Fraccionamiento celular de células U937 por purificación de gradiente de densidad isopícnica

Resumen

Este protocolo de fraccionamiento permitirá a los investigadores aislar proteínas citoplasmáticas, nucleares, mitocondriales y de membrana de células de mamíferos. Las dos últimas fracciones subcelulares se purifican aún más a través del gradiente de densidad isopícnica.

Resumen

Este protocolo describe un método para obtener fracciones de proteínas subcelulares de células de mamíferos utilizando una combinación de detergentes, lisis mecánica y centrifugación de gradiente de densidad isopícnica. La principal ventaja de este procedimiento es que no se basa únicamente en el uso de detergentes solubilizantes para obtener fracciones subcelulares. Esto hace posible separar la membrana plasmática de otros orgánulos unidos a la membrana de la célula. Este procedimiento facilitará la determinación de la localización de proteínas en las células con un método reproducible, escalable y selectivo. Este método se ha utilizado con éxito para aislar proteínas citosólicas, nucleares, mitocondriales y de membrana plasmática de la línea celular de monocitos humanos, U937. Aunque optimizado para esta línea celular, este procedimiento puede servir como un punto de partida adecuado para el fraccionamiento subcelular de otras líneas celulares. Se discuten las posibles dificultades del procedimiento y cómo evitarlas, al igual que las alteraciones que pueden necesitar ser consideradas para otras líneas celulares.

Introducción

El fraccionamiento subcelular es un procedimiento en el que las células se lisan y se separan en sus componentes constituyentes a través de varios métodos. Esta técnica puede ser utilizada por los investigadores para determinar la localización de proteínas en células de mamíferos o para el enriquecimiento de proteínas de baja abundancia que de otro modo serían indetectables. Si bien actualmente existen métodos para el fraccionamiento subcelular, al igual que los kits comerciales que se pueden comprar, sufren de varias limitaciones que este procedimiento intenta superar. La mayoría de los métodos de fraccionamiento celular son exclusivamente a base de detergente

Protocolo

1. Preparar tampones y reactivos

1. Prepare soluciones frescas de inhibidores de la fosfatasa y la proteasa.
   1. Agregue 17.4 mg de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) a 1 ml de etanol al 100% para preparar un stock de 100 mM.
      NOTA: Use equipo de protección cuando manipule PMSF, ya que es peligroso cuando se ingiere o inhala y al entrar en contacto con la piel o los ojos. Es corrosivo para los ojos y la piel.
   2. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, prepare un cóctel de inhibidores de la proteasa disponible comercialmente (100x).
   3. Agregue 91.9 mg de ortovanadato de sodio (SOV) a 1 ml de agua desionizada para preparar un st....

Resultados

Un diagrama de flujo esquemático de este procedimiento (Figura 1) resume visualmente los pasos que se tomaron para fraccionar con éxito las células U937⁵ cultivadas en suspensión. Las fracciones recogidas de la parte superior del gradiente de densidad isopícnica en volúmenes iguales (1 mL) muestran la purificación de las fracciones mitocondrial y de membrana (Figura 2). La utilización de un anticuerpo contra VDAC, una proteína lo.......

Discusión

Este método es una versión modificada de un enfoque previamente publicado para el fraccionamiento subcelular sin el uso de centrifugación de alta velocidad¹¹. Este método modificado requiere un equipo más especializado para lograr los mejores resultados, pero es más completo y consistentemente reproducible.

El desarrollo del protocolo inicial fue necesario debido a la incapacidad de separar muestras mitocondriales y de membrana para el análisis de la localizació.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	61-BB50-DX
digitonin	Sigma	D141
end-over-end rotator	ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma	E3889
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118
HEPES	VWR	97064-360
Hexylene glycol	Sigma	68340
Igepal	Sigma	I7771	Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl	Sigma	P9333
Mannitol	Sigma	M9647
MgCl2	Sigma	M8266
NaCl	Sigma	S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm	Seton Scientific	7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium	Sigma	D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML
refrigerated centrifuge	ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor	Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	436143
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma	567540
sonicator	ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge	ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm	Next Advance	SSB32
Sucrose	Sigma	S0389
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	97062-370
Tween 20			non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661