等密度勾配精製によるU937細胞の細胞分画

要約

この分画プロトコルにより、研究者は哺乳類細胞から細胞質、核、ミトコンドリア、および膜タンパク質を単離することができます。後者の2つの細胞内画分は、等密度密度勾配を介してさらに精製される。

要約

このプロトコルは、界面活性剤、機械的溶解、および等密度勾配遠心分離の組み合わせを使用して哺乳類細胞から細胞内タンパク質画分を得る方法を記載しています。この手順の主な利点は、細胞内画分を得るために可溶化洗剤の単独使用に依存しないことです。これにより、原形質膜を細胞の他の膜結合オルガネラから分離することができる。この手順は、再現性があり、スケーラブルで、選択的な方法で細胞内のタンパク質局在の決定を容易にします。この方法は、ヒト単球細胞株U937から細胞質、核、ミトコンドリア、および原形質膜タンパク質を単離するために首尾よく使用されています。この手順は、この細胞株用に最適化されているが、他の細胞株の細胞内分画の適切な出発点として役立ち得る。手順の潜在的な落とし穴とそれらを回避する方法、および他の細胞株について考慮する必要があるかもしれない変更について説明します。

概要

細胞内分画は、細胞を溶解し、いくつかの方法でそれらの構成成分に分離する手順です。この技術は、哺乳類細胞におけるタンパク質局在を決定したり、他の方法では検出できない低存在量のタンパク質の濃縮に研究者が使用できます。細胞内分画の方法は現在存在しますが、購入可能な市販のキットと同様に、この手順で克服しようとするいくつかの制限があります。ほとんどの細胞分画法はもっぱら界面活性剤ベースであり^1,2、さまざまな細胞成分を可溶化するために、ますます多くの界面活性剤を含むバッファーの使用に依存しています。この方法は迅速で便利ですが、不純な分数になります。これらは、研究者が細胞の1つまたは2つの成分を簡単に分離できるように設計されていますが、サンプルから複数の細胞内画分を同時に分離するほど複雑ではありません。界面活性剤のみに依存すると、通常、膜に囲まれた細胞小器官と原形質膜が無差別に可溶化され、これらの成分の分離が困難になります。これらのキットの使用による追加の複雑さは、ほとんどのコンポーネントが独自の製剤であるため、研究者が特定のアプリケーション向けにそれらを変更/最適化できないことです。最後に、これらのキットは法外に高価になる可能性があり、使用回数に制限があるため、より大きなサンプルには理想的ではありません。

界面活性剤に依存しないミトコンドリアの単離のためのキットが利用可能であるにもかかわらず、それらは原形質膜を単離するようには設計されておらず、標準的な単離プロトコルよりも有意に少ない量のサンプルを生成する^3,4。差動遠心分離法はより時間がかかりますが、多くの場合、洗剤ベースのキットだけでは得られない明確な画分が得られます¹。可溶化界面活性剤を単独で使用せずに分離することで、超遠心分離と等密度密度勾配を使用したさらなる精製も可能になり、交差汚染が少なくなります。この分画プロトコルは、界面活性剤ベースのアプローチと高速遠心分離ベースのアプローチの組み合わせを使用して、U937単球から細胞内画分を分離することを実証しています。この方法は、画分間の汚染を最小限に抑えながら、哺乳類細胞の核、細胞質、ミトコンドリア、および原形質膜成分の単離を容易にします。

プロトコル

1. バッファーと試薬の調製

1. ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤の新鮮な溶液を調製する。
   1. 17.4 mgのフェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF)を1 mLの100%エタノールに加え、100 mMストックを調製します。
      注意: PMSFを取り扱うときは、摂取または吸入したり、皮膚や目に触れたりすると危険であるため、保護具を着用してください。目や皮膚に腐食性があります。
   2. 製造元の指示に従って、市販のプロテアーゼ阻害剤カクテル(100x)を準備します。
   3. 1 mLの脱イオン水に91.9 mgのオルトバナジン酸ナトリウム(SOV)を加えて、500 mMのストックを調製します。
      注意: SOVは摂取、吸入、または目に入ったときに危険であるため、取り扱うときは保護具を着用してください。重度の過剰暴露は死に至る可能性があります。
2. 溶解バッファーA、細胞質分離(CI)バッファー、細胞可溶化(CS)バッファー、核溶解(NL)バッファー、溶解バッファーB、細胞ホモジナイズ(CH)バッファー、ヨージキサノール希釈液、および界面活性剤を準備します。
   1. 塩化ナトリウム(NaCl)8.7 gおよび4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES、1 M、pH 7.4)50 mLをイオン交換水950 mLに加え、溶解バッファーA(最終濃度150 mM NaClおよび50 mM HEPES)を調製します。
   2. 以下のように洗剤のストック溶液を調製する:10mLの溶解緩衝液A(最終濃度1%SDS)に0.1gのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を加え、10mLの溶解緩衝液A(最終濃度1%)に0.1gのデオキシコール酸ナトリウムを加え、10mLの溶解緩衝液A(最終濃度250μg/mL)に2.5mgのジギトニンを加える。 1 mLの非イオン性、非変性界面活性剤( 材料の表を参照)を9 mLの溶解バッファーA(最終濃度10%(v / v))に加えます。
   3. 878 μLの溶解バッファーA(最終濃度1 mM PMSF、1xプロテアーゼ阻害剤、1 mM SOV、および25 μg/mLジギトニン)に、10 μLのPMSFストック(100 mM)、10 μLのプロテアーゼ阻害剤(100 mM)、2 μLのSOVストック(500 mM)、および100 μLのストックジギトニン(250 μg/mL)を加えて、CIバッファーを調製します。セルペレットに加えるまで溶液を氷上に保ちます。
   4. 10 μLのPMSFストック(100 mM)、10 μLのプロテアーゼ阻害剤(100x)、2 μLのSOVストック(500 mM)、100 μLの非イオン性、非変性界面活性剤ストック( 材料表を参照)(10%)、および118 μLのヘキシレングリコールストック(8.44 M)を760 μLの溶解バッファーA(最終濃度1 mM PMSF、 1xプロテアーゼ阻害剤、1 mM SOV、1%非イオン性、非変性界面活性剤、および1 Mヘキシレングリコール)。セルペレットに加えるまで溶液を氷上に保ちます。
   5. 710 μLの溶解バッファーA(最終濃度1 mM PMSF、 1xプロテアーゼ阻害剤、1 mM SOV、0.5%デオキシコール酸ナトリウム(v / v)、0.1%SDS(w / v)、および1 Mヘキシレングリコール)。核ペレットに加えるまで溶液を氷上に置いてください。
   6. 20 mLのHEPES(1 M、pH 7.4)、0.74 gの塩化カリウム(KCl)、0.19 gの塩化マグネシウム(MgCl 2)、2 mLのエチレンジアミン四酢酸(0.5 M EDTA)、₂ mLのエチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸(0.5 M EGTA)、38.3 gのマンニトール、および23.9 gのスクロースを980 mLの脱イオン水に加え、溶解バッファーB(最終濃度20 mM HEPES、 10 mM KCl、2 mM MgCl₂、1 mM EDTA、1 mM EGTA、210 mM マンニトール、および70 mM スクロース)。
   7. 988 μLの溶解バッファーB(1 mM PMSFおよび1 mM SOVの最終濃度、溶解する細胞数に合わせて最終容量を調整する)に10 μLのPMSFストック(100 mM)および2 μLのSOVストック(500 mM)を加えてCHバッファーを調製します。セルペレットに加えるまで溶液を氷上に保ちます。
   8. 12 mLのHEPES(1 M、pH 7.4)、447 mgのKCl、114 gのMgCl 2、_1.2 mLの0.5 M EDTA、1.2 mLの0.5 M EGTA、21.3 gのマンニトール、および14.4 gのスクロースを88 mLの脱イオン水(最終濃度120 mM HEPES、 60 mM KCl、12 mM MgCl₂、6 mM EDTA、6 mM EGTA、1200 mM マンニトール、および420 mM スクロース)。
   9. バッファーは4°C、ジギトニンは-20°Cで保存します。

2. 細胞質タンパク質の単離

注:次の手順では、U937細胞の増殖と増殖、続いて細胞質タンパク質の抽出が可能になります。使用される濃度では、ジギトニンは原形質膜を破壊することなく透過処理し、細胞質タンパク質の放出および他の細胞タンパク質の保持を可能にする。

1. 細胞をRPMI 1640で10%ウシ胎児血清と共に37°Cおよび5%_CO2で培養する。細胞が最終的に合計6 x 10⁸ 細胞に成長することを確認します。
   注:このプロトコルでは、細胞は標準の血球計算盤と顕微鏡を使用してカウントされました。
2. 培養細胞を400 × g で10分間遠心分離します。上清を廃棄した後、細胞ペレットを終濃度4 ×^{10 6} 細胞/mLの室温リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁し、穏やかにピペットで塊を分解します。
3. 細胞懸濁液を400 × g で10分間遠心分離し、細胞をペレット化します。上清を廃棄し、細胞ペレットを氷冷溶解バッファーA(ステップ1.2.1で調製)に終濃度2 × 10⁷ cells/mLで再懸濁します。
4. 溶解バッファーAに懸濁した7.5 mLの細胞(3 × 10⁷ 細胞)を除去し、核タンパク質抽出のために氷上に保ちます(セクション6)。細胞懸濁液を4°Cで遠心分離し、400× g で10分間、細胞をペレット化した。
   注:後続のすべての手順を4°Cまたは氷上で実行し、すべてのバッファーをプレチルします。
5. 上清を廃棄し、細胞ペレットを最終濃度2 × 10⁷ cells/mLのCIバッファーに再懸濁し、穏やかにピペットで塊を分解します。セル懸濁液を4°Cで20分間回転させます。
6. 細胞懸濁液を4°Cで400× gで 10分間遠心分離し、上清をきれいな遠沈管に移した。セルペレットを保存し、氷上に保存します。回収した上清を4°C、18,000× g で20分間遠心分離し、細胞残渣をペレット化した。
   注:この高速遠心分離ステップは、細胞小器官および膜結合タンパク質による細胞質画分の汚染を防ぐために重要です。
7. 上清を清潔な遠沈管に移した後、ペレットを捨てる。遠心分離後にペレットが得られなくなるまで、ステップ2.6の両方の遠心分離ステップを繰り返します。
8. 細胞質画分である上清を集める。短期保存(1ヶ月)の場合は、上清が4°Cで保存されていることを確認してください。 長期保存(>1ヶ月)の場合は、上清を1x還元剤を含む1xLaemmli緩衝液と混合し、95°Cで7分間加熱し、-20または-80°Cで保存します。
9. 細胞ペレット(ステップ2.6から)を最終濃度4 ×^{10 6} 細胞/mLの溶解バッファーAに再懸濁します。塊を砕くために穏やかにピペット。

3. 細胞の均質化

注:以下のステップは、ミトコンドリアおよび膜タンパク質画分の単離に必要なジギトニン処理細胞の機械的均質化(ステップ2.9から)を可能にする。

1. 細胞懸濁液を溶解緩衝液A(ステップ2.9で調製)で遠心分離し、ペレットを保存し、上清を廃棄して、細胞ペレットから過剰なジギトニンおよび細胞質夾雑物を除去した。
   注:溶解バッファーAで繰り返し洗浄を行って、過剰な細胞質汚染物質を除去することができます。
2. 細胞ペレットを氷冷CHバッファー(ステップ1.2.7で調製)に最終濃度4×10⁶ 細胞/mLで再懸濁します。細胞懸濁液を氷上で30分間インキュベートする。
3. 機械的溶解にビーズベースの方法を使用する場合は、30 gの事前に洗浄したステンレス鋼3.2 mmビーズを50 mLのスカート付きチューブに入れ、15 mLの溶解バッファーBを充填し、氷上に置いて冷却します。Dounceホモジナイザー(ぴったりとフィットするB乳棒付き)を使用する場合は、適量の溶解バッファーBを満たし、乳棒を挿入し、氷の上に置いて冷やします。.
4. インキュベーション後(ステップ3.2)、ビーズチューブ(またはダウンスホモジナイザー)から溶解バッファーBを捨て、15 mLの細胞懸濁液をビーズチューブ(または適切な容量をホモジナイザー)に移します。
5. ビーズベースの方法を用いる場合は、細胞懸濁液を含むスカート付きビーズチューブをブレンダー装置に入れ、速度8で5分間実行するように構成する。Dounceホモジナイザーを使用する場合は、氷上に保ち、ゆっくりと均一なストロークを使用して乳棒で40パスを実行します(または、ディスカッションセクションで詳しく説明されているように、機械的細胞溶解の代替方法を利用します)。
   注意: ここで使用しているものとは異なるブレンダーデバイスを使用する場合は、速度と時間を経験的に決定する必要がある場合があります。
6. ホモジネートを清潔な遠沈管に移し、400 × g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清をきれいな遠心チューブに移して保存します。ペレットを捨てます。
   注:プロトコルはここで一時停止し、ホモジネートを4°Cで短期間(24時間)保存できます。

4.粗ミトコンドリアおよび膜画分の破片除去と分離

注:次の手順では、ホモジネートを高速で遠心分離することにより、細胞の破片を除去できます。これに続いて、粗ミトコンドリア画分および膜画分を単離するための差動遠心分離が行われます。

1. ホモジネート(ステップ3.6から)を500 × g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を清潔な遠沈管に移し、ペレットを廃棄します。
2. 上清(ステップ4.1から)を1,000 × g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を清潔な遠沈管に移し、ペレットを廃棄します。
3. 上清(ステップ4.2から)を2,000 × g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を清潔な遠沈管に移し、ペレットを廃棄します。
4. 上清(ステップ4.3から)を4,000 × g で4°Cで20分間遠心分離します。 上清をきれいな遠沈管に移し、 粗ミトコンドリア画分であるペレットを保存します。
5. 上清(ステップ4.4から)を18,000 × g で4°Cで1時間遠心分離します。 上清を捨て、 粗膜画分であるペレットを保存する。
   注:プロトコルはここで一時停止し、ペレット化されたサンプルを4°Cで短期間(24時間)保存できます。

5. 等圧密度勾配精製

注:次の手順では、等密度密度勾配遠心分離を利用して、粗ミトコンドリアおよび膜画分を精製します。

1. 1部の希釈液(ステップ1.1.3で調製)と5部のヨージキサノール(60%ストック溶液(w / v))を混合することにより、ヨージキサノールの50%(v / v) 作業溶液を 調製します。50%作業溶液(v/v)と溶解バッファーBを適量混合することにより、10%、15%、20%、25%、30%、および35%のヨージキサノール溶液(v/v)を調製します。
2. 粗ミトコンドリアペレットと膜ペレット(ステップ4.4および4.5から)をそれぞれ200 μLの溶解バッファーBに再懸濁します。 1800 μLの作業用ヨージキサノール溶液(50%(v / v))を再懸濁したペレット200 μLに加えて、45%ヨージキサノール(v / v)に調整します。
3. 次のようにヨージキサノール不連続勾配を作成します(超遠心管の容量に応じて容量を調整します)。 1 mLの15%ヨージキサノール(v / v)を8 mLのオープントップ薄肉超遠心チューブの底に加え、1 mLの20%ヨージキサノール(v / v)を最初の層の下に置き(下敷き技術による)、続いて1 mLの25%を下敷きにします。 1 mLの30%、および1 mLの35%ヨージキサノール(v / v)。
   注:このステップでは、ミトコンドリア画分用に1つ、膜画分用に1つの2つのグラデーションを作成する必要があります。
4. 1グラジエントで、アンダーレイ技術を使用して2 mLの粗ミトコンドリアペレット(45%ヨージキサノール(v / v)に懸濁)を35%ヨージキサノール(v / v)の下のチューブの底に追加します。もう一方の勾配では、下敷き技術を使用して2 mLの粗膜ペレット(45%ヨージキサノール(v / v)に懸濁)を35%ヨージキサノール(v / v)の下のチューブの底に追加します。
5. 10%ヨージキサノール(v / v)を15%層の上に重ねて、各グラジエントチューブの上部に1mL加えます。10%ヨージキサノール(v / v)を添加して、チューブを互いに0.1g以内でバランスさせます。
6. 密度勾配チューブを4°Cで100,000 × gで18時間回転させます。必ず加減速は、使用する超遠心分離機の最小値に設定してください。
   注:ミトコンドリア勾配では、25%と30%のヨージキサノール(v / v)の間の界面に目に見えるバンドがあります。これは 純粋なミトコンドリア画分です。膜勾配では、15%ヨージキサノール(v / v)画分に目に見えるバンドがあります。これが 純粋な膜画分です。膜勾配の25%および30%ヨージキサノール(v / v)画分に追加のバンドが存在する可能性があります。これはミトコンドリア汚染です。
7. チューブの上部から1 mLのアリコートでフラクションを収集し、目に見えるバンドを含むフラクションの容量を最小限に抑えるように注意し、各層を収集した後にピペットチップを交換します。または、薄肉チューブの側面に針で穴を開け、目に見えるバンドを収集します。
8. ステップ2.8に記載のようにサンプルを、タンパク質アッセイおよびウェスタンブロットによる検証まで保存する。

6. 核タンパク質の単離

注:イオン性および非イオン性界面活性剤、ならびに超音波処理および遠心分離などの技術を使用して、次のステップはすべての細胞膜を可溶化し、核タンパク質の単離を可能にする。

1. 溶解バッファーAに懸濁した細胞の7.5 mLアリコートを遠心分離し(ステップ2.4から)、上清を廃棄します。800 μLの氷冷CSバッファー(ステップ1.2.4で調製)を加え、ピペッティングとボルテックスによってペレットを再懸濁します。サンプルを氷上(または4°C)で30分間インキュベートし、核タンパク質を保護しながら血漿膜とオルガネラ膜を破壊します。
2. 細胞懸濁液を7,000 × g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を捨てる。1U/μLのベンゾナーゼを含有させた後、800 μLの氷冷NLバッファー(ステップ1.2.5で調製)を核ペレットに加えます。穏やかにピペッティングしてペレットを再懸濁します。エンドオーバーエンドローテーターで4°Cで30分間インキュベートし、核膜を破壊します。
3. 氷浴(3x、パルス間で5秒の休止)で冷却されたサンプルチューブで20%の電力で5秒間超音波処理し、ベンゾナーゼ(ステップ6.2で追加)とともに核酸を剪断します。
4. 超音波処理物を7,800 × g で4°Cで10分間遠心分離します。 核画分である上清を集めて保存します。上清を回収する際に不溶性ペレットを乱さないように注意してください。保存のために、サンプルは、ステップ2.8に記載されるように調製することができる。

7. タンパク質定量とウェスタンブロット解析

注:次の手順では、各画分の総タンパク質を定量し、細胞内画分の純度を確認します。

1. 標準的なブラッドフォードアッセイを実行して、各画分の総タンパク質を定量します。予想されるタンパク質収量については 、表1 を参照してください。
   注:ビシンコニン酸(BCA)アッセイや280 nmの吸光度などの他のタンパク質アッセイを使用して、ブラッドフォードアッセイの代わりに総タンパク質を測定することができます。
2. フラクションを1x還元剤を含む1x Laemmliバッファーと混合し、95°Cで7分間加熱します。各画分10 μgを標準SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)ゲルにロードし、ゲルを20 mAで1時間実行します。
3. 分解したタンパク質をポリビニルジフルオリド(PVDF)メンブレンに移すには、標準的なイムノブロット転写を100 Vで30分間行います。0.1%の非イオン性界面活性剤(v/v)を含む1xトリス緩衝生理食塩水(TBS)中の5%ミルクで室温で30分間、PVDFメンブレンをブロックします。
4. 各細胞内画分に特異的なハウスキーピングタンパク質を検出するための適切な一次抗体を添加し、4°Cで一晩インキュベートします。 0.1%の非イオン性洗剤(v / v)を含む1x TBSで5%ミルクでメンブレンを室温で10分間洗浄します。
   注:このプロトコルでは、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH、1:10000)、ヒストンH3(1:2000)、電位依存性アニオンチャネル(VDAC、1:1000)、およびNa、K⁺-ATPaseに対する抗体を、それぞれ細胞質画分、核画分、ミトコンドリア画分、および膜画分に使用しました。
5. 西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体を適切なメンブレンに加え(製造元の指示に従って希釈)、室温で1時間インキュベートします。0.1%の非イオン性洗剤(v / v)を含む1x TBSで5%ミルクでメンブレンを室温で10分間洗浄します。標準的な化学発光を使用してブロットを開発します。

結果

この手順の概略フローチャート(図1)は、懸濁液中で増殖したU937⁵細胞を首尾よく分画するために取られたステップを視覚的に要約する。等量(1mL)の等密度勾配の上部から採取した画分は、ミトコンドリア画分および膜画分の精製を示す(図2)。ミトコンドリア外膜に局在するタンパク質であるVDACに対する抗体を利用する

ディスカッション

この方法は、高速遠心分離を使用せずに細胞内分画を行う以前に発表されたアプローチの修正版^です11。この変更された方法は、最良の結果を達成するためにより特殊な機器を必要としますが、より包括的で一貫して再現性があります。

ネクロトーシス中のタンパク質局在の分析のためにミトコンドリアサンプルと膜サンプルを分離することができない...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	61-BB50-DX
digitonin	Sigma	D141
end-over-end rotator	ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma	E3889
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118
HEPES	VWR	97064-360
Hexylene glycol	Sigma	68340
Igepal	Sigma	I7771	Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl	Sigma	P9333
Mannitol	Sigma	M9647
MgCl2	Sigma	M8266
NaCl	Sigma	S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm	Seton Scientific	7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium	Sigma	D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML
refrigerated centrifuge	ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor	Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	436143
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma	567540
sonicator	ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge	ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm	Next Advance	SSB32
Sucrose	Sigma	S0389
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	97062-370
Tween 20			non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661