U937 Hücrelerinin İzopiknik Yoğunluk Degrade Saflaştırması ile Hücre Fraksiyonasyonu

Özet

Bu fraksiyonasyon protokolü, araştırmacıların sitoplazmik, nükleer, mitokondriyal ve membran proteinlerini memeli hücrelerinden izole etmelerini sağlayacaktır. Son iki hücre altı fraksiyon, izopiknik yoğunluk gradyanı ile daha da saflaştırılır.

Özet

Bu protokol, deterjanlar, mekanik lizis ve izopiknik yoğunluk gradyanı santrifüjleme kombinasyonunu kullanarak memeli hücrelerinden hücre altı protein fraksiyonları elde etmek için bir yöntemi açıklar. Bu prosedürün en büyük avantajı, hücre altı fraksiyonları elde etmek için çözünürleştirici deterjanların tek kullanımına dayanmamasıdır. Bu, plazma zarını hücrenin diğer zara bağlı organellerinden ayırmayı mümkün kılar. Bu prosedür, tekrarlanabilir, ölçeklenebilir ve seçici bir yöntemle hücrelerde protein lokalizasyonunun belirlenmesini kolaylaştıracaktır. Bu yöntem, sitozolik, nükleer, mitokondriyal ve plazma membran proteinlerini insan monosit hücre hattı U937'den izole etmek için başarıyla kullanılmıştır. Bu hücre hattı için optimize edilmiş olmasına rağmen, bu prosedür diğer hücre hatlarının hücre altı fraksiyonasyonu için uygun bir başlangıç noktası olarak hizmet edebilir. Prosedürün potansiyel tuzakları ve bunlardan nasıl kaçınılacağı, diğer hücre hatları için dikkate alınması gereken değişiklikler gibi tartışılmaktadır.

Giriş

Subselüler fraksiyonasyon, hücrelerin lize edildiği ve çeşitli yöntemlerle kurucu bileşenlerine ayrıldığı bir prosedürdür. Bu teknik, araştırmacılar tarafından memeli hücrelerinde protein lokalizasyonunu belirlemek veya aksi takdirde tespit edilemeyecek düşük bolluktaki proteinlerin zenginleştirilmesi için kullanılabilir. Hücre altı fraksiyonasyon yöntemleri şu anda mevcut olsa da, satın alınabilecek ticari kitler gibi, bu prosedürün üstesinden gelmeye çalıştığı çeşitli sınırlamalardan muzdariptirler. Çoğu hücre fraksiyonasyon yöntemi, farklı hücresel bileşenleri çözündürmek için artan miktarda deterjan içeren tamponların kullanımına dayanan sadece deterjan bazlı ^1,2'dir. Bu yöntem hızlı ve kullanışlı olsa da, saf olmayan fraksiyonlarla sonuçlanır. Bunlar, araştırmacıların hücrenin bir veya iki bileşenini kolayca izole etmelerini sağlamak için tasarlanmıştır, ancak aynı anda bir numuneden birden fazla hücre altı fraksiyonu izole edecek kadar karmaşık değildir. Yalnızca deterjanlara güvenmek genellikle membranla kaplı organellere ve plazma zarının ayrım gözetmeksizin çözünmesine neden olur ve bu bileşenlerin ayrılmasını zorlaştırır. Bu kitlerin kullanımından kaynaklanan ek bir komplikasyon, bileşenlerin çoğu tescilli formülasyonlar olduğundan, araştırmacıların belirli uygulamalar için bunları değiştirememesi / optimize edememesidir. Son olarak, bu kitler, daha büyük numuneler için ideal olandan daha az olmasını sağlayan kullanım sayısındaki sınırlamalarla yasaklayıcı bir şekilde pahalı olabilir.

Deterjanlara dayanmayan mitokondrilerin izolasyonu için kitlerin mevcudiyetine rağmen, plazma zarını izole etmek ve standart izolasyon protokollerinden önemli ölçüde daha düşük miktarda numune vermek için tasarlanmamışlardır ^3,4. Diferansiyel santrifüjleme yöntemleri daha fazla zaman alıcı olsa da, genellikle sadece deterjan bazlı kitlerle elde edilemeyen farklı fraksiyonlarla sonuçlanırlar¹. Çözünürleştirici deterjanların tek başına kullanılmadan ayrılması, ultrasantrifüjleme ve izopiknik yoğunluk gradyanları kullanılarak daha fazla saflaştırmaya izin vererek daha az çapraz kontaminasyona neden olur. Bu fraksiyonasyon protokolü, deterjan ve yüksek hızlı santrifüjleme tabanlı yaklaşımların bir kombinasyonunu kullanarak U937 monositlerinden hücre altı fraksiyonların izolasyonunu göstermektedir. Bu yöntem, bir memeli hücresinin nükleer, sitoplazmik, mitokondriyal ve plazma zarı bileşenlerinin, fraksiyonlar arasında minimum kirlenme ile izolasyonunu kolaylaştıracaktır.

Protokol

1. Tamponları ve reaktifleri hazırlayın

1. Fosfataz ve proteaz inhibitörlerinin taze çözeltilerini hazırlayın.
   1. 100 mM'lik bir stok hazırlamak için 1 mL'lik %100 etanol'e 17.4 mg fenilmetansülfonil florür (PMSF) ekleyin.
      NOT: PMSF'yi kullanırken koruyucu ekipman kullanın, çünkü yutulduğunda veya solunduğunda ve cilt veya gözlerle temas ettiğinde tehlikelidir. Gözler ve cilt için aşındırıcıdır.
   2. Üreticinin talimatlarına göre, ticari olarak temin edilebilen bir proteaz inhibitörü kokteyli hazırlayın (100x).
   3. 500 mM'lik bir stok hazırlamak için 1 mL deiyonize suya 91.9 mg sodyum ortovanadat (SOV) ekleyin.
      NOT: SOV'u kullanırken koruyucu ekipman giyin, çünkü yutulması, solunması veya gözlerle temas etmesi durumunda tehlikelidir. Şiddetli aşırı maruz kalma ölümle sonuçlanabilir.
2. Lizis tamponu A, sitoplazmik izolasyon (CI) tamponu, hücre çözünürlükizasyonu (CS) tamponu, nükleer lizis (NL) tamponu, lizis tamponu B, hücre homojenizasyonu (CH) tamponu, iyodiksanol seyreltici ve deterjanlar hazırlayın.
   1. Lizis tamponu A'yı (150 mM NaCl ve 50 mM HEPES'in son konsantrasyonları) hazırlamak için 8.7 g sodyum klorür (NaCl) ve 50 mL 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit (HEPES, 1 M, pH 7.4) ile 950 mL deiyonize su ekleyin.
   2. Deterjanların stok çözeltilerini aşağıdaki gibi hazırlayın: 10 mL lizis tamponu A'ya (% 1 SDS'nin son konsantrasyonu) 0.1 g sodyum dodesil sülfat (SDS) ekleyin, 10 mL lizis tamponu A'ya (% 1'lik son konsantrasyon) 0.1 g sodyum deoksikolat ekleyin, 10 mL lizis tamponu A'ya 2.5 mg digitonin ekleyin (250 μg / mL'lik son konsantrasyon), ve 9 mL lizis tamponu A'ya (son konsantrasyon %10 (v/v)) 1 mL iyonik olmayan, denatüre edici olmayan deterjan ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
   3. 878 μL lizis tamponu A'ya (1 mM PMSF, 1x proteaz inhibitörü (100x), 2 μL SOV stoğu (500 mM) ve 100 μL stok digitonin (250 μg / mL) ekleyerek CI tamponunu hazırlayın (1 mM PMSF'nin son konsantrasyonları, 1x proteaz inhibitörü, 1 mM SOV ve 25 μg / mL digitonin). Hücre peletine eklenene kadar çözeltiyi buz üzerinde tutun.
   4. CS tamponunu, 10 μL PMSF stoğu (100 mM), 10 μL proteaz inhibitörü (100x), 2 μL SOV stoğu (500 mM), 100 μL iyonik olmayan, denatüre olmayan deterjan stoğu ( bkz. Malzeme Tablosu) (% 10) ve 118 μL heksilen glikol stoğu (8.44 M) ila 760 μL lizis tamponu A (1 mM PMSF'nin son konsantrasyonları) ekleyerek CS tamponunu hazırlayın, 1x proteaz inhibitörü, 1 mM SOV,% 1 iyonik olmayan, denatüre olmayan deterjan ve 1 M heksilen glikol). Hücre peletine eklenene kadar çözeltiyi buz üzerinde tutun.
   5. NL tamponunu, 10 μL PMSF stoğu (100 mM), 10 μL proteaz inhibitörü (100x), 2 μL SOV stoğu (500 mM), 50 μL sodyum deoksikolat stoğu (% 10), 100 μL SDS stoğu (% 1) ve 118 μL heksilen glikol stoğu (8.44 M) ila 710 μL lizis tamponu A (1 mM PMSF'nin son konsantrasyonları) ekleyerek NL tamponunu hazırlayın, 1x proteaz inhibitörü, 1 mM SOV,% 0.5 sodyum deoksikolat (v / v),% 0.1 SDS (w / v) ve 1 M heksilen glikol). Nükleer pelet eklenene kadar çözeltiyi buz üzerinde tutun.
   6. 20 mL HEPES (1 M, pH 7.4), 0.74 g potasyum klorür (KCl), 0.19 g magnezyum klorür (MgCl 2), 2 mL etilendiamintetraasetik asit (0.5 M EDTA),₂ mL etilen glikol-bis (β-aminoetil eter)-N, N, N', N'-tetraasetik asit (0.5 M EGTA), 38.3 g mannitol ve 23.9 g sakaroz, 980 mL deiyonize suya rafoz ekleyin (20 mM HEPES'in son konsantrasyonları, 10 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 210 mM mannitol ve 70 mM sakaroz).
   7. 988 μL lizis tamponu B'ye 10 μL PMSF stoğu (100 mM) ve 2 μL SOV stoğu (500 mM) ekleyerek CH tamponunu hazırlayın (1 mM PMSF ve 1 mM SOV'un son konsantrasyonları; son hacmi lize edilen hücre sayısına uyacak şekilde ayarlayın). Hücre peletine eklenene kadar çözeltiyi buz üzerinde tutun.
   8. 12 mL HEPES (1 M, pH 7.4), 447 mg KCl, 114 g MgCl 2, 1.2 mL 0.5 M EDTA,_1.2 mL 0.5 M EGTA, 21.3 g mannitol ve 88 mL deiyonize suya 14.4 g sakkaroz (120 mM HEPES'in son konsantrasyonları, 60 mM KCl, 12 mM MgCl₂, 6 mM EDTA, 6 mM EGTA, 1200 mM mannitol ve 420 mM sakaroz).
   9. Tamponları 4 °C'de ve rakamsal değerleri -20 °C'de saklayın.

2. Sitozolik protein izolasyonu

NOT: Aşağıdaki adımlar, U937 hücrelerinin büyümesine ve genişlemesine ve ardından sitozolik proteinlerin ekstraksiyonuna izin verecektir. Kullanılan konsantrasyonda, digitonin, plazma zarını bozmadan geçirgenleştirerek sitozolik proteinlerin salınmasına ve diğer hücresel proteinlerin tutulmasına izin verir.

1. RPMI 1640'taki hücreleri 37 °C'de %10 fetal sığır serumu ve %5 CO_{2 ile kültürleyin}. Hücrelerin toplam 6 x 10⁸ hücreye kadar büyütüldüğünden emin olun.
   NOT: Bu protokolde, hücreler standart bir hemositometre ve mikroskop kullanılarak sayılmıştır.
2. Kültürlenmiş hücreleri 10 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj edin. Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletini oda sıcaklığında fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 4 × 10⁶ hücre / mL'lik son konsantrasyonda yeniden askıya alın ve kümeleri parçalamak için pipeti nazikçe sıkın.
3. Hücreleri peletlemek için hücre süspansiyonunu 400 × g'da 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatanı atın ve hücre peletini buz gibi soğuk lizis tamponu A'da (adım 1.2.1'de hazırlanan) 2 × 10⁷ hücre / mL'lik son bir konsantrasyonda yeniden askıya alın.
4. Lizis tamponu A'da asılı kalan hücrelerin 7,5 mL'sini çıkarın (3 × 10⁷ hücre) ve nükleer protein ekstraksiyonu için buz üzerinde tutun (bölüm 6). Hücreleri peletlemek için hücre süspansiyonunu 4 ° C, 400 × g'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
   NOT: Sonraki tüm adımları 4 °C'de veya buz üzerinde gerçekleştirin ve tüm tamponları önceden soğutun.
5. Süper natantı atın, hücre peletini CI tamponunda 2 × 10⁷ hücre / mL'lik son bir konsantrasyonda yeniden askıya alın ve kümeleri parçalamak için hafifçe pipet hazırlayın. Hücre süspansiyonunu 20 dakika boyunca 4 °C'de uçtan uca döndürün.
6. Hücre süspansiyonunu 4 °C, 400 × g'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı temiz bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücre peletini kaydedin ve buz üzerinde saklayın. Toplanan süpernatantı 4 ° C, 18.000 × g'da 20 dakika boyunca hücresel kalıntıları pelet etmek için santrifüj yapın.
   NOT: Bu yüksek hızlı santrifüjleme adımı, sitozolik fraksiyonun organel ve membrana bağlı proteinlerle kontaminasyonunu önlemek için kritik öneme sahiptir.
7. Süpernatantı temiz bir santrifüj tüpüne aktardıktan sonra peleti atın. Santrifüjlemeyi takiben pelet elde edilinceye kadar adım 2.6'daki her iki santrifüjleme adımını da tekrarlayın.
8. Sitozolik fraksiyon olan süpernatanı toplayın. Kısa süreli depolama için (1 ay), süpernatantın 4 ° C'de saklandığından emin olun. Uzun süreli depolama için (>1 ay), süpernatantı 1x indirgeyici madde içeren 1x Laemmli tamponu ile birleştirin, 7 dakika boyunca 95 ° C'de ısıtın ve -20 veya -80 ° C'de saklayın.
9. Hücre peletini (adım 2.6'dan itibaren) lizis tamponu A'da 4 × 10⁶ hücre / mL'lik son konsantrasyonda yeniden askıya alın; topakları parçalamak için hafifçe pipet.

3. Hücre homojenizasyonu

NOT: Aşağıdaki adımlar, mitokondriyal ve membran protein fraksiyonlarının izolasyonu için gerekli olan digitonin ile muamele edilmiş hücrelerin (adım 2.9'dan itibaren) mekanik homojenizasyonuna izin verecektir.

1. Hücre süspansiyonunu lizis tamponu A'da (adım 2.9'da hazırlanan) santrifüj yapın, peleti kaydedin ve hücre peletinden fazla digitonin ve sitozolik kirleticileri çıkarmak için süpernatantı atın.
   NOT: Aşırı sitozolik kirleticileri uzaklaştırmak için lizis tamponu A'da tekrarlanan yıkamalar yapılabilir.
2. Hücre peletini buz gibi soğuk CH tamponunda (adım 1.2.7'de hazırlanan) 4 × 10⁶ hücre / mL'lik son bir konsantrasyonda yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
3. Mekanik lizis için boncuk bazlı bir yöntem kullanıyorsanız, 30 g önceden yıkanmış paslanmaz çelik 3,2 mm boncukları 50 mL etekli bir tüpe yerleştirin, 15 mL lizis tamponu B ile doldurun ve soğutmak için buzun üzerine yerleştirin. Bir Sıçrama homojenizatörü kullanıyorsanız (sıkı oturan bir B havanesi ile), uygun miktarda lizis tamponu B ile doldurun, havaneyi yerleştirin ve soğutmak için buzun üzerine yerleştirin.
4. İnkübasyondan sonra (adım 3.2), lizis tamponu B'yi boncuk tüplerinden (veya Zıplayan homojenizatörden) atın ve hücre süspansiyonunun 15 mL'sini boncuk tüpüne (veya homojenizatöre uygun bir hacim) aktarın.
5. Boncuk bazlı yöntemi kullanıyorsanız, hücre süspansiyonunu içeren etekli boncuk tüplerini blender cihazına yerleştirin ve 8 hızında 5 dakika çalışacak şekilde yapılandırın. Bir Zıplama homojenizatörü kullanıyorsanız, buz üzerinde tutun ve yavaş, eşit vuruşlar kullanarak havaneyle 40 geçiş yapın (veya tartışma bölümünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi alternatif bir mekanik hücre lizizi yöntemi kullanın).
   NOT: Burada kullanılandan farklı bir blender cihazı kullanılıyorsa, hız ve zamanın ampirik olarak belirlenmesi gerekebilir.
6. Homojenatı temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj yapın. Süpernatantı temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve kaydedin; peleti atın.
   NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve homojenat kısa süre için (24 saat) 4 °C'de saklanabilir.

4. Ham mitokondriyal ve membran fraksiyonlarının enkaz giderimi ve izolasyonu

NOT: Aşağıdaki adımlar, homojenatın artan hızlarda santrifüj edilmesiyle hücresel kalıntıların giderilmesine izin verecektir. Bunu, ham mitokondriyal ve membran fraksiyonlarının izolasyonu için diferansiyel santrifüjleme izler.

1. Homojenatı (adım 3.6'dan itibaren) 500 × g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve herhangi bir peleti atın.
2. Süpernatantı (adım 4.1'den itibaren) 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1.000 × g'de santrifüj yapın. Süpernatantı temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve herhangi bir peleti atın.
3. Süpernatantı (adım 4.2'den itibaren) 4 ° C'de 10 dakika boyunca 2.000 × g'de santrifüj yapın. Süpernatantı temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve herhangi bir peleti atın.
4. Süpernatantı (adım 4.3'ten itibaren) 4.000 × g'de 4 ° C'de 20 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve ham mitokondriyal fraksiyon olan peleti kaydedin.
5. Süpernatantı (adım 4.4'ten itibaren) 18.000 × g'da 4 ° C'de 1 saat boyunca santrifüj yapın. Süpernatanı atın ve ham membran fraksiyonu olan peleti kaydedin.
   NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve peletlenmiş numuneler kısa süreli (24 saat) 4 °C'de saklanabilir.

5. İzopiknik yoğunluk gradyan saflaştırma

NOT: Aşağıdaki adımlarda, ham mitokondriyal ve membran fraksiyonlarını saflaştırmak için izopiknik yoğunluk gradyanı santrifüjleme kullanılmaktadır.

1. 1 parça seyreltici (adım 1.1.3'te hazırlanan) ile 5 parça iyodiksanol (% 60 stok çözeltisi (w / v)) karıştırarak% 50 (v / v) çalışma çözeltisi hazırlayın. Uygun miktarlarda lizis tamponu B ile% 50 çalışma çözeltisini (v / v) karıştırarak% 10,% 15,% 20,% 25,% 30 ve% 35 iyodiksanol çözeltileri (v / v) hazırlayın.
2. Ham mitokondriyal ve membran peletlerinin (4.4 ve 4.5. basamaklardan) her birini 200 μL lizis tamponu B'de yeniden askıya alın Yeniden askıya alınan peletin 200 μL'sine 1800 μL çalışan iyodiksanol çözeltisi (% 50 (v / v)) ekleyerek% 45 iyodiksanol (v / v) ayarlayın.
3. Aşağıdaki gibi bir iyotiksanol süreksiz gradyanı oluşturun (hacimleri ultrasantrifüj tüpünün kapasitesine uygun şekilde ayarlayın): 8 mL, üstü açık, ince duvarlı ultrasantrifüj tüpünün dibine 1 mL% 15 iyodiksantanol (v / v) ekleyin, ilk katmanın altına 1 mL% 20 iyodiksananol (v / v) yerleştirin (alt döşeme tekniği ile), ardından% 25'lik 1 mL'lik alta yerleştirin, 1 mL% 30 ve 1 mL% 35 iyodiksanol (v / v).
   NOT: Bu adımda 1'i mitokondriyal fraksiyon ve 1'i membran fraksiyonu için olmak üzere 2 gradyan oluşturulmalıdır.
4. 1 gradyanda, ham mitokondriyal peletin 2 mL'sini (% 45 iyodiksanol (v / v)) içinde asılı) altlık tekniğini kullanarak% 35 iyodiksanolün (v / v) altındaki tüpün dibine ekleyin. Diğer gradyanda, ham membran peletinin 2 mL'sini (% 45 iyodiksanol (v / v)) süspansiyonu,% 35 iyodiksanolün (v / v) altındaki tüpün dibine altlık tekniğini kullanarak ekleyin.
5. Her gradyan tüpünün üst kısmına% 15 katmanın üzerine bindirilerek 1 mL% 10 iyodiksanol (v / v) ekleyin. Tüpleri birbirlerinden 0.1 g uzakta% 10 iyodiksanol (v / v) ilavesiyle dengeleyin.
6. Yoğunluk gradyan tüplerini 4 ° C'de 18 saat boyunca 100.000 × g'da döndürün. İvme ve yavaşlamayı, kullanılan ultrasantrifüj için minimum değerlere ayarladığınızdan emin olun.
   NOT: Mitokondriyal gradyanda, arayüzde% 25 ila% 30 iyodiksanol (v / v) arasında görünür bir bant olacaktır. Bu saf mitokondriyal fraksiyondur. Membran gradyanında,% 15 iyodiksanol (v / v) fraksiyonunda görünür bir bant olacaktır. Bu saf membran fraksiyonudur. Membran gradyanındaki %25 ve %30 iyodiksanol (v/v) fraksiyonlarında ek bantlar olabilir. Bu mitokondriyal kontaminasyondur.
7. Görünür bantları içeren fraksiyonun hacmini en aza indirmeye dikkat ederek ve her katman toplandıktan sonra pipet ucunu değiştirerek tüpün üstünden fraksiyonları 1 mL alikotlarda toplayın. Alternatif olarak, ince duvarlı tüpün kenarını bir iğne ile delin ve görünür bantları toplayın.
8. Numuneleri, protein tahlili ve batı lekesi ile doğrulanana kadar adım 2.8'de açıklandığı gibi saklayın.

6. Nükleer protein izolasyonu

NOT: İyonik ve iyonik olmayan deterjanların yanı sıra sonikasyon ve santrifüjleme gibi teknikler kullanarak, aşağıdaki adımlar tüm hücresel zarları çözündürecek ve nükleer proteinlerin izolasyonuna izin verecektir.

1. Lizis tamponu A'da asılı kalan hücrelerin 7.5 mL alikotunu (adım 2.4'ten itibaren) santrifüj edin ve süpernatanı atın. 800 μL buz gibi soğuk CS tamponu ekleyin (adım 1.2.4'te hazırlanmıştır) ve pipetleme ve vorteks yaparak peleti yeniden askıya alın. Nükleer proteinleri korurken plazma ve organel zarlarını bozmak için örnekleri buz üzerinde (veya 4 ° C'de) 30 dakika boyunca inkübe edin.
2. Hücre süspansiyonunu 4 ° C'de 10 dakika boyunca 7.000 × g'da santrifüj edin ve süpernatanı atın. 1U/μL benzonaz eklendikten sonra nükleer pelete 800 μL buz gibi soğuk NL tamponu (adım 1.2.5'te hazırlanmıştır) ekleyin. Pelet'i hafifçe pipetleyerek yeniden askıya alın. Nükleer membranı bozmak için 4 ° C'de 30 dakika boyunca uçtan uca bir rotatör üzerinde inkübe edin.
3. Bir buz banyosunda soğutulan numune tüpleri ile (3x, darbeler arasında 5 s duraklamalı) %20 güçte 5 s için sonikat yapın, benzonaz ile birlikte (adım 6.2'de eklenir), nükleik asitleri keser.
4. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 7,800 × g'de sonikat santrifüj edin. Nükleer fraksiyon olan süpernatanı toplayın ve kurtarın. Supernatant'ı toplarken çözünmez peleti rahatsız etmediğinizden emin olun. Depolama için, numuneler adım 2.8'de açıklandığı gibi hazırlanabilir.

7. Protein miktarı ve batı leke analizi

NOT: Aşağıdaki adımlar, her fraksiyondaki toplam proteini ölçecek ve hücre altı fraksiyonların saflığını doğrulayacaktır.

1. Her fraksiyondaki toplam proteini ölçmek için standart bir Bradford testi yapın. Beklenen protein verimleri için Tablo 1'e bakınız.
   NOT: Bradford testi yerine toplam proteini ölçmek için biskinkoninik asit (BCA) testi veya 280 nm'de absorbans gibi diğer protein tahlilleri kullanılabilir.
2. Fraksiyonları 1x indirgeyici madde içeren 1x Laemmli tamponu ile birleştirin ve 7 dakika boyunca 95 ° C'de ısıtın. Her fraksiyonun 10 μg'sini standart bir SDS-poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) jeline yükleyin ve jeli 1 saat boyunca 20 mA'da çalıştırın.
3. 30 dakika boyunca 100 V'ta standart bir immünoblot transferi gerçekleştirerek çözünmüş proteinleri bir polivinildiflorür (PVDF) membranına aktarın. PVDF membranını, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %0,1 iyonik olmayan deterjan (v/v) içeren 1x Tris tamponlu salin (TBS) içinde %5 sütle bloke edin.
4. Her hücre altı fraksiyona özgü temizlik proteinlerini tespit etmek için uygun birincil antikorları ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Membranı, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca iyonik olmayan deterjanın (v/v) %0,1'ini içeren 1x TBS'de %5 sütle yıkayın.
   NOT: Bu protokol için, sitozolik, nükleer, mitokondriyal ve membran fraksiyonları için sırasıyla gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH, 1:10000), histon H3 (1:2000), voltaja bağımlı anyon kanalı (VDAC, 1:1000) ve Na,K⁺-ATPaz'a karşı antikorlar kullanılmıştır.
5. Uygun yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge sekonjuge sekonder antikorları membrana ekleyin (üreticinin talimatlarına göre seyreltin) ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin. Membranı, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca iyonik olmayan deterjanın (v/v) %0,1'ini içeren 1x TBS'de %5 sütle yıkayın. Standart kemilüminesansı kullanarak lekeyi geliştirin.

Sonuçlar

Bu prosedürün şematik bir akış şeması (Şekil 1), süspansiyonda yetiştirilen U937⁵ hücrelerini başarılı bir şekilde fraksiyone etmek için atılan adımları görsel olarak özetlemektedir. İzopiknik yoğunluk gradyanının tepesinden eşit hacimlerde (1 mL) toplanan fraksiyonlar, mitokondriyal ve membran fraksiyonlarının saflaştırılmasını göstermektedir (Şekil 2). Dış mitokondriyal membran^6'ya<...

Tartışmalar

Bu yöntem, yüksek hızlı santrifüjleme¹¹ kullanılmadan hücre altı fraksiyonasyona yönelik daha önce yayınlanmış bir yaklaşımın değiştirilmiş bir versiyonudur. Bu modifiye yöntem, en iyi sonuçları elde etmek için daha özel ekipman gerektirir, ancak daha kapsamlı ve tutarlı bir şekilde tekrarlanabilir.

İlk protokolün geliştirilmesi, nekroptoz¹² sırasında protein lokalizasyonunun analizi için mitokondriyal ve membran ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	61-BB50-DX
digitonin	Sigma	D141
end-over-end rotator	ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma	E3889
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118
HEPES	VWR	97064-360
Hexylene glycol	Sigma	68340
Igepal	Sigma	I7771	Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl	Sigma	P9333
Mannitol	Sigma	M9647
MgCl2	Sigma	M8266
NaCl	Sigma	S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm	Seton Scientific	7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium	Sigma	D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML
refrigerated centrifuge	ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor	Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	436143
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma	567540
sonicator	ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge	ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm	Next Advance	SSB32
Sucrose	Sigma	S0389
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	97062-370
Tween 20			non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661