוד שברי החלבון המיטוכונדריאלי והממברנה.

1. צנטריפוגה של תרחיף התא בחיץ ליזה A (מוכן בשלב 2.9), להציל את הכדור, ולהשליך את supernatant כדי להסיר עודפי digitonin ומזהמים ציטוזוליים מן הכדור התא.
   הערה: ניתן לבצע שטיפות חוזרות ונשנות בחיץ ליזה A כדי להסיר מזהמים ציטוזוליים עודפים.
2. השהה את כדור התא במאגר CH קר כקרח (מוכן בשלב 1.2.7) בריכוז סופי של 4 × 10^{6 תאים} למ"ל. לדגור את תרחיף התא על קרח במשך 30 דקות.
3. אם אתם משתמשים בשיטה מבוססת חרוזים לתזה מכנית, הכניסו 30 גרם של חרוזי נירוסטה 3.2 מ"מ שטופים מראש לתוך צינור חצאית של 50 מ"ל, מלאו ב-15 מ"ל של חיץ ליזה B והניחו על קרח לצינון. אם משתמשים בהומוגנייזר Dounce (עם מזיק B מתאים), ממלאים בנפח מתאים של חיץ תזה B, מכניסים את המזיק ומניחים על קרח לצינון.
4. לאחר הדגירה (שלב 3.2), יש להשליך את חיץ הליזיס B מצינורות החרוזים (או Dounce homogenizer), ולהעביר 15 מ"ל מתרחיף התא לצינור החרוזים (או נפח מתאים להומוגנייזר).
5. אם אתה משתמש בשיטה מבוססת חרוזים, הנח את צינורות החרוזים החצאית המכילים את מתלה התא במכשיר הבלנדר, והגדר לפעול במשך 5 דקות במהירות 8. אם משתמשים בהומוגנייזר של Dounce, שמרו אותו על קרח, ובצעו 40 מעברים עם המזיק באמצעות משיכות איטיות ואחידות (או השתמשו בשיטה חלופית של תזה מכנית של תאים כמפורט בפרק הדיון).
   הערה: אם אתה משתמש במכשיר בלנדר שונה מזה המשמש כאן, ייתכן שיהיה צורך לקבוע את המהירות והזמן באופן אמפירי.
6. מעבירים את ההומוגנט לצינור צנטריפוגה נקי, ועושים צנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. להעביר את supernatant לצינור צנטריפוגה נקי ולשמור; להשליך את הכדור.
   הערה: הפרוטוקול עשוי להיות מושהה כאן ואת homogenate מאוחסן ב 4 °C לטווח קצר (24 שעות).

4. פינוי פסולת ובידוד של שברים מיטוכונדריאליים וממברנות גולמיים

הערה: הצעדים הבאים יאפשרו הסרה של פסולת תאית על ידי צנטריפוגה של ההומוגנט במהירויות הולכות וגדלות. זה ואחריו צנטריפוגה דיפרנציאלית לבידוד של שברים מיטוכונדריאליים וממברנה גולמיים.

1. צנטריפוגה הומוגנית (משלב 3.6) ב 500 × גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את הסופר-נטנט לצינור צנטריפוגה נקי, ומשליכים כל כדור.
2. צנטריפוגה של הסופר-נטנט (משלב 4.1) ב-1,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. מעבירים את הסופר-נטנט לצינור צנטריפוגה נקי, ומשליכים כל כדור.
3. צנטריפוגה של הסופר-נטנט (משלב 4.2) ב-2,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. מעבירים את הסופר-נטנט לצינור צנטריפוגה נקי, ומשליכים כל כדור.
4. צנטריפוגה של הסופר-נטנט (משלב 4.3) ב-4,000 × גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. מעבירים את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה נקי, ושומרים את הכדור, שהוא החלק המיטוכונדריאלי הגולמי.
5. צנטריפוגה של הסופר-נטנט (משלב 4.4) ב-18,000 × גרם למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס. להשליך את supernatant, ולשמור את גלולה, שהוא חלק קרום גס.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, ואת דגימות הכדורים מאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס לטווח קצר (24 שעות).

5. טיהור הדרגתי של צפיפות איזופיקנית

הערה: השלבים הבאים משתמשים בצנטריפוגה הדרגתית בצפיפות איזופיקנית כדי לטהר את שברי המיטוכונדריה והממברנה הגולמיים.

1. הכן תמיסת עבודה של 50% (v/v) של יודיקסנול על ידי ערבוב חלק אחד מדולל (מוכן בשלב 1.1.3) ל-5 חלקים יודיקסנול (60% תמיסת מלאי (w/v)). הכן 10%, 15%, 20%, 25%, 30% ותמיסות יודיקסנול (v/v) של 35% על-ידי ערבוב תמיסת עבודה של 50% (v/v) עם מאגר ליזה B בכמויות המתאימות.
2. יש להשעות את הכדוריות הגולמיות במיטוכונדריה ובממברנה (משלבים 4.4 ו-4.5) כל אחת ב-200 μL של חיץ ליזה B. התאם ל-45% יודיקסנול (v/v) על-ידי הוספת 1800 μL של תמיסת יודיקסנול עובדת (50% (v/v)) ל-200 μL של גלולת ההחייאה.
3. צור שיפוע רציף של יודיקסנול באופן הבא (התאם את הנפחים בהתאם לקיבולת של צינור האולטרה-צנטריפוגה): הוסף 1 מ"ל של 15% יודיקסנול (v/v) לתחתית צינור אולטרה-צנטריפוגה של 8 מ"ל, עליון פתוח, בעל דופן דקה, הנח 1 מ"ל של 20% יודיקסנול (v/v) מתחת לשכבה הראשונה (בטכניקת השכבה התחתונה), ולאחר מכן שכבה תחתונה של 1 מ"ל של 25%, 1 מ"ל של 30%, ו-1 מ"ל של 35% יודיקסנול (v/v).
   הערה: בשלב זה צריכים להיווצר 2 מעברי צבע, 1 עבור השבר המיטוכונדריאלי ו-1 עבור שבר הממברנה.
4. בשיפוע אחד, הוסיפו את 2 המ"ל של גלולת המיטוכונדריה הגולמית (תלויה ב-45% יודיקסנול (v/v)) בטכניקת השכבה התחתונה לתחתית הצינור מתחת ל-35% יודיקסנול (v/v). בשיפוע השני, הוסיפו את 2 המ"ל של גלולת הממברנה הגולמית (תלויה ב-45% יודיקסנול (v/v)) בטכניקת השכבה התחתונה לתחתית הצינור מתחת ל-35% יודיקסנול (v/v).
5. הוסף 1 מ"ל של 10% יודיקסנול (v/v) לחלק העליון של כל צינור שיפוע על ידי כיסויו על גבי שכבת 15%. אזנו את הצינורות בטווח של 0.1 גרם זה מזה על ידי תוספת של 10% יודיקסנול (v/v).
6. סובב את צינורות גרדיאנט הצפיפות ב-4 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות ב-100,000 × גרם. הקפד להגדיר האצה והאטה לערכי המינימום עבור האולטרה-צנטריפוגה שבשימוש.
   הערה: בשיפוע המיטוכונדריאלי, יהיה פס גלוי בממשק בין 25% ל-30% יודיקסנול (v/v). זהו החלק המיטוכונדריאלי הטהור. בשיפוע הממברנה, יהיה פס נראה לעין בחלק של 15% יודיקסנול (v/v). זהו חלק הממברנה הטהור. ייתכנו פסים נוספים בשברים של 25% ו-30% יודיקסנול (v/v) בשיפוע הממברנה. זהו זיהום מיטוכונדריאלי.
7. לאסוף שברים מהחלק העליון של הצינור ב 1 מ"ל aliquots, להיות זהיר כדי למזער את נפח השבר המכיל את הפסים גלויים ולשנות את קצה פיפטה לאחר כל שכבה נאסף. לחלופין, נקבו את דופן הצינור בעל הדופן הדקה עם מחט, ואספו את הרצועות הנראות לעין.
8. אחסן את הדגימות כמתואר בשלב 2.8 עד לאימות על ידי בדיקת חלבון וכתם מערבי.

6. בידוד חלבון גרעיני

הערה: באמצעות דטרגנטים יוניים ולא יוניים, כמו גם טכניקות כגון סוניקציה וצנטריפוגה, השלבים הבאים יסיסו את כל קרומי התאים ויאפשרו בידוד של חלבונים גרעיניים.

1. צנטריפוגה של 7.5 מ"ל aliquot של תאים התלויים במאגר ליזה A (משלב 2.4), ולהשליך את supernatant. הוסף 800 μL של חיץ CS קר כקרח (מוכן בשלב 1.2.4), והשהה את הכדור על ידי פיפטינג ומערבולות. דגירה של הדגימות על קרח (או ב-4 מעלות צלזיוס) למשך 30 דקות כדי לשבש את קרומי הפלזמה והאברונים תוך הגנה על החלבונים הגרעיניים.
2. צנטריפוגה מתלה התא ב 7,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, ולהשליך את supernatant. הוסף 800 μL של חיץ NL קר כקרח (מוכן בשלב 1.2.5) לכדור הגרעיני לאחר הכללת 1U/μL benzonase. יש לתלות את הכדור על ידי פיפטציה עדינה. דגירה על סיבוב מקצה לקצה במשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לשבש את קרום הגרעין.
3. סוניקט במשך 5 שניות בעוצמה של 20% עם צינורות דגימה מקוררים באמבט קרח (3x, עם 5 שניות הפסקות בין פולסים), אשר יחד עם בנזונאז (נוסף בשלב 6.2), יגזור את חומצות הגרעין.
4. צנטריפוגה סוניקט ב 7,800 × גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאסוף ולשמור את supernatant, שהוא החלק הגרעיני. הקפידו לא להפריע לכדור הבלתי מסיס בזמן איסוף הסופרנטנט. לאחסון, ניתן להכין דגימות כמתואר בשלב 2.8.

7. כימות חלבונים וניתוח כתמים מערביים

הערה: השלבים הבאים יכמתו את סך החלבון בכל שבר ויאשרו את טוהר השברים התת-תאיים.

1. בצע בדיקת ברדפורד סטנדרטית כדי לכמת את סך החלבון בכל שבר. עיין בטבלה 1 לקבלת תפוקות החלבון הצפויות.
   הערה: מבחני חלבון אחרים כגון בדיקת חומצה ביסינצ'ונית (BCA) או ספיגה ב-280 ננומטר עשויים לשמש למדידת סך החלבון במקום מבחן ברדפורד.
2. ערבבו שברים עם מאגר Laemmli אחד המכיל חומר מחזר אחד, וחממו ב-95°C למשך 7 דקות. טען 10 מיקרוגרם מכל שבר לתוך ג'ל אלקטרופורזה סטנדרטי של ג'ל SDS-פוליאקרילאמיד (PAGE), והפעל את הג'ל במהירות של 20 mA למשך שעה אחת.
3. העבירו את החלבונים שנפתרו לממברנה פוליווינילדידיפלואוריד (PVDF) על ידי ביצוע העברה אימונובלוטית סטנדרטית ב-100 וולט למשך 30 דקות. יש לחסום את קרום ה-PVDF עם 5% חלב ב-1x תמיסת מלח (TBS) המכילה 0.1% של חומר ניקוי לא יוני (v/v) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
4. הוסיפו את הנוגדנים הראשוניים המתאימים כדי לזהות חלבוני משק בית ספציפיים לכל חלק תת-תאי, ודגרו במשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שטפו את הממברנה עם 5% חלב ב-1x TBS המכיל 0.1% מחומר הניקוי הלא יוני (v/v) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: עבור פרוטוקול זה, נוגדנים נגד גליצרלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH, 1:10000), היסטון H3 (1:2000), תעלת אניון תלוית מתח (VDAC, 1:1000) ו- Na,K⁺-ATPase שימשו לשברים ציטוזוליים, גרעיניים, מיטוכונדריאליים וממברנות, בהתאמה.
5. מוסיפים את הנוגדנים המשניים המצומדים של חזרת פרוקסידאז (HRP) לממברנה (מדללים בהתאם להוראות היצרן), ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה. שטפו את הממברנה עם 5% חלב ב-1x TBS המכיל 0.1% מחומר הניקוי הלא יוני (v/v) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לפתח את הכתם באמצעות chemiluminescence סטנדרטי.

תוצאות

תרשים זרימה סכמטי של הליך זה (איור 1) מסכם באופן חזותי את הצעדים שננקטו כדי לפרק בהצלחה U937^{5 תאים} שגודלו בתרחיף. שברים שנאספו מראש שיפוע הצפיפות האיזופיקנית בנפחים שווים (1 מ"ל) מראים את הטיהור של שברי המיטוכונדריה והממברנה (איור 2). שימוש בנוגדן נג?...

Discussion

שיטה זו היא גרסה שונה של גישה שפורסמה בעבר לפיצול תת-תאי ללא שימוש בצנטריפוגה^{במהירות גבוהה 11}. שיטה שונה זו דורשת ציוד מיוחד יותר כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר, אך היא מקיפה יותר וניתנת לשחזור באופן עקבי.

פיתוח הפרוטוקול הראשוני היה הכרחי בשל חוסר יכולת להפר?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	61-BB50-DX
digitonin	Sigma	D141
end-over-end rotator	ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma	E3889
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118
HEPES	VWR	97064-360
Hexylene glycol	Sigma	68340
Igepal	Sigma	I7771	Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl	Sigma	P9333
Mannitol	Sigma	M9647
MgCl2	Sigma	M8266
NaCl	Sigma	S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm	Seton Scientific	7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium	Sigma	D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML
refrigerated centrifuge	ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor	Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	436143
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma	567540
sonicator	ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge	ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm	Next Advance	SSB32
Sucrose	Sigma	S0389
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	97062-370
Tween 20			non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661