等密度勾配精製によるU937細胞の細胞分画

要約

この分画プロトコルにより、研究者は哺乳類細胞から細胞質、核、ミトコンドリア、および膜タンパク質を単離することができます。後者の2つの細胞内画分は、等密度密度勾配を介してさらに精製される。

要約

このプロトコルは、界面活性剤、機械的溶解、および等密度勾配遠心分離の組み合わせを使用して哺乳類細胞から細胞内タンパク質画分を得る方法を記載しています。この手順の主な利点は、細胞内画分を得るために可溶化洗剤の単独使用に依存しないことです。これにより、原形質膜を細胞の他の膜結合オルガネラから分離することができる。この手順は、再現性があり、スケーラブルで、選択的な方法で細胞内のタンパク質局在の決定を容易にします。この方法は、ヒト単球細胞株U937から細胞質、核、ミトコンドリア、および原形質膜タンパク質を単離するために首尾よく使用されています。この手順は、この細胞株用に最適化されているが、他の細胞株の細胞内分画の適切な出発点として役立ち得る。手順の潜在的な落とし穴とそれらを回避する方法、および他の細胞株について考慮する必要があるかもしれない変更について説明します。

概要

細胞内分画は、細胞を溶解し、いくつかの方法でそれらの構成成分に分離する手順です。この技術は、哺乳類細胞におけるタンパク質局在を決定したり、他の方法では検出できない低存在量のタンパク質の濃縮に研究者が使用できます。細胞内分画の方法は現在存在しますが、購入可能な市販のキットと同様に、この手順で克服しようとするいくつかの制限があります。ほとんどの細胞分画法はもっぱら界面活性剤ベースであり^1,2、さまざまな細胞成分を可溶化するために、ますます多くの界面活性剤を含むバッファーの使用に依存しています。この方法は迅速で便利ですが、不純な分数になります。これらは、研究者が細胞の1つまたは2つの成分を簡単に分離できるように設計されていますが、サンプルから複数の細胞内画分を同時に分離するほど複雑ではありません。界面活性剤のみに依存すると、通常、膜に囲まれた細胞小器官と原形質膜が無差別に可溶化され、これらの成分の分離が困難になります。これらのキットの使用による追加の複雑さは、ほとんどのコンポーネントが独自の製剤であるため、研究者が特定のアプリケーション向けにそれらを変更/最適化できないことです。最後に、これらのキットは法外に高価になる可能性があり、使用回数に制限があるため、より大きなサンプルには理想的ではありません。

界面活性剤に依存しないミトコンドリアの単離のためのキットが利用可....

プロトコル

1. バッファーと試薬の調製

1. ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤の新鮮な溶液を調製する。
   1. 17.4 mgのフェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF)を1 mLの100%エタノールに加え、100 mMストックを調製します。
      注意: PMSFを取り扱うときは、摂取または吸入したり、皮膚や目に触れたりすると危険であるため、保護具を着用してください。目や皮膚に腐食性があります。
   2. 製造元の指示に従って、市販のプロテアーゼ阻害剤カクテル(100x)を準備します。
   3. 1 mLの脱イオン水に91.9 mgのオルトバナジン酸ナトリウム(SOV)を加えて、500 mMのストックを調製します。
      注意: SOVは摂取、吸入、または目に入ったときに危険であるため、取り扱うときは保護具を着用してください。重度の過剰暴露は死に至る可能性があります。
2. 溶解バッファーA、細胞質分離(CI)バッファー、細胞可溶化(CS)バッファー、核溶解(NL)バッファー、溶解バッファーB、細胞ホモジナイズ(CH)バッファー、ヨージキサノール希釈液、および界面活性剤を準備します。
   1. 塩化ナトリウム(NaCl)8.7 gおよび4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES、1 M、pH 7.4)50 mLをイオン交換水950 mLに加え、溶解バッファーA(最終濃度150 mM NaClおよび50 mM HEP....

結果

この手順の概略フローチャート(図1)は、懸濁液中で増殖したU937⁵細胞を首尾よく分画するために取られたステップを視覚的に要約する。等量(1mL)の等密度勾配の上部から採取した画分は、ミトコンドリア画分および膜画分の精製を示す(図2)。ミトコンドリア外膜に局在するタンパク質であるVDACに対する抗体を利用する

ディスカッション

この方法は、高速遠心分離を使用せずに細胞内分画を行う以前に発表されたアプローチの修正版^です11。この変更された方法は、最良の結果を達成するためにより特殊な機器を必要としますが、より包括的で一貫して再現性があります。

ネクロトーシス中のタンパク質局在の分析のためにミトコンドリアサンプルと膜サンプルを分離することができない.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	61-BB50-DX
digitonin	Sigma	D141
end-over-end rotator	ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma	E3889
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118
HEPES	VWR	97064-360
Hexylene glycol	Sigma	68340
Igepal	Sigma	I7771	Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl	Sigma	P9333
Mannitol	Sigma	M9647
MgCl2	Sigma	M8266
NaCl	Sigma	S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm	Seton Scientific	7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium	Sigma	D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML
refrigerated centrifuge	ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor	Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	436143
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma	567540
sonicator	ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge	ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm	Next Advance	SSB32
Sucrose	Sigma	S0389
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	97062-370
Tween 20			non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661