Fractionnement cellulaire de cellules U937 par purification par gradient de densité isopycnique

Résumé

Ce protocole de fractionnement permettra aux chercheurs d’isoler des protéines cytoplasmiques, nucléaires, mitochondriales et membranaires à partir de cellules de mammifères. Les deux dernières fractions subcellulaires sont purifiées par gradient de densité isopycnique.

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour obtenir des fractions protéiques subcellulaires à partir de cellules de mammifères en utilisant une combinaison de détergents, de lyse mécanique et de centrifugation à gradient de densité isopycnique. L’avantage majeur de cette procédure est qu’elle ne repose pas sur l’utilisation exclusive de détergents solubilisants pour obtenir des fractions subcellulaires. Cela permet de séparer la membrane plasmique des autres organites liés à la membrane de la cellule. Cette procédure facilitera la détermination de la localisation des protéines dans les cellules avec une méthode reproductible, évolutive et sélective. Cette méthode a été utilisée avec succès pour isoler les protéines cytosoliques, nucléaires, mitochondriales et plasmiques de la lignée cellulaire monocytaire humaine, U937. Bien qu’optimisée pour cette lignée cellulaire, cette procédure peut servir de point de départ approprié pour le fractionnement subcellulaire d’autres lignées cellulaires. Les pièges potentiels de la procédure et la façon de les éviter sont discutés, tout comme les modifications qui peuvent devoir être envisagées pour d’autres lignées cellulaires.

Introduction

Le fractionnement subcellulaire est une procédure dans laquelle les cellules sont lysées et séparées en leurs composants constitutifs par plusieurs méthodes. Cette technique peut être utilisée par les chercheurs pour déterminer la localisation des protéines dans les cellules de mammifères ou pour enrichir des protéines de faible abondance qui seraient autrement indétectables. Bien qu’il existe actuellement des méthodes de fractionnement subcellulaire, tout comme les kits commerciaux qui peuvent être achetés, ils souffrent de plusieurs limitations que cette procédure tente de surmonter. La plupart des méthodes de fractionnement cellulaire sont exclusivement à base de détergent^1,2, reposant sur l’utilisation de tampons contenant des quantités croissantes de détergent pour solubiliser différents composants cellulaires. Bien que cette méthode soit rapide et pratique, elle aboutit à des fractions impures. Ceux-ci sont conçus pour permettre aux chercheurs d’isoler facilement un ou deux composants de la cellule, mais ne sont pas assez complexes pour isoler plusieurs fractions subcellulaires d’un échantillon en même temps. Se fier uniquement aux détergents entraîne généralement une solubilisation indiscriminée des organites enfermés dans la membrane et de la membrane plasmique, ce qui rend la séparation de ces composants difficile. Une complication supplémentaire de l’utilisation de ces kits est l’incapacité des chercheurs à les modifier/optimiser pour des applications spécifiques, car la plupart des composants sont des formulations exclusives. Enfin, ces kits peuvent être d’un coût prohibitif, avec des limites dans le nombre d’utilisations qui les rendent moins qu’idéaux pour des échantillons plus volumineux.

Malgré la disponibilité de kits pour l’isolement des mitochondries qui ne dépendent pas de détergents, ils ne sont pas conçus pour isoler la membrane plasmique et produire des quantités d’échantillon significativement inférieures aux protocoles d’isolement standard ^3,4. Bien que les méthodes de centrifugation différentielle prennent plus de temps, elles aboutissent souvent à des fractions distinctes qui ne peuvent pas être obtenues avec des kits exclusivement à base de détergent¹. La séparation sans utilisation exclusive de détergents solubilisants permet également une purification supplémentaire à l’aide d’ultracentrifugation et de gradients de densité isopycnique, ce qui réduit la contamination croisée. Ce protocole de fractionnement démontre l’isolement de fractions subcellulaires à partir de monocytes U937 en utilisant une combinaison d’approches basées sur la centrifugation à haute vitesse et les détergents. Cette méthode facilitera l’isolement des composants nucléaires, cytoplasmiques, mitochondriaux et plasmiques d’une cellule de mammifère avec une contamination minimale entre les fractions.

Protocole

1. Préparer des tampons et des réactifs

1. Préparer des solutions fraîches d’inhibiteurs de phosphatase et de protéase.
   1. Ajouter 17,4 mg de fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF) à 1 mL d’éthanol à 100 % pour préparer un stock de 100 mM.
      NOTA : Porter un équipement de protection lors de la manipulation du PMSF, car il est dangereux lorsqu’il est ingéré ou inhalé et lorsqu’il est en contact avec la peau ou les yeux. Il est corrosif pour les yeux et la peau.
   2. Selon les instructions du fabricant, préparez un cocktail d’inhibiteurs de protéase disponibles dans le commerce (100x).
   3. Ajouter 91,9 mg d’orthovanadate de sodium (SOV) à 1 mL d’eau désionisée pour préparer un bouillon de 500 mM.
      REMARQUE : Porter un équipement de protection lors de la manipulation du VSO, car il est dangereux s’il est ingéré, inhalé ou au contact des yeux. Une surexposition grave peut entraîner la mort.
2. Préparer le tampon de lyse A, le tampon d’isolement cytoplasmique (IC), le tampon de solubilisation cellulaire (CS), le tampon de lyse nucléaire (NL), le tampon de lyse B, le tampon d’homogénéisation cellulaire (CH), le diluant d’iodixanol et les détergents.
   1. Ajouter 8,7 g de chlorure de sodium (NaCl) et 50 mL d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinééthanésulfonique (HEPES, 1 M, pH 7,4) à 950 mL d’eau désionisée pour préparer le tampon de lyse A (concentrations finales de 150 mM de NaCl et 50 mM HEPES).
   2. Préparer les solutions mères de détergents comme suit : ajouter 0,1 g de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 10 mL de tampon de lyse A (concentration finale de 1 % de SDS), ajouter 0,1 g de désoxycholate de sodium à 10 mL de tampon de lyse A (concentration finale de 1 %), ajouter 2,5 mg de digitonine à 10 mL de tampon de lyse A (concentration finale de 250 μg/mL), et ajouter 1 mL de détergent non ionique et non dénaturant (voir le tableau des matières) à 9 mL de tampon de lyse A (concentration finale de 10 % (v/v)).
   3. Préparer le tampon d’IC en ajoutant 10 μL de stock PMSF (100 mM), 10 μL d’inhibiteur de protéase (100x), 2 μL de stock SOV (500 mM) et 100 μL de digitonine mère (250 μg/mL) à 878 μL de tampon de lyse A (concentrations finales de 1 mM PMSF, 1x inhibiteur de protéase, 1 mM SOV et 25 μg/mL de digitonine). Conserver la solution sur glace jusqu’à ce qu’elle soit ajoutée à la pastille de cellule.
   4. Préparer le tampon CS en ajoutant 10 μL de stock PMSF (100 mM), 10 μL d’inhibiteur de protéase (100x), 2 μL de stock SOV (500 mM), 100 μL de stock de détergent non ionique et non dénaturant (voir le tableau des matières) (10 %) et 118 μL de stock d’hexylène glycol (8,44 M) à 760 μL de tampon de lyse A (concentrations finales de 1 mM PMSF, 1x inhibiteur de protéase, 1 mM SOV, 1% non ionique, détergent non dénaturant et 1 M hexylène glycol). Conserver la solution sur glace jusqu’à ce qu’elle soit ajoutée à la pastille de cellule.
   5. Préparer le tampon NL en ajoutant 10 μL de stock PMSF (100 mM), 10 μL d’inhibiteur de protéase (100x), 2 μL de stock SOV (500 mM), 50 μL de stock de désoxycholate de sodium (10%), 100 μL de stock de FDS (1%) et 118 μL de stock d’hexylène glycol (8,44 M) à 710 μL de tampon de lyse A (concentrations finales de 1 mM PMSF, 1x inhibiteur de protéase, 1 mM SOV, 0,5% de désoxycholate de sodium (v / v), 0,1% SDS (p / v) et 1 M hexylène glycol). Gardez la solution sur la glace jusqu’à ce qu’elle soit ajoutée à la pastille nucléaire.
   6. Ajouter 20 mL d’acide HEPES (1 M, pH 7,4), 0,74 g de chlorure de potassium (KCl), 0,19 g de chlorure de magnésium (MgCl 2), 2 mL d’acide éthylènediaminetétraacétique (0,5 M EDTA),₂ mL d’acide éthylèneglycol-bis(β-aminoéthyléther)-N,N,N',N'-tétraacétique (0,5 M EGTA), 38,3 g de mannitol et 23,9 g de saccharose à 980 mL d’eau désionisée pour préparer le tampon de lyse B (concentrations finales de 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 210 mM mannitol et 70 mM saccharose).
   7. Préparer le tampon CH en ajoutant 10 μL de stock PMSF (100 mM) et 2 μL de stock SOV (500 mM) à 988 μL de tampon de lyse B (concentrations finales de 1 mM PMSF et 1 mM SOV; ajuster le volume final pour tenir compte du nombre de cellules lysées). Conserver la solution sur glace jusqu’à ce qu’elle soit ajoutée à la pastille de cellule.
   8. Préparer le diluant iodixanol par addition de 12 mL d’HEPES (1 M, pH 7,4), 447 mg de KCl, 114 g de MgCl 2, 1,2 mL de 0,5 M EDTA,_1,2 mL de 0,5 M EGTA, 21,3 g de mannitol et 14,4 g de saccharose à 88 mL d’eau désionisée (concentrations finales de 120 mM HEPES, 60 mM KCl, 12 mM MgCl₂, 6 mM EDTA, 6 mM EGTA, 1200 mM mannitol et 420 mM saccharose).
   9. Conserver les tampons à 4 °C et la digitonine à -20 °C.

2. Isolement des protéines cytosoliques

NOTE: Les étapes suivantes permettront la croissance et l’expansion des cellules U937 suivies de l’extraction des protéines cytosoliques. À la concentration utilisée, la digitonine perméabilise la membrane plasmique sans la perturber, ce qui permet la libération de protéines cytosoliques et la rétention d’autres protéines cellulaires.

1. Culture des cellules dans RPMI 1640 avec 10% de sérum fœtal bovin à 37 °C et 5% de CO₂. Assurez-vous que les cellules sont cultivées jusqu’à un total final de 6 x 10⁸ cellules.
   REMARQUE: Dans ce protocole, les cellules ont été comptées à l’aide d’un hémocytomètre et d’un microscope standard.
2. Centrifuger les cellules cultivées à 400 × g pendant 10 min. Après avoir jeté le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à température ambiante à une concentration finale de 4 × 10⁶ cellules/mL, et pipeter doucement pour briser les touffes.
3. Centrifuger la suspension cellulaire à 400 × g pendant 10 min pour granuler les cellules. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un tampon de lyse glacé A (préparé à l’étape 1.2.1) à une concentration finale de 2 × 10⁷ cellules/mL.
4. Retirer 7,5 mL des cellules en suspension dans le tampon de lyse A (3 × 10⁷ cellules) et conserver la glace pour l’extraction des protéines nucléaires (section 6). Centrifuger la suspension cellulaire à 4 °C, 400 × g pendant 10 min pour granuler les cellules.
   REMARQUE : Effectuez toutes les étapes suivantes à 4 °C ou sur de la glace, et prérefroidissez tous les tampons.
5. Jeter le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans un tampon CI à une concentration finale de 2 × 10⁷ cellules/mL et pipeter doucement pour briser les touffes. Faire pivoter la suspension cellulaire bout à bout à 4 °C pendant 20 min.
6. Centrifuger la suspension cellulaire à 4 °C, 400 × g pendant 10 min, et transférer le surnageant dans un tube à centrifuger propre. Conservez la pastille cellulaire et stockez-la sur de la glace. Centrifuger le surnageant collecté à 4 °C, 18 000 × g pendant 20 min pour pelleter les débris cellulaires.
   REMARQUE: Cette étape de centrifugation à grande vitesse est essentielle pour prévenir la contamination de la fraction cytosolique par des organites et des protéines liées à la membrane.
7. Jeter la pastille après avoir transféré le surnageant dans un tube à centrifuger propre. Répéter les deux étapes de centrifugation de l’étape 2.6 jusqu’à ce qu’aucune pastille ne soit obtenue après la centrifugation.
8. Recueillir le surnageant, qui est la fraction cytosolique. Pour un stockage à court terme (1 mois), s’assurer que le surnageant est conservé à 4 °C. Pour une conservation à long terme (>1 mois), combiner le surnageant avec 1x tampon Laemmli contenant 1x agent réducteur, chauffer à 95 °C pendant 7 min et conserver à -20 ou -80°C.
9. Resuspendre la pastille cellulaire (à partir de l’étape 2.6) dans le tampon de lyse A à une concentration finale de 4 × 10⁶ cellules/mL; Pipeter doucement pour briser les touffes.

3. Homogénéisation cellulaire

NOTE: Les étapes suivantes permettront l’homogénéisation mécanique des cellules traitées à la digitonine (à partir de l’étape 2.9), ce qui est nécessaire pour l’isolement des fractions protéiques mitochondriales et membranaires.

1. Centrifuger la suspension cellulaire dans le tampon de lyse A (préparé à l’étape 2.9), conserver la pastille et jeter le surnageant pour éliminer l’excès de digitonine et de contaminants cytosoliques de la pastille cellulaire.
   NOTE: Des lavages répétés dans le tampon de lyse A peuvent être effectués pour éliminer les contaminants cytosoliques en excès.
2. Resuspendre la pastille cellulaire dans un tampon CH glacé (préparé à l’étape 1.2.7) à une concentration finale de 4 × 10⁶ cellules/mL. Incuber la suspension cellulaire sur de la glace pendant 30 min.
3. Si vous utilisez une méthode à base de billes pour la lyse mécanique, placer 30 g de perles d’acier inoxydable prélavées de 3,2 mm dans un tube à jupe de 50 mL, remplir avec 15 ml de tampon de lyse B et placer sur de la glace pour refroidir. Si vous utilisez un homogénéisateur Dounce (avec un pilon B bien ajusté), remplir avec un volume approprié de tampon de lyse B, insérer le pilon et le placer sur de la glace pour refroidir.
4. Après l’incubation (étape 3.2), jeter le tampon de lyse B des tubes à billes (ou homogénéisateur de rebond) et transférer 15 mL de la suspension cellulaire dans le tube à billes (ou un volume approprié dans l’homogénéisateur).
5. Si vous utilisez la méthode à base de billes, placez les tubes à billes à jupe contenant la suspension cellulaire dans le dispositif mélangeur et configurez pour fonctionner pendant 5 minutes à la vitesse 8. Si vous utilisez un homogénéisateur Dounce, gardez-le sur la glace et effectuez 40 passages avec le pilon en utilisant des coups lents et réguliers (ou utilisez une autre méthode de lyse cellulaire mécanique comme détaillé dans la section de discussion).
   REMARQUE: Si vous utilisez un mélangeur différent de celui utilisé ici, la vitesse et le temps peuvent devoir être déterminés empiriquement.
6. Transférer l’homogénat dans un tube à centrifuger propre et le centrifuger à 400 × g pendant 10 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans un tube centrifuge propre et économiser; Jetez la pastille.
   NOTE: Le protocole peut être interrompu ici et l’homogénat stocké à 4 °C à court terme (24 h).

4. Enlèvement des débris et isolement des fractions mitochondriales et membranaires brutes

NOTE: Les étapes suivantes permettront d’éliminer les débris cellulaires en centrifugeant l’homogénat à des vitesses croissantes. Ceci est suivi par centrifugation différentielle pour l’isolement des fractions mitochondriales et membranaires brutes.

1. Centrifuger l’homogénat (à partir de l’étape 3.6) à 500 × g pendant 10 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger propre et jeter toute pastille.
2. Centrifuger le surnageant (à partir de l’étape 4.1) à 1 000 × g pendant 10 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger propre et jeter toute pastille.
3. Centrifuger le surnageant (à partir de l’étape 4.2) à 2 000 × g pendant 10 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger propre et jeter toute pastille.
4. Centrifuger le surnageant (à partir de l’étape 4.3) à 4 000 × g pendant 20 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans un tube centrifuge propre et conserver la pastille, qui est la fraction mitochondriale brute.
5. Centrifuger le surnageant (à partir de l’étape 4.4) à 18 000 × g pendant 1 h à 4 °C. Jetez le surnageant et conservez la pastille, qui est la fraction membranaire brute.
   NOTE: Le protocole peut être interrompu ici, et les échantillons granulés stockés à 4 ° C à court terme (24 h).

5. Purification du gradient de densité isopycnique

REMARQUE: Les étapes suivantes utilisent la centrifugation du gradient de densité isopycnique pour purifier les fractions mitochondriales et membranaires brutes.

1. Préparer une solution de travail à 50 % (v/v) d’iodixanol en mélangeant 1 partie de diluant (préparé à l’étape 1.1.3) à 5 parties d’iodixanol ( solution mère à 60 % (p/v)). Préparer des solutions d’iodixanol à 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 % et 35 % (v/v) en mélangeant une solution de travail à 50 % (v/v) avec un tampon de lyse B en quantités appropriées.
2. Remettez en suspension les pastilles mitochondriales et membranaires brutes (des étapes 4.4 et 4.5) chacune dans 200 μL de tampon de lyse B. Ajuster à 45% iodixanol (v / v) en ajoutant 1800 μL de solution d’iodixanol de travail (50% (v / v)) à 200 μL de la pastille remise en suspension.
3. Créer un gradient discontinu d’iodixanol comme suit (ajuster les volumes en fonction de la capacité du tube à ultracentrifugeuse) : Ajouter 1 mL d’iodixanol à 15 % (v/v) au bas d’un tube à ultracentrifugation à paroi mince à dessus ouvert de 8 mL, placer 1 mL d’iodixanol à 20 % (v/v) sous la première couche (par la technique de sous-couche), suivi d’une couche de sous-couche de 1 mL de 25 %, 1 mL de 30 % et 1 mL d’iodixanol à 35 % (v/v).
   NOTE: Il devrait y avoir 2 gradients créés à cette étape, 1 pour la fraction mitochondriale et 1 pour la fraction membranaire.
4. Dans 1 gradient, ajouter les 2 mL de la pastille mitochondriale brute (en suspension dans 45% d’iodixanol (v/v)) en utilisant la technique de sous-couche au fond du tube sous l’iodixanol à 35% (v/v). Dans l’autre gradient, ajouter les 2 mL de la pastille de membrane brute (en suspension dans de l’iodixanol à 45 % (v/v)) en utilisant la technique de sous-couche au fond du tube sous l’iodixanol à 35 % (v/v).
5. Ajouter 1 mL d’iodixanol à 10 % (v/v) au sommet de chaque tube de gradient en le superposant sur la couche à 15 %. Équilibrer les tubes à moins de 0,1 g l’un de l’autre par l’ajout de 10% d’iodixanol (v / v).
6. Faire tourner les tubes de gradient de densité à 4 °C pendant 18 h à 100 000 × g. Assurez-vous de régler l’accélération et la décélération sur les valeurs minimales de l’ultracentrifugeuse utilisée.
   REMARQUE: Dans le gradient mitochondrial, il y aura une bande visible à l’interface entre 25% et 30% iodixanol (v / v). C’est la fraction mitochondriale pure. Dans le gradient membranaire, il y aura une bande visible dans la fraction iodixanol (v/v) à 15%. C’est la fraction membranaire pure. Il peut y avoir des bandes supplémentaires dans les fractions d’iodixanol (v/v) à 25 % et à 30 % dans le gradient membranaire. C’est la contamination mitochondriale.
7. Recueillir les fractions du haut du tube dans des aliquotes de 1 mL, en prenant soin de minimiser le volume de la fraction contenant les bandes visibles et en changeant l’extrémité de la pipette après la collecte de chaque couche. Alternativement, percez le côté du tube à paroi mince avec une aiguille et recueillez les bandes visibles.
8. Conservez les échantillons comme décrit à l’étape 2.8 jusqu’à la vérification par dosage des protéines et transfert Western.

6. Isolement des protéines nucléaires

REMARQUE: En utilisant des détergents ioniques et non ioniques ainsi que des techniques telles que la sonication et la centrifugation, les étapes suivantes solubilisent toutes les membranes cellulaires et permettent l’isolement des protéines nucléaires.

1. Centrifuger les 7,5 mL aliquotes de cellules en suspension dans le tampon de lyse A (à partir de l’étape 2.4) et jeter le surnageant. Ajouter 800 μL de tampon CS glacé (préparé à l’étape 1.2.4) et remettre la pastille en suspension par pipetage et vortex. Incuber les échantillons sur de la glace (ou à 4 °C) pendant 30 min pour perturber les membranes plasmatiques et organites tout en protégeant les protéines nucléaires.
2. Centrifuger la suspension cellulaire à 7 000 × g pendant 10 min à 4 °C et jeter le surnageant. Ajouter 800 μL de tampon NL glacé (préparé à l’étape 1.2.5) à la pastille nucléaire après inclusion de benzonase 1U/μL. Remettez le granulé en suspension en le pipetant doucement. Incuber sur un rotateur bout à bout pendant 30 minutes à 4 °C pour perturber la membrane nucléaire.
3. Sonicate pendant 5 s à 20% de puissance avec des tubes d’échantillon refroidis dans un bain de glace (3x, avec des pauses de 5 s entre les impulsions), qui, avec la benzonase (ajoutée à l’étape 6.2), cisaillera les acides nucléiques.
4. Centrifuger le sonicate à 7 800 × g pendant 10 min à 4 °C. Collectez et sauvez le surnageant, qui est la fraction nucléaire. Assurez-vous de ne pas déranger la pastille insoluble lors de la collecte du surnageant. Pour le stockage, des échantillons peuvent être préparés comme décrit à l’étape 2.8.

7. Quantification des protéines et analyse Western blot

REMARQUE: Les étapes suivantes quantifieront les protéines totales dans chaque fraction et confirmeront la pureté des fractions subcellulaires.

1. Effectuer un test de Bradford standard pour quantifier la protéine totale dans chaque fraction. Se reporter au tableau 1 pour connaître les rendements en protéines prévus.
   REMARQUE: D’autres dosages protéiques tels que le dosage de l’acide bicinchoninique (BCA) ou l’absorbance à 280 nm peuvent être utilisés pour mesurer les protéines totales à la place d’un test Bradford.
2. Combiner les fractions avec 1x tampon Laemmli contenant 1x agent réducteur et chauffer à 95 °C pendant 7 min. Charger 10 μg de chaque fraction dans un gel standard d’électrophorèse sur gel SDS-polyacrylamide (PAGE) et faire fonctionner le gel à 20 mA pendant 1 h.
3. Transférer les protéines résolues sur une membrane de polyfluorure de vinyle (PVDF) en effectuant un transfert immunoblot standard à 100 V pendant 30 min. Bloquer la membrane PVDF avec du lait à 5% dans 1x solution saline tamponnée Tris (TBS) contenant 0,1% d’un détergent non ionique (v / v) pendant 30 minutes à température ambiante.
4. Ajouter les anticorps primaires appropriés pour détecter les protéines ménagères spécifiques à chaque fraction subcellulaire et incuber pendant une nuit à 4 °C. Laver la membrane avec du lait 5% dans 1x TBS contenant 0,1% de détergent non ionique (v / v) pendant 10 minutes à température ambiante.
   REMARQUE: Pour ce protocole, des anticorps contre la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH, 1:10000), l’histone H3 (1:2000), le canal anionique voltage-dépendant (VDAC, 1:1000) et la Na,K⁺-ATPase ont été utilisés pour les fractions cytosolique, nucléaire, mitochondriale et membranaire, respectivement.
5. Ajouter les anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) appropriés à la membrane (diluer selon les instructions du fabricant) et incuber à température ambiante pendant 1 h. Laver la membrane avec du lait 5% dans 1x TBS contenant 0,1% de détergent non ionique (v / v) pendant 10 minutes à température ambiante. Développer le transfert en utilisant la chimiluminescence standard.

Résultats

Un organigramme schématique de cette procédure (Figure 1) résume visuellement les étapes qui ont été suivies pour fractionner avec succès les cellules U937⁵ cultivées en suspension. Les fractions recueillies au sommet du gradient de densité isopycnique en volumes égaux (1 mL) montrent la purification des fractions mitochondriale et membranaire (Figure 2). L’utilisation d’un anticorps contre VDAC, une protéine localisée à ...

Discussion

Cette méthode est une version modifiée d’une approche précédemment publiée du fractionnement subcellulaire sans l’utilisation de la centrifugation à grande vitesse¹¹. Cette méthode modifiée nécessite un équipement plus spécialisé pour obtenir les meilleurs résultats, mais elle est plus complète et reproductible de façon cohérente.

Le développement du protocole initial était nécessaire en raison de l’incapacité de séparer les échantillons mito...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	61-BB50-DX
digitonin	Sigma	D141
end-over-end rotator	ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma	E3889
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118
HEPES	VWR	97064-360
Hexylene glycol	Sigma	68340
Igepal	Sigma	I7771	Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl	Sigma	P9333
Mannitol	Sigma	M9647
MgCl2	Sigma	M8266
NaCl	Sigma	S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm	Seton Scientific	7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium	Sigma	D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML
refrigerated centrifuge	ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor	Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	436143
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma	567540
sonicator	ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge	ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm	Next Advance	SSB32
Sucrose	Sigma	S0389
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	97062-370
Tween 20			non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661