Фракционирование клеток U937 методом изопикновой очистки градиента плотности

Резюме

Этот протокол фракционирования позволит исследователям выделить цитоплазматические, ядерные, митохондриальные и мембранные белки из клеток млекопитающих. Последние две субклеточные фракции дополнительно очищаются с помощью изопикнового градиента плотности.

Аннотация

Этот протокол описывает способ получения субклеточных белковых фракций из клеток млекопитающих с использованием комбинации детергентов, механического лизиса и центрифугирования градиента изопикновой плотности. Основным преимуществом этой процедуры является то, что она не полагается на исключительное использование солюбилизирующих моющих средств для получения субклеточных фракций. Это дает возможность отделить плазматическую мембрану от других мембранно-связанных органелл клетки. Эта процедура облегчит определение локализации белка в клетках воспроизводимым, масштабируемым и селективным методом. Этот метод был успешно использован для выделения цитозольных, ядерных, митохондриальных и плазматических мембранных белков из клеточной линии моноцитов человека U937. Хотя эта процедура оптимизирована для этой клеточной линии, она может служить подходящей отправной точкой для субклеточного фракционирования других клеточных линий. Обсуждаются потенциальные подводные камни процедуры и способы их избежания, а также изменения, которые, возможно, потребуется рассмотреть для других клеточных линий.

Введение

Субклеточное фракционирование представляет собой процедуру, при которой клетки лизируются и разделяются на составляющие их компоненты с помощью нескольких методов. Этот метод может быть использован исследователями для определения локализации белка в клетках млекопитающих или для обогащения белков с низким содержанием, которые в противном случае не были бы обнаружены. Хотя методы субклеточного фракционирования в настоящее время существуют, как и коммерческие наборы, которые можно приобрести, они страдают от нескольких ограничений, которые эта процедура пытается преодолеть. Большинство методов фракционирования клеток основаны исключительно на моющих средствах ^1,2, основанных на использовании буферов, содержащих все большее количество моющего средства для солюбилизации различных клеточных компонентов. Хотя этот метод быстрый и удобный, он приводит к нечистым фракциям. Они предназначены для того, чтобы позволить исследователям легко выделить один или два компонента клетки, но недостаточно сложны, чтобы выделить несколько субклеточных фракций из образца одновременно. Опора исключительно на моющие средства обычно приводит к тому, что мембранно-закрытые органеллы и плазматическая мембрана без разбора солюбилизируются, что затрудняет разделение этих компонентов. Дополнительным осложнением от использования этих наборов является неспособность исследователей изменять / оптимизировать их для конкретных применений, поскольку большинство компонентов являются запатентованными составами. Наконец, эти наборы могут быть непомерно дорогими, с ограничениями в количестве применений, которые делают их менее идеальными для больших образцов.

Несмотря на наличие наборов для выделения митохондрий, которые не полагаются на моющие средства, они не предназначены для изоляции плазматической мембраны и дают значительно меньшее количество образца, чем стандартные протоколы изоляции ^3,4. Хотя методы дифференциального центрифугирования являются более трудоемкими, они часто приводят к образованию различных фракций, которые не могут быть получены с помощью наборов¹ исключительно на основе моющих средств. Сепарация без исключительного использования солюбилизирующих моющих средств также позволяет проводить дальнейшую очистку с использованием ультрацентрифугирования и изопикнических градиентов плотности, что приводит к меньшему перекрестному загрязнению. Этот протокол фракционирования демонстрирует выделение субклеточных фракций из моноцитов U937 с использованием комбинации подходов на основе детергентов и высокоскоростного центрифугирования. Этот метод облегчит выделение ядерного, цитоплазматического, митохондриального и плазматического мембранных компонентов клетки млекопитающих с минимальным загрязнением между фракциями.

протокол

1. Подготовьте буферы и реагенты

1. Готовят свежие растворы фосфатазы и ингибиторов протеазы.
   1. Добавьте 17,4 мг фенилметансульфонилфторида (PMSF) к 1 мл 100% этанола для получения запаса 100 мМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Носите защитное снаряжение при обращении с PMSF, так как это опасно при проглатывании или вдыхании и при контакте с кожей или глазами. Разъедает глаза и кожу.
   2. Согласно инструкции производителя, приготовьте коммерчески доступный коктейль ингибитора протеазы (100x).
   3. Добавьте 91,9 мг ортованадата натрия (SOV) в 1 мл деионизированной воды, чтобы подготовить запас 500 мМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Носите защитное снаряжение при обращении с SOV, так как оно опасно при попадании в организм, вдыхании или при попадании в глаза. Сильное передержка может привести к смерти.
2. Подготовьте буфер лизиса A, буфер цитоплазматической изоляции (CI), буфер солюбилизации клеток (CS), буфер ядерного лизиса (NL), буфер лизиса B, буфер гомогенизации клеток (CH), разбавитель йодиксанола и моющие средства.
   1. Добавьте 8,7 г хлорида натрия (NaCl) и 50 мл 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES, 1 M, рН 7,4) до 950 мл деионизированной воды для получения лизисного буфера А (конечные концентрации 150 мМ NaCl и 50 мМ HEPES).
   2. Готовят исходные растворы моющих средств следующим образом: добавляют 0,1 г додецилсульфата натрия (СДС) к 10 мл лизисного буфера А (конечная концентрация 1% СДС), добавляют 0,1 г дезоксихолата натрия к 10 мл лизисного буфера А (конечная концентрация 1%), добавляют 2,5 мг дигитонина к 10 мл лизисного буфера А (конечная концентрация 250 мкг/мл), и добавить 1 мл неионного, неденатурирующего моющего средства (см. Таблицу материалов) к 9 мл лизисного буфера А (конечная концентрация 10% (v/v)).
   3. Получают ci-буфер путем добавления 10 мкл запаса PMSF (100 мМ), 10 мкл ингибитора протеазы (100x), 2 мкл запаса SOV (500 мМ) и 100 мкл исходного дигитонина (250 мкг/мл) к 878 мкл лизизного буфера A (конечные концентрации 1 мМ PMSF, 1x ингибитора протеазы, 1 мМ SOV и 25 мкг/мл дигитонина). Держите раствор на льду до добавления в ячейку гранулы.
   4. Получение буфера CS путем добавления 10 мкл запаса PMSF (100 мМ), 10 мкл ингибитора протеазы (100x), 2 мкл запаса SOV (500 мМ), 100 мкл неионного, неденатурирующего моющего вещества (см. Таблицу материалов) (10%) и 118 мкл гексиленгликоля (8,44 М) до 760 мкл лизизного буфера А (конечные концентрации 1 мМ PMSF, 1x ингибитор протеазы, 1 мМ SOV, 1% неионное, неденатурирующее моющее средство и 1 М гексиленгликоля). Держите раствор на льду до добавления в ячейку гранулы.
   5. Получение буфера NL путем добавления 10 мкл запаса PMSF (100 мМ), 10 мкл ингибитора протеазы (100x), 2 мкл запаса SOV (500 мМ), 50 мкл дезоксихолата натрия (10%), 100 мкл запаса SDS (1%) и 118 мкл гексиленгликоля (8,44 М) до 710 мкл лизизного буфера A (конечные концентрации 1 мМ PMSF, 1x ингибитор протеазы, 1 мМ SOV, 0,5% дезоксихолат натрия (v/v), 0,1% SDS (мас./об.) и 1 М гексиленгликоля). Держите раствор на льду до добавления в ядерную гранулу.
   6. Добавьте 20 мл HEPES (1 M, рН 7,4), 0,74 г хлорида калия (KCl), 0,19 г хлорида магния (MgCl₂), 2 мл этилендиаминтетрауксусной кислоты (0,5 M EDTA), 2 мл этиленгликоля-биса (β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (0,5 M EGTA), 38,3 г маннитола и 23,9 г сахарозы до 980 мл деионизированной воды для получения лизисного буфера B (конечные концентрации 20 мМ HEPES, 10 мМ KCl, 2 мМ MgCl₂, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 210 мМ маннит и 70 мМ сахарозы).
   7. Подготовьте буфер CH путем добавления 10 мкл запаса PMSF (100 мМ) и 2 мкл запаса SOV (500 мМ) к 988 мкл лизисного буфера B (конечные концентрации 1 мМ PMSF и 1 мМ SOV; отрегулируйте конечный объем для размещения количества формируемых клеток). Держите раствор на льду до добавления в ячейку гранулы.
   8. Получают разбавитель йодиксанола путем добавления 12 мл HEPES (1 M, рН 7,4), 447 мг KCl, 114 г MgCl₂, 1,2 мл 0,5 M ЭДТА, 1,2 мл 0,5 M EGTA, 21,3 г маннитола и 14,4 г сахарозы в 88 мл деионизированной воды (конечные концентрации 120 мМ HEPES, 60 мМ KCl, 12 мМ MgCl₂, 6 мМ ЭДТА, 6 мМ ЭГТА, 1200 мМ маннит и 420 мМ сахарозы).
   9. Храните буферы при температуре 4 °C и дигитонин при -20 °C.

2. Выделение цитозольного белка

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги позволят обеспечить рост и расширение клеток U937 с последующей экстракцией цитозольных белков. При используемой концентрации дигитонин будет проникать в плазматическую мембрану, не нарушая ее, что позволяет высвобождать цитозольные белки и удерживать другие клеточные белки.

1. Культивируйте клетки в RPMI 1640 с 10% фетальной бычьей сывороткой при 37 °C и 5% CO₂. Убедитесь, что клетки выращены до конечной суммы 6 х 10⁸ клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе клетки подсчитывались с помощью стандартного гемоцитометра и микроскопа.
2. Центрифугируют культивируемые клетки при 400 × г в течение 10 мин. После выброса супернатанта повторно суспендируют ячейку гранулы в фосфатно-буферном физиологическом растворе комнатной температуры (PBS) в конечной концентрации 4 × 10⁶ клеток/мл, и пипетку осторожно разбивают сгустки.
3. Центрифугируют клеточную суспензию при 400 × г в течение 10 мин для гранулирования клеток. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте клеточную гранулу в ледяно-холодном лизисном буфере А (полученном на стадии 1.2.1) в конечной концентрации 2 × 10⁷ клеток/мл.
4. Удалить 7,5 мл клеток, взвешенных в буфере лизиса А (3 × 10⁷ клеток), и оставить на льду для экстракции ядерного белка (раздел 6). Центрифугируют клеточную суспензию при 4 °C, 400 × г в течение 10 мин для гранулирования клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все последующие шаги при температуре 4 °C или на льду и предварительно отклоните все буферы.
5. Отбросьте надосадочный материал, повторно суспендируйте клеточную гранулу в буфере CI в конечной концентрации 2 × 10⁷ клеток/мл и аккуратно пипетку, чтобы разбить сгустки. Поверните клеточную суспензию концом через конец при 4 °C в течение 20 мин.
6. Центрифугируют клеточную суспензию при 4 °C, 400 × г в течение 10 мин и переносят супернатант в чистую центрифужную трубку. Сохраните ячейку гранулы и храните на льду. Центрифугировать собранный супернатант при 4 °C, 18 000 × г в течение 20 мин в гранулированный клеточный мусор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта высокоскоростная стадия центрифугирования имеет решающее значение для предотвращения загрязнения цитозольной фракции органеллами и мембранно-связанными белками.
7. Выбросьте гранулу после переноса супернатанта в чистую центрифужную трубку. Повторяйте оба этапа центрифугирования на этапе 2.6 до тех пор, пока после центрифугирования не будет получена гранула.
8. Соберите супернатант, которым является цитозольная фракция. Для краткосрочного хранения (1 месяц) убедитесь, что супернатант хранится при 4 °C. Для длительного хранения (>1 месяц) соедините супернатант с 1x буфером Laemmli, содержащим 1x восстановитель, нагревайте при 95 °C в течение 7 мин и храните при -20 или -80 °C.
9. Повторно суспендируют клеточную гранулу (со стадии 2.6) в лизисном буфере А при конечной концентрации 4 × 10⁶ клеток/мл; пипетку аккуратно разбить комочки.

3. Гомогенизация клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие этапы позволят провести механическую гомогенизацию клеток, обработанных дигитонином (из стадии 2.9), что необходимо для выделения митохондриальных и мембранных белковых фракций.

1. Центрифугируйте клеточную суспензию в буфере лизиса А (приготовленном на стадии 2.9), сохраните гранулу и выбросьте супернатант для удаления избытка дигитонина и цитозольных загрязнителей из клеточной гранулы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Повторные промывки в буфере лизиса А могут быть выполнены для удаления избытка цитозольных загрязнений.
2. Повторно суспендируют клеточную гранулу в ледяном буфере CH (приготовленном на стадии 1.2.7) в конечной концентрации 4 × 10⁶ клеток/мл. Инкубировать клеточную суспензию на льду в течение 30 мин.
3. При использовании метода механического лизиса на основе бисера поместите 30 г предварительно промытых шариков из нержавеющей стали 3,2 мм в пробирку с юбкой объемом 50 мл, заполните 15 мл лизисного буфера B и поместите на лед для охлаждения. При использовании гомогенизатора Dounce (с плотно прилегающим пестиком B) заполните соответствующим объемом лизисного буфера B, вставьте пестик и поместите на лед для охлаждения.
4. После инкубации (стадия 3.2) отбросьте буфер лизиса B из шариковых пробирок (или гомогенизатора Dounce) и переложите 15 мл клеточной суспензии в шариковую трубку (или соответствующий объем гомогенизатору).
5. Если используется метод на основе бисера, поместите пробирки с шариками, содержащие суспензию ячейки, в устройство блендера и сконфигурируйте так, чтобы они работали в течение 5 мин со скоростью 8. Если вы используете гомогенизатор Dounce, держите его на льду и выполняйте 40 проходов с пестиком, используя медленные, ровные удары (или используйте альтернативный метод механического лизиса клеток, как подробно описано в разделе обсуждения).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании блендера, отличного от используемого здесь, скорость и время, возможно, потребуется определить эмпирически.
6. Переложите гомогенат в чистую центрифужную трубку и центрифугируйте его при 400 × г в течение 10 мин при 4 °C. Перенесите супернатант в чистую центрифужную трубку и сохраните; выбросьте гранулу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол может быть приостановлен, а гомогенат хранить при 4 °C в течение короткого срока (24 ч).

4. Удаление мусора и выделение сырых митохондриальных и мембранных фракций

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие этапы позволят удалить клеточный мусор путем центрифугирования гомогената с возрастающей скоростью. За этим следует дифференциальное центрифугирование для выделения сырых митохондриальных и мембранных фракций.

1. Центрифугируют гомогенат (со стадии 3.6) при 500 × г в течение 10 мин при 4 °С. Переложите супернатант в чистую центрифужную трубку и выбросьте любую гранулу.
2. Центрифугируют супернатант (со стадии 4.1) при 1000 × г в течение 10 мин при 4 °C. Переложите супернатант в чистую центрифужную трубку и выбросьте любую гранулу.
3. Центрифугируют супернатант (со стадии 4.2) при 2000 × г в течение 10 мин при 4 °C. Переложите супернатант в чистую центрифужную трубку и выбросьте любую гранулу.
4. Центрифугируют супернатант (со стадии 4.3) при 4000 × г в течение 20 мин при 4 °C. Перенесите супернатант в чистую центрифужную трубку и сохраните гранулу, которая представляет собой сырую митохондриальную фракцию.
5. Центрифугировать супернатант (начиная со стадии 4.4) при 18 000 × г в течение 1 ч при 4 °C. Выбросьте супернатант и сохраните гранулу, которая является сырой мембранной фракцией.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол может быть приостановлен, а гранулированные образцы хранить при 4 °C в течение краткосрочного периода (24 ч).

5. Очистка градиента изопикновой плотности

ПРИМЕЧАНИЕ: На следующих этапах используется центрифугирование изопикновой градиентной плотности для очистки сырых митохондриальных и мембранных фракций.

1. Готовят 50% (v/v) рабочий раствор йодиксанола путем смешивания 1 части разбавителя (приготовленного на стадии 1.1.3) с 5 частями йодиксанола (60% раствора (мас./об.)). Готовят 10%, 15%, 20%, 25%, 30% и 35% растворы йодиксанола (v/v) путем смешивания 50% рабочего раствора (v/v) с лизизным буфером B в соответствующих количествах.
2. Повторное суспендирование сырых митохондриальных и мембранных гранул (со стадий 4.4 и 4.5) каждая в 200 мкл лизисного буфера B. Доведите до 45% йодиксанола (v/v), добавив 1800 мкл рабочего раствора йодиксанола (50% (v/v)) к 200 мкл повторно суспендированной гранулы.
3. Создайте прерывистый градиент йодиксанола следующим образом (отрегулируйте объемы в соответствии с емкостью ультрацентрифужной трубки): Добавьте 1 мл 15% йодиксанола (v / v) к нижней части 8 мл, с открытым верхом, тонкостенной ультрацентрифужной трубки, поместите 1 мл 20% йодиксанола (v / v) ниже первого слоя (методом подложки), с последующим подложением 1 мл 25%, 1 мл 30% и 1 мл 35% йодиксанола (v/v).
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе должно быть создано 2 градиента: 1 для митохондриальной фракции и 1 для мембранной фракции.
4. Через 1 градиент добавляют 2 мл сырой митохондриальной гранулы (суспендированной в 45% йодиксаноле (v/v)) с использованием метода подложки к нижней части трубки ниже 35% йодиксанола (v/v). В другом градиенте добавляют 2 мл сырой мембранной гранулы (суспендированной в 45% йодиксаноле (v/v)) с использованием метода подложки на дно трубки ниже 35% йодиксанола (v/v).
5. Добавьте 1 мл 10% йодиксанола (v/v) в верхнюю часть каждой градиентной трубки, наложив ее поверх слоя 15%. Балансируют пробирки в пределах 0,1 г друг от друга путем добавления 10% йодиксанола (v/v).
6. Вращайте трубки с градиентом плотности при 4 °C в течение 18 ч при 100 000 × г. Обязательно установите ускорение и замедление на минимальные значения для используемой ультрацентрифуги.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В митохондриальном градиенте будет видимая полоса на границе раздела между 25% и 30% йодиксанола (v/v). Это чистая митохондриальная фракция. В мембранном градиенте будет видимая полоса в фракции 15% йодиксанола (v/v). Это чистая мембранная фракция. В мембранном градиенте могут быть дополнительные полосы в фракциях 25% и 30% йодиксанола (v/v). Это митохондриальное загрязнение.
7. Собирайте фракции с верхней части трубки в 1 мл аликвот, стараясь минимизировать объем фракции, содержащей видимые полосы и меняя кончик пипетки после сбора каждого слоя. В качестве альтернативы проколите бок тонкостенной трубки иглой и соберите видимые полосы.
8. Храните образцы, как описано в шаге 2.8, до тех пор, пока не пройдут проверку с помощью анализа белка и вестерн-блоттинга.

6. Ядерная белковая изоляция

ПРИМЕЧАНИЕ: Используя ионные и неионные моющие средства, а также такие методы, как обработка ультразвуком и центрифугирование, следующие шаги будут солюбилизировать все клеточные мембраны и позволят выделить ядерные белки.

1. Центрифугируют 7,5 мл аликвоты клеток, взвешенных в буфере лизиса А (со стадии 2.4), и отбрасывают супернатант. Добавьте 800 мкл ледяного CS-буфера (приготовленного на этапе 1.2.4) и повторно суспендируйте гранулу путем пипетки и вихря. Инкубируйте образцы на льду (или при 4 °C) в течение 30 мин, чтобы разрушить плазменные и органеллные мембраны, защищая ядерные белки.
2. Центрифугируют клеточную суспензию при 7000 × г в течение 10 мин при 4 °C и выбрасывают супернатант. Добавьте 800 мкл ледяного NL-буфера (приготовленного на стадии 1.2.5) к ядерной грануле после включения бензоназы 1U/μL. Повторно суспендировать гранулу путем аккуратной пипетки. Инкубируйте на торцевом ротаторе в течение 30 мин при 4 °C, чтобы разрушить ядерную мембрану.
3. Ультразвук в течение 5 с при мощности 20% с пробирками, охлаждаемыми в ледяной ванне (3x, с паузами 5 с между импульсами), которые вместе с бензоназой (добавленной на шаге 6.2) будут сдвигать нуклеиновые кислоты.
4. Центрифугируют ультразвук при 7 800 × г в течение 10 мин при 4 °C. Соберите и сохраните супернатант, которым является ядерная фракция. Не потревожите нерастворимую гранулу во время сбора надосадочного вещества. Для хранения образцы могут быть подготовлены, как описано в шаге 2.8.

7. Количественная оценка белка и анализ вестерн-блоттинга

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги позволят количественно оценить общий белок в каждой фракции и подтвердить чистоту субклеточных фракций.

1. Выполните стандартный анализ Брэдфорда для количественной оценки общего белка в каждой фракции. Ожидаемые выходы белка приведены в таблице 1 .
   ПРИМЕЧАНИЕ: Другие белковые анализы, такие как анализ бицинхониновой кислоты (BCA) или абсорбция при 280 нм, могут быть использованы для измерения общего белка вместо анализа Брэдфорда.
2. Соедините фракции с 1x буфером Laemmli, содержащим 1x восстановитель, и нагревайте при 95 °C в течение 7 мин. Загрузите 10 мкг каждой фракции в стандартный гель электрофореза SDS-полиакриламидного геля (PAGE) и запустите гель при 20 мА в течение 1 ч.
3. Перенос разрешенных белков на поливинилдифторидную (PVDF) мембрану путем выполнения стандартного переноса иммуноблота при 100 В в течение 30 мин. Заблокируйте мембрану PVDF с 5% молоком в 1x Tris-буферном физиологическом растворе (TBS), содержащем 0,1% неионного моющего средства (v/v) в течение 30 мин при комнатной температуре.
4. Добавляют соответствующие первичные антитела для обнаружения домашних белков, специфичных для каждой субклеточной фракции, и инкубируют в течение ночи при 4 °C. Промывайте мембрану 5% молоком в 1x TBS, содержащим 0,1% неионного моющего средства (v/v) в течение 10 мин при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола антитела против глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH, 1:10000), гистона H3 (1:2000), зависимого от напряжения анионного канала (VDAC, 1:1000) и Na,K⁺-АТФазы использовались для цитозольной, ядерной, митохондриальной и мембранной фракций соответственно.
5. Добавляют к мембране соответствующие пероксидазу хрена (HRP)-конъюгированные вторичные антитела (разбавляют согласно инструкциям производителя) и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. Промывайте мембрану 5% молоком в 1x TBS, содержащим 0,1% неионного моющего средства (v/v) в течение 10 мин при комнатной температуре. Развивайте блоттинг с помощью стандартной хемилюминесценции.

Результаты

Схематическая блок-схема этой процедуры (рисунок 1) визуально суммирует шаги, которые были предприняты для успешного фракционирования клеток U937^5, выращенных в суспензии. Фракции, собранные с верхней части изопикнового градиента плотности в равных объемах (1...

Обсуждение

Данный способ является модифицированной версией ранее опубликованного подхода к субклеточному фракционированию без использования высокоскоростного центрифугирования¹¹. Этот модифицированный метод требует более специализированного оборудования для достижения наилуч?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	61-BB50-DX
digitonin	Sigma	D141
end-over-end rotator	ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma	E3889
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118
HEPES	VWR	97064-360
Hexylene glycol	Sigma	68340
Igepal	Sigma	I7771	Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl	Sigma	P9333
Mannitol	Sigma	M9647
MgCl2	Sigma	M8266
NaCl	Sigma	S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm	Seton Scientific	7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium	Sigma	D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML
refrigerated centrifuge	ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor	Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	436143
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma	567540
sonicator	ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge	ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm	Next Advance	SSB32
Sucrose	Sigma	S0389
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	97062-370
Tween 20			non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661