Fraccionamiento celular de células U937 por purificación de gradiente de densidad isopícnica

Resumen

Este protocolo de fraccionamiento permitirá a los investigadores aislar proteínas citoplasmáticas, nucleares, mitocondriales y de membrana de células de mamíferos. Las dos últimas fracciones subcelulares se purifican aún más a través del gradiente de densidad isopícnica.

Resumen

Este protocolo describe un método para obtener fracciones de proteínas subcelulares de células de mamíferos utilizando una combinación de detergentes, lisis mecánica y centrifugación de gradiente de densidad isopícnica. La principal ventaja de este procedimiento es que no se basa únicamente en el uso de detergentes solubilizantes para obtener fracciones subcelulares. Esto hace posible separar la membrana plasmática de otros orgánulos unidos a la membrana de la célula. Este procedimiento facilitará la determinación de la localización de proteínas en las células con un método reproducible, escalable y selectivo. Este método se ha utilizado con éxito para aislar proteínas citosólicas, nucleares, mitocondriales y de membrana plasmática de la línea celular de monocitos humanos, U937. Aunque optimizado para esta línea celular, este procedimiento puede servir como un punto de partida adecuado para el fraccionamiento subcelular de otras líneas celulares. Se discuten las posibles dificultades del procedimiento y cómo evitarlas, al igual que las alteraciones que pueden necesitar ser consideradas para otras líneas celulares.

Introducción

El fraccionamiento subcelular es un procedimiento en el que las células se lisan y se separan en sus componentes constituyentes a través de varios métodos. Esta técnica puede ser utilizada por los investigadores para determinar la localización de proteínas en células de mamíferos o para el enriquecimiento de proteínas de baja abundancia que de otro modo serían indetectables. Si bien actualmente existen métodos para el fraccionamiento subcelular, al igual que los kits comerciales que se pueden comprar, sufren de varias limitaciones que este procedimiento intenta superar. La mayoría de los métodos de fraccionamiento celular son exclusivamente a base de detergente^1,2, basándose en el uso de tampones que contienen cantidades crecientes de detergente para solubilizar diferentes componentes celulares. Si bien este método es rápido y conveniente, da como resultado fracciones impuras. Estos están diseñados para permitir a los investigadores aislar fácilmente uno o dos componentes de la célula, pero no son lo suficientemente complejos como para aislar múltiples fracciones subcelulares de una muestra al mismo tiempo. Depender únicamente de detergentes generalmente da como resultado orgánulos encerrados en la membrana y la membrana plasmática se solubiliza indiscriminadamente, lo que dificulta la separación de estos componentes. Una complicación adicional del uso de estos kits es la incapacidad de los investigadores para alterarlos / optimizarlos para aplicaciones específicas, ya que la mayoría de los componentes son formulaciones patentadas. Finalmente, estos kits pueden ser prohibitivamente caros, con limitaciones en el número de usos que los hacen menos que ideales para muestras más grandes.

A pesar de la disponibilidad de kits para el aislamiento de mitocondrias que no dependen de detergentes, no están diseñados para aislar la membrana plasmática y producir cantidades significativamente menores de muestra que los protocolos de aislamiento estándar ^3,4. Si bien los métodos de centrifugación diferencial requieren más tiempo, a menudo dan lugar a distintas fracciones que no se pueden obtener con kits exclusivamente a base de detergente¹. La separación sin el uso exclusivo de detergentes solubilizantes también permite una purificación adicional mediante ultracentrifugación y gradientes de densidad isopícnica, lo que resulta en una menor contaminación cruzada. Este protocolo de fraccionamiento demuestra el aislamiento de fracciones subcelulares de monocitos U937 utilizando una combinación de detergente y enfoques basados en centrifugación de alta velocidad. Este método facilitará el aislamiento de los componentes nucleares, citoplasmáticos, mitocondriales y de membrana plasmática de una célula de mamífero con una contaminación mínima entre las fracciones.

Protocolo

1. Preparar tampones y reactivos

1. Prepare soluciones frescas de inhibidores de la fosfatasa y la proteasa.
   1. Agregue 17.4 mg de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) a 1 ml de etanol al 100% para preparar un stock de 100 mM.
      NOTA: Use equipo de protección cuando manipule PMSF, ya que es peligroso cuando se ingiere o inhala y al entrar en contacto con la piel o los ojos. Es corrosivo para los ojos y la piel.
   2. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, prepare un cóctel de inhibidores de la proteasa disponible comercialmente (100x).
   3. Agregue 91.9 mg de ortovanadato de sodio (SOV) a 1 ml de agua desionizada para preparar un stock de 500 mM.
      NOTA: Use equipo de protección cuando manipule SOV, ya que es peligroso si se ingiere, inhala o al contacto con los ojos. La sobreexposición severa puede resultar en la muerte.
2. Prepare el tampón de lisis A, el tampón de aislamiento citoplasmático (CI), el tampón de solubilización celular (CS), el tampón de lisis nuclear (NL), el tampón B de lisis, el tampón de homogeneización celular (CH), el diluyente de iodixanol y los detergentes.
   1. Añadir 8,7 g de cloruro de sodio (NaCl) y 50 ml de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES, 1 M, pH 7,4) a 950 ml de agua desionizada para preparar el tampón de lisis A (concentraciones finales de 150 mM NaCl y 50 mM HEPES).
   2. Preparar soluciones madre de detergentes de la siguiente manera: añadir 0,1 g de dodecil sulfato de sodio (SDS) a 10 ml de tampón de lisis A (concentración final de 1% SDS), añadir 0,1 g de desoxicolato de sodio a 10 ml de tampón de lisis A (concentración final del 1%), añadir 2,5 mg de digitonina a 10 ml de tampón de lisis A (concentración final de 250 μg/ml), y añadir 1 ml de detergente no iónico y no desnaturalizante (véase la Tabla de materiales) a 9 ml de tampón de lisis A (concentración final del 10% (v/v)).
   3. Prepare el tampón IC agregando 10 μL de stock de PMSF (100 mM), 10 μL de inhibidor de proteasa (100x), 2 μL de stock de SOV (500 mM) y 100 μL de digitonina madre (250 μg/mL) a 878 μL de tampón de lisis A (concentraciones finales de 1 mM PMSF, 1x inhibidor de proteasa, 1 mM SOV y 25 μg/ml de digitonina). Mantenga la solución en hielo hasta que se agregue al pellet celular.
   4. Preparar el tampón CS añadiendo 10 μL de material de PMSF (100 mM), 10 μL de inhibidor de la proteasa (100x), 2 μL de stock de SOV (500 mM), 100 μL de material de detergente no iónico y no desnaturalizante (véase la Tabla de materiales) (10%) y 118 μL de stock de hexilenglicol (8,44 M) a 760 μL de tampón de lisis A (concentraciones finales de 1 mM PMSF, 1x inhibidor de la proteasa, 1 mM SOV, 1% no iónico, detergente no desnaturalizante y 1 M hexylene glycol). Mantenga la solución en hielo hasta que se agregue al pellet celular.
   5. Preparar el tampón NL añadiendo 10 μL de stock de PMSF (100 mM), 10 μL de inhibidor de la proteasa (100x), 2 μL de stock de SOV (500 mM), 50 μL de stock de desoxicolato de sodio (10%), 100 μL de stock de SDS (1%) y 118 μL de stock de hexylene glycol (8,44 M) a 710 μL de tampón de lisis A (concentraciones finales de 1 mM PMSF, 1x inhibidor de la proteasa, 1 mM SOV, 0,5% de desoxicolato de sodio (v/v), 0,1% de SDS (p/v) y 1 M de hexilenglicol). Mantenga la solución en hielo hasta que se agregue al pellet nuclear.
   6. Añadir 20 ml de HEPES (1 M, pH 7,4), 0,74 g de cloruro de potasio (KCl), 0,19 g de cloruro de magnesio (MgCl 2), 2 ml de ácido etilendiaminotetraacético (0,5 M EDTA),₂ ml de etilenglicol-bis(β-aminoetil éter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético (0,5 M EGTA), 38,3 g de manitol y 23,9 g de sacarosa a 980 ml de agua desionizada para preparar tampón de lisis B (concentraciones finales de 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 210 mM manitol y 70 mM sacarosa).
   7. Preparar el tampón CH añadiendo 10 μL de material PMSF (100 mM) y 2 μL de stock SOV (500 mM) a 988 μL de tampón de lisis B (concentraciones finales de 1 mM PMSF y 1 mM SOV; ajuste el volumen final para acomodar el número de células que se están lisando). Mantenga la solución en hielo hasta que se agregue al pellet celular.
   8. Preparar el diluyente de iodixanol mediante la adición de 12 ml de HEPES (1 M, pH 7.4), 447 mg de KCl, 114 g de MgCl 2, 1.2 mL de 0.5 M EDTA,_1.2 mL de 0.5 M EGTA, 21.3 g de manitol y 14.4 g de sacarosa a 88 mL de agua desionizada (concentraciones finales de 120 mM HEPES, 60 mM KCl, 12 mM MgCl₂, 6 mM EDTA, 6 mM EGTA, 1200 mM manitol y 420 mM sacarosa).
   9. Almacenar tampones a 4 °C y digitonina a -20 °C.

2. Aislamiento de proteínas citosólicas

NOTA: Los siguientes pasos permitirán el crecimiento y la expansión de las células U937 seguido de la extracción de proteínas citosólicas. A la concentración utilizada, la digitonina permeabilizará la membrana plasmática sin interrumpirla, permitiendo la liberación de proteínas citosólicas y la retención de otras proteínas celulares.

1. Cultivar las células en RPMI 1640 con 10% de suero fetal bovino a 37 °C y 5% de_CO2. Asegúrese de que las células crezcan hasta un total final de 6 x 10⁸ células.
   NOTA: En este protocolo, las células se contaron utilizando un hemocitómetro estándar y un microscopio.
2. Centrifugar las células cultivadas a 400 × g durante 10 min. Después de desechar el sobrenadante, resuspender el pellet celular en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a temperatura ambiente a una concentración final de 4 × 10⁶ células/ml, y pipetear suavemente para romper los grumos.
3. Centrifugar la suspensión celular a 400 × g durante 10 min para granular las células. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en el tampón de lisis A helado (preparado en el paso 1.2.1) a una concentración final de 2 × 10⁷ células/ml.
4. Extraer 7,5 ml de las células suspendidas en el tampón de lisis A (3 × 10⁷ células) y mantener en hielo para la extracción de proteínas nucleares (sección 6). Centrifugar la suspensión celular a 4 °C, 400 × g durante 10 min para granular las células.
   NOTA: Realice todos los pasos posteriores a 4 °C o en hielo, y preenfríe todos los tampones.
5. Deseche el sobrenadante, resuspenda el pellet celular en tampón CI a una concentración final de 2 × 10⁷ células/ml y pipetear suavemente para romper los grumos. Gire la suspensión celular de extremo a extremo a 4 °C durante 20 min.
6. Centrifugar la suspensión celular a 4 °C, 400 × g durante 10 min, y transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio. Guarde la bolita celular y guárdela en hielo. Centrifugar el sobrenadante recogido a 4 °C, 18.000 × g durante 20 min para granular los restos celulares.
   NOTA: Este paso de centrifugación de alta velocidad es crítico para prevenir la contaminación de la fracción citosólica con orgánulos y proteínas unidas a la membrana.
7. Deseche el pellet después de transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio. Repita ambos pasos de centrifugación en el paso 2.6 hasta que no se obtenga ningún pellet después de la centrifugación.
8. Recoge el sobrenadante, que es la fracción citosólica. Para el almacenamiento a corto plazo (1 mes), asegúrese de que el sobrenadante se conserva a 4 °C. Para el almacenamiento a largo plazo (>1 mes), combine el sobrenadante con 1x tampón Laemmli que contenga 1x agente reductor, caliente a 95 °C durante 7 min y guárdelo a -20 o -80 °C.
9. Resuspender el pellet celular (a partir de la etapa 2.6) en el tampón de lisis A a una concentración final de 4 × 10⁶ células/ml; pipeta suavemente para romper los grumos.

3. Homogeneización celular

NOTA: Los siguientes pasos permitirán la homogeneización mecánica de las células tratadas con digitonina (a partir del paso 2.9), que es necesaria para el aislamiento de las fracciones de proteínas mitocondriales y de membrana.

1. Centrifugar la suspensión celular en el tampón de lisis A (preparado en el paso 2.9), guardar el pellet y desechar el sobrenadante para eliminar el exceso de digitonina y contaminantes citosólicos del pellet celular.
   NOTA: Se pueden realizar lavados repetidos en el tampón de lisis A para eliminar el exceso de contaminantes citosólicos.
2. Resuspender el pellet celular en tampón CH helado (preparado en la etapa 1.2.7) a una concentración final de 4 × 10⁶ células/ml. Incubar la suspensión celular en hielo durante 30 min.
3. Si utiliza un método basado en cuentas para la lisis mecánica, coloque 30 g de perlas de acero inoxidable de 3,2 mm prelavadas en un tubo con faldón de 50 ml, llene con 15 ml de tampón B de lisis y colóquelas en hielo para enfriar. Si usa un homogeneizador Dounce (con un mortero B ajustado), llene con un volumen apropiado de tampón B de lisis, inserte el mortero y colóquelo en hielo para enfriar.
4. Después de la incubación (paso 3.2), deseche el tampón de lisis B de los tubos de perlas (o homogeneizador Dounce) y transfiera 15 ml de la suspensión celular al tubo de perlas (o un volumen apropiado al homogeneizador).
5. Si utiliza el método basado en cuentas, coloque los tubos de perlas con faldón que contienen la suspensión celular en el dispositivo de licuadora y configúrelos para que funcionen durante 5 minutos a una velocidad de 8. Si usa un homogeneizador Dounce, manténgalo en hielo y realice 40 pasadas con el mortero usando movimientos lentos y uniformes (o utilice un método alternativo de lisis celular mecánica como se detalla en la sección de discusión).
   NOTA: Si se utiliza un dispositivo mezclador diferente del utilizado aquí, es posible que la velocidad y el tiempo deban determinarse empíricamente.
6. Transfiera el homogeneizado a un tubo de centrífuga limpio y centrifugarlo a 400 × g durante 10 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio y guárdelo; Deseche el pellet.
   NOTA: El protocolo puede pausarse aquí y el homogeneizado almacenarse a 4 °C a corto plazo (24 h).

4. Remoción de escombros y aislamiento de fracciones mitocondriales y de membrana crudas

NOTA: Los siguientes pasos permitirán la eliminación de restos celulares mediante la centrifugación del homogeneizado a velocidades crecientes. Esto es seguido por la centrifugación diferencial para el aislamiento de fracciones mitocondriales y de membrana crudas.

1. Centrifugar el homogeneizado (a partir del paso 3.6) a 500 × g durante 10 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio y deseche cualquier pellet.
2. Centrifugar el sobrenadante (a partir del paso 4.1) a 1.000 × g durante 10 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio y deseche cualquier pellet.
3. Centrifugar el sobrenadante (a partir del paso 4.2) a 2.000 × g durante 10 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio y deseche cualquier pellet.
4. Centrifugar el sobrenadante (a partir del paso 4.3) a 4.000 × g durante 20 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio y guarde el pellet, que es la fracción mitocondrial cruda.
5. Centrifugar el sobrenadante (a partir del paso 4.4) a 18.000 × g durante 1 h a 4 °C. Deseche el sobrenadante y guarde el pellet, que es la fracción de membrana cruda.
   NOTA: El protocolo puede estar en pausa aquí, y las muestras peletizadas almacenadas a 4 °C a corto plazo (24 h).

5. Purificación del gradiente de densidad isopícnica

NOTA: Los siguientes pasos utilizan centrifugación por gradiente de densidad isopícnica para purificar las fracciones mitocondriales y de membrana crudas.

1. Preparar una solución de trabajo al 50% (v/v) de iodixanol mezclando 1 parte de diluyente (preparado en la etapa 1.1.3) con 5 partes de iodixanol (solución madre al 60% (p/v)). Prepare soluciones de iodixanol al 10%, 15%, 20%, 25%, 30% y 35% (v/v) mezclando la solución de trabajo al 50% (v/v) con el tampón B de lisis en cantidades apropiadas.
2. Resuspender los gránulos mitocondriales y de membrana crudos (de los pasos 4.4 y 4.5) cada uno en 200 μL de tampón de lisis B. Ajustar al 45% de iodixanol (v/v) añadiendo 1800 μL de solución de iodixanol de trabajo (50% (v/v)) a 200 μL del pellet resuspendido.
3. Cree un gradiente discontinuo de iodixanol de la siguiente manera (ajuste los volúmenes según corresponda para la capacidad del tubo de ultracentrífuga): Agregue 1 ml de iodixanol (v/v) al 15% en la parte inferior de un tubo de ultracentrífuga de pared delgada de 8 ml, abierto y de pared delgada, coloque 1 ml de iodixanol al 20% (v / v) debajo de la primera capa (mediante la técnica subyacente), seguido de 1 ml subyacente de 25 %, 1 ml de 30% y 1 ml de iodixanol al 35% (v/v).
   NOTA: Debe haber 2 gradientes creados en este paso, 1 para la fracción mitocondrial y 1 para la fracción de membrana.
4. En 1 gradiente, agregue los 2 ml del pellet mitocondrial crudo (suspendido en 45% de iodixanol (v / v)) utilizando la técnica de capa subyacente al fondo del tubo debajo del 35% de iodixanol (v / v). En el otro gradiente, agregue los 2 ml del pellet de membrana cruda (suspendido en 45% de iodixanol (v / v)) utilizando la técnica de capa inferior al fondo del tubo debajo del 35% de iodixanol (v / v).
5. Agregue 1 ml de yododinanol al 10% (v/v) a la parte superior de cada tubo de gradiente superponiéndolo sobre la capa del 15%. Equilibrar los tubos dentro de 0,1 g entre sí mediante la adición de 10% de iodixanol (v / v).
6. Girar los tubos de gradiente de densidad a 4 °C durante 18 h a 100.000 × g. Asegúrese de ajustar la aceleración y la desaceleración a los valores mínimos para la ultracentrífuga que se está utilizando.
   NOTA: En el gradiente mitocondrial, habrá una banda visible en la interfaz entre 25% y 30% de iodixanol (v/v). Esta es la fracción mitocondrial pura. En el gradiente de membrana, habrá una banda visible en la fracción de iodixanol (v/v) al 15%. Esta es la fracción de membrana pura. Puede haber bandas adicionales en las fracciones de yododinanol (v/v) del 25% y 30% en el gradiente de membrana. Esto es contaminación mitocondrial.
7. Recoger fracciones de la parte superior del tubo en alícuotas de 1 ml, teniendo cuidado de minimizar el volumen de la fracción que contiene las bandas visibles y cambiando la punta de la pipeta después de recoger cada capa. Alternativamente, perfore el lado del tubo de paredes delgadas con una aguja y recoja las bandas visibles.
8. Conservar las muestras como se describe en el paso 2.8 hasta su verificación mediante ensayo de proteínas y Western blot.

6. Aislamiento de proteínas nucleares

NOTA: Utilizando detergentes iónicos y no iónicos, así como técnicas como la sonicación y la centrifugación, los siguientes pasos solubilizarán todas las membranas celulares y permitirán el aislamiento de proteínas nucleares.

1. Centrifugar la alícuota de 7,5 ml de células suspendidas en el tampón de lisis A (a partir del paso 2.4) y desechar el sobrenadante. Añadir 800 μL de tampón CS helado (preparado en el paso 1.2.4) y resuspender el pellet mediante pipeteo y vórtice. Incubar las muestras en hielo (o a 4 °C) durante 30 minutos para interrumpir las membranas plasmáticas y de orgánulos mientras se protegen las proteínas nucleares.
2. Centrifugar la suspensión celular a 7.000 × g durante 10 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. Añadir 800 μL de tampón NL helado (preparado en la etapa 1.2.5) al pellet nuclear después de la inclusión de 1U/μL de benzonasa. Vuelva a suspender el pellet pipeteando suavemente. Incubar en un rotador de extremo a extremo durante 30 min a 4 °C para interrumpir la membrana nuclear.
3. Sonicate durante 5 s al 20% de potencia con tubos de muestra enfriados en un baño de hielo (3x, con 5 s de pausas entre pulsos), que junto con la benzonasa (añadida en el paso 6.2), cortará los ácidos nucleicos.
4. Centrifugar el sonicado a 7.800 × g durante 10 min a 4 °C. Recoge y guarda el sobrenadante, que es la fracción nuclear. Asegúrese de no perturbar el pellet insoluble mientras recoge el sobrenadante. Para el almacenamiento, las muestras se pueden preparar como se describe en el paso 2.8.

7. Cuantificación de proteínas y análisis de Western blot

NOTA: Los siguientes pasos cuantificarán la proteína total en cada fracción y confirmarán la pureza de las fracciones subcelulares.

1. Realice un ensayo estándar de Bradford para cuantificar la proteína total en cada fracción. Consulte la Tabla 1 para conocer los rendimientos de proteínas esperados.
   NOTA: Se pueden usar otros ensayos de proteínas como el ensayo de ácido bicinchonínico (BCA) o la absorbancia a 280 nm para medir la proteína total en lugar de un ensayo de Bradford.
2. Combinar fracciones con 1x tampón Laemmli que contenga 1x agente reductor, y calentar a 95 °C durante 7 min. Cargue 10 μg de cada fracción en un gel estándar de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y ejecute el gel a 20 mA durante 1 h.
3. Transfiera las proteínas resueltas a una membrana de polivinildifluoruro (PVDF) realizando una transferencia de inmunotransferencia estándar a 100 V durante 30 min. Bloquear la membrana de PVDF con leche al 5% en 1x solución salina tamponada con Tris (TBS) que contiene 0,1% de un detergente no iónico (v/v) durante 30 min a temperatura ambiente.
4. Añadir los anticuerpos primarios apropiados para detectar proteínas de mantenimiento específicas para cada fracción subcelular, e incubar durante la noche a 4 °C. Lavar la membrana con leche al 5% en 1x TBS que contengan 0,1% del detergente no iónico (v/v) durante 10 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Para este protocolo, se utilizaron anticuerpos contra gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH, 1:10000), histona H3 (1:2000), canal aniónico dependiente de voltaje (VDAC, 1:1000) y Na,K⁺-ATPasa para fracciones citosólicas, nucleares, mitocondriales y de membrana, respectivamente.
5. Agregue los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) apropiados a la membrana (diluir de acuerdo con las instrucciones del fabricante) e incubar a temperatura ambiente durante 1 h. Lavar la membrana con leche al 5% en 1x TBS que contengan 0,1% del detergente no iónico (v/v) durante 10 min a temperatura ambiente. Desarrolle el blot utilizando quimioluminiscencia estándar.

Resultados

Un diagrama de flujo esquemático de este procedimiento (Figura 1) resume visualmente los pasos que se tomaron para fraccionar con éxito las células U937⁵ cultivadas en suspensión. Las fracciones recogidas de la parte superior del gradiente de densidad isopícnica en volúmenes iguales (1 mL) muestran la purificación de las fracciones mitocondrial y de membrana (Figura 2). La utilización de un anticuerpo contra VDAC, una proteína lo...

Discusión

Este método es una versión modificada de un enfoque previamente publicado para el fraccionamiento subcelular sin el uso de centrifugación de alta velocidad¹¹. Este método modificado requiere un equipo más especializado para lograr los mejores resultados, pero es más completo y consistentemente reproducible.

El desarrollo del protocolo inicial fue necesario debido a la incapacidad de separar muestras mitocondriales y de membrana para el análisis de la localizació...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	61-BB50-DX
digitonin	Sigma	D141
end-over-end rotator	ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma	E3889
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118
HEPES	VWR	97064-360
Hexylene glycol	Sigma	68340
Igepal	Sigma	I7771	Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl	Sigma	P9333
Mannitol	Sigma	M9647
MgCl2	Sigma	M8266
NaCl	Sigma	S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm	Seton Scientific	7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium	Sigma	D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML
refrigerated centrifuge	ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor	Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	436143
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma	567540
sonicator	ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge	ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm	Next Advance	SSB32
Sucrose	Sigma	S0389
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	97062-370
Tween 20			non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661