通过等密度梯度纯化对U937细胞进行细胞分级分离

摘要

该分级分离方案将使研究人员能够从哺乳动物细胞中分离细胞质、核、线粒体和膜蛋白。后两个亚细胞级分通过等密度梯度进一步纯化。

摘要

该协议描述了使用洗涤剂，机械裂解和等密度梯度离心的组合从哺乳动物细胞中获得亚细胞蛋白级分的方法。该程序的主要优点是它不依赖于仅使用增溶去垢剂来获得亚细胞级分。这使得可以将质膜与细胞的其他膜结合细胞器分离。该程序将有助于使用可重复，可扩展和选择性的方法确定细胞中的蛋白质定位。该方法已成功用于从人单核细胞系U937中分离胞质蛋白、核蛋白、线粒体蛋白和质膜蛋白。尽管针对该细胞系进行了优化，但该过程可以作为其他细胞系亚细胞分离的合适起点。讨论了该程序的潜在陷阱以及如何避免它们，以及可能需要考虑其他细胞系的改变。

引言

亚细胞分级分离是通过多种方法裂解细胞并将其分离成其组成成分的过程。研究人员可以使用这种技术来确定哺乳动物细胞中的蛋白质定位或富集否则无法检测到的低丰度蛋白质。虽然目前存在亚细胞分离的方法，也可以购买商业试剂盒，但它们受到该程序试图克服的几个限制。大多数细胞分级分离方法^{完全基于洗涤}剂1，2^，依赖于使用含有越来越多的去垢剂的缓冲液来溶解不同的细胞成分。虽然这种方法快速方便，但它会导致不纯的馏分。这些旨在使研究人员能够轻松分离细胞的一种或两种成分，但还不够复杂，无法同时从样品中分离出多个亚细胞组分。仅依靠洗涤剂通常会导致膜封闭的细胞器和质膜被不加选择地溶解，从而使这些成分的分离变得困难。使用这些试剂盒的另一个复杂因素是研究人员无法针对特定应用对其进行更改/优化，因为大多数组件都是专有配方。最后，这些试剂盒可能非常昂贵，使用次数有限，因此对于较大样品来说不太理想。

尽管有不依赖去垢剂的线粒体分离试剂盒，但它们并非设计用于分离质膜，并且产生的样品量明显低于标准分离方案^3，4。虽然差速离心方法更耗时，但它们通常会产生不同的馏分，而仅使用基于洗涤剂的试剂盒无法获得¹。无需单独使用增溶去垢剂的分离还允许使用超速离心和等密度梯度进一步纯化，从而减少交叉污染。该分级分离方案展示了使用基于去垢剂和高速离心的方法的组合从U937单核细胞中分离亚细胞级分。该方法将有助于分离哺乳动物细胞的核、细胞质、线粒体和质膜成分，而馏分之间的污染最小。

研究方案

1. 制备缓冲液和试剂

1. 准备磷酸酶和蛋白酶抑制剂的新鲜溶液。
   1. 将 17.4 mg 苯甲磺酰氟 （PMSF） 加入 1 mL 100% 乙醇中以制备 100 mM 储备液。
      注意:处理PMSF时应穿戴防护设备，因为摄入或吸入以及接触皮肤或眼睛时是危险的。对眼睛和皮肤有腐蚀性。
   2. 根据制造商的说明，准备市售蛋白酶抑制剂混合物（100x）。
   3. 将 91.9 mg 原钒酸钠 （SOV） 加入 1 mL 去离子水中以制备 500 mM 储备液。
      注意:处理 SOV 时请穿戴防护设备，因为摄入、吸入或接触眼睛时会很危险。严重的过度暴露可能导致死亡。
2. 制备裂解缓冲液 A、细胞质分离 （CI） 缓冲液、细胞增溶 （CS） 缓冲液、核裂解 （NL） 缓冲液、裂解缓冲液 B、细胞匀浆 （CH） 缓冲液、碘二醇稀释剂和去垢剂。
   1. 将 8.7 g 氯化钠 （NaCl） 和 50 mL 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸（HEPES，1 M，pH 7.4）加入 950 mL 去离子水中，制备裂解缓冲液 A（终浓度为 150 mM NaCl 和 50 mM HEPES）。
   2. 按如下方式制备洗涤剂储备溶液:将0.1g十二烷基硫酸钠（SDS）加入10mL裂解缓冲液A（终浓度为1% SDS）中，将0.1g脱氧胆酸钠加入10 mL裂解缓冲液A（终浓度为1%），将2.5mg洋地黄皂苷加入10mL裂解缓冲液A中（终浓度为250μg/ mL）， 并将 1 mL 非离子、非变性洗涤剂（参见 材料表）加入 9 mL 裂解缓冲液 A（终浓度为 10% （v/v））中。
   3. 通过将 10 μL PMSF 储备液 （100 mM）、10 μL 蛋白酶抑制剂 （100x）、2 μL SOV 储备液 （500 mM） 和 100 μL 洋地黄皂苷原液 （250 μg/mL） 添加到 878 μL 裂解缓冲液 A（终浓度为 1 mM PMSF、1x 蛋白酶抑制剂、1 mM SOV 和 25 μg/mL 洋地黄皂苷）中制备 CI 缓冲液。将溶液保持在冰上，直到加入细胞沉淀。
   4. 通过向 760 μL 裂解缓冲液 A 中加入 10 μL PMSF 原液 （100 mM）、10 μL 蛋白酶抑制剂 （100x）、2 μL SOV 原液 （500 mM）、100 μL 非离子、非变性洗涤剂原液（参见 材料表）（10%）和 118 μL 己二醇原液 （8.44 M） 至 760 μL 裂解缓冲液 A（终浓度为 1 mM PMSF， 1x 蛋白酶抑制剂、1 mM SOV、1% 非离子、非变性洗涤剂和 1 M 己二醇）。将溶液保持在冰上，直到加入细胞沉淀。
   5. 通过将 10 μL PMSF 储备液 （100 mM）、10 μL 蛋白酶抑制剂 （100x）、2 μL SOV 储备液 （500 mM）、50 μL 脱氧胆酸钠储备液 （10%）、100 μL SDS 储备液 （1%） 和 118 μL 己二醇储备液 （8.44 M） 加入 710 μL 裂解缓冲液 A（终浓度为 1 mM PMSF， 1x 蛋白酶抑制剂、1 mM SOV、0.5% 脱氧胆酸钠 （v/v）、0.1% SDS （w/v） 和 1 M 己二醇）。将溶液放在冰上，直到加入核颗粒。
   6. 将 20 mL HEPES（1 M，pH 7.4）、0.74 g 氯化钾 （KCl）、0.19 g 氯化镁 （MgCl 2）、2 mL 乙二胺四乙酸 （0.5 M EDTA）、₂ mL 乙二醇-双（β-氨基乙醚）-N，N，N'，N'-四乙酸 （0.5 M EGTA）、38.3 g 甘露醇和 23.9 g 蔗糖加入 980 mL 去离子水中制备裂解缓冲液 B（终浓度为 20 mM HEPES， 10 mM KCl、2 mM MgCl₂、1 mM EDTA、1 mM EGTA、210 mM 甘露醇和 70 mM 蔗糖）。
   7. 通过将 10 μL PMSF 原液 （100 mM） 和 2 μL SOV 原液 （500 mM） 加入 988 μL 裂解缓冲液 B（终浓度为 1 mM PMSF 和 1 mM SOV;调整最终体积以适应被裂解的细胞数量）来制备 CH 缓冲液。将溶液保持在冰上，直到加入细胞沉淀。
   8. 通过将 12 mL HEPES（1 M，pH 7.4）、447 mg KCl、114 g MgCl 2、_1.2 mL 0.5 M EDTA、1.2 mL 0.5 M EGTA、21.3 g 甘露醇和 14.4 g 蔗糖加入 88 mL 去离子水（终浓度为 120 mM HEPES， 60 mM KCl、12 mM MgCl₂、6 mM EDTA、6 mM EGTA、1200 mM 甘露醇和 420 mM 蔗糖）。
   9. 将缓冲液储存在4°C，洋地黄皂苷储存在-20°C。

2. 胞质蛋白分离

注意:以下步骤将允许U937细胞的生长和扩增，然后提取胞质蛋白。在使用的浓度下，洋地黄皂苷将渗透质膜而不会破坏它，从而释放胞质蛋白并保留其他细胞蛋白。

1. 在RPMI 1640中用10%胎牛血清在37°C和5%CO₂中培养细胞。确保细胞生长到最终总共 6 x 10^{8 个} 细胞。
   注意:在该协议中，使用标准血细胞计数器和显微镜对细胞进行计数。
2. 将培养的细胞以400 ×g 离心10分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于室温磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，终浓度为4×10⁶ 个细胞/ mL，并轻轻移液以分解团块。
3. 将细胞悬液以400× g 离心10分钟以沉淀细胞。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于冰冷的裂解缓冲液A（在步骤1.2.1中制备）中，终浓度为2×10⁷ 个细胞/ mL。
4. 取出 7.5 mL 悬浮在裂解缓冲液 A 中的细胞（3 × 10⁷ 个细胞），并保持在冰上进行核蛋白提取（第 6 节）。将细胞悬液在4°C，400× g 离心10分钟以沉淀细胞。
   注意:在4°C或冰上执行所有后续步骤，并预冷所有缓冲液。
5. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于CI缓冲液中，终浓度为2×10⁷ 个细胞/ mL，然后轻轻移液以分解团块。在4°C下将细胞悬液首尾相连旋转20分钟。
6. 将细胞悬液在4°C，400× g 下离心10分钟，并将上清液转移到干净的离心管中。保存细胞沉淀，并储存在冰上。将收集的上清液在4°C，18，000× g 下离心20分钟以沉淀细胞碎片。
   注意:这种高速离心步骤对于防止细胞器和膜结合蛋白污染胞质部分至关重要。
7. 将上清液转移到干净的离心管中后丢弃沉淀。重复步骤2.6中的两个离心步骤，直到离心后没有获得沉淀。
8. 收集上清液，即 胞质级分。对于短期储存（1个月），确保上清液储存在4°C。 对于长期储存（>1个月），将上清液与含有1x还原剂的1x Laemmli缓冲液混合，在95°C下加热7分钟，并在-20或-80°C下储存。
9. 将细胞沉淀（来自步骤2.6）重悬于裂解缓冲液A中，终浓度为4×10⁶ 个细胞/ mL;轻轻移液以分解团块。

3. 细胞均质化

注意:以下步骤将允许洋地黄皂苷处理的细胞的机械均质化（从步骤2.9开始），这对于分离线粒体和膜蛋白组分是必需的。

1. 在裂解缓冲液A（在步骤2.9中制备）中离心细胞悬液，保存沉淀，弃去上清液以从细胞沉淀中去除多余的洋地黄皂苷和胞质污染物。
   注意:可以在裂解缓冲液A中进行重复洗涤以去除多余的胞质污染物。
2. 将细胞沉淀重悬于冰冷的CH缓冲液（在步骤1.2.7中制备）中，终浓度为4×10⁶ 个细胞/ mL。将细胞悬液在冰上孵育30分钟。
3. 如果使用基于磁珠的方法进行机械裂解，请将 30 g 预洗的不锈钢 3.2 mm 磁珠放入 50 mL 裙边管中，填充 15 mL 裂解缓冲液 B，然后放在冰上冷却。如果使用Dounce均质器（带有紧密贴合的B杵），请填充适当体积的裂解缓冲液B，插入杵，然后放在冰上冷却。
4. 孵育后（步骤3.2），从磁珠管（或Dounce均质器）中弃去裂解缓冲液B，并将15mL的细胞悬液转移到磁珠管中（或将适当体积转移到匀浆器中）。
5. 如果使用基于磁珠的方法，则将含有细胞悬液的裙边珠管放入搅拌机装置中，并配置为以速度8运行5分钟。如果使用 Dounce 均质器，请将其放在冰上，并使用缓慢、均匀的笔划用杵进行 40 次通过（或使用讨论部分详述的机械细胞裂解的替代方法）。
   注意:如果使用与此处使用的搅拌机设备不同的搅拌机设备，则可能需要根据经验确定速度和时间。
6. 将匀浆转移到干净的离心管中，并在4°C下以400× g 离心10分钟。 将上清液转移到干净的离心管中并保存;丢弃颗粒。
   注意:方案可以在这里暂停，匀浆在4°C下短期储存（24小时）。

4. 粗线粒体和膜组分的碎片去除和分离

注意:以下步骤将允许通过以更高的速度离心匀浆来去除细胞碎片。接下来是差速离心，用于分离粗线粒体和膜组分。

1. 将匀浆（来自步骤3.6）在4°C下以500× g 离心10分钟。 将上清液转移到干净的离心管中，并丢弃任何沉淀。
2. 将上清液（来自步骤4.1）在4°C下以1，000× g 离心10分钟。 将上清液转移到干净的离心管中，并丢弃任何沉淀。
3. 将上清液（来自步骤4.2）在4°C下以2，000× g 离心10分钟。 将上清液转移到干净的离心管中，并丢弃任何沉淀。
4. 将上清液（来自步骤4.3）在4°C下以4，000× g 离心20分钟。 将上清液转移到干净的离心管中，并保存沉淀，即 粗线粒体级分。
5. 将上清液（来自步骤4.4）在4°C下以18，000× g 离心1小时。 弃去上清液，保存沉淀，即 粗膜级分。
   注意:协议可以在此处暂停，并将沉淀样品短期（24小时）储存在4°C。

5. 等密度梯度纯化

注意:以下步骤利用等密度梯度离心来纯化粗线粒体和膜组分。

1. 通过将1份稀释剂（在步骤1.1.3中制备）与5份碘沙醇（60%储备溶液（w / v））混合来制备50%（v / v）的碘沙醇 工作溶液 。通过将50%工作溶液（v / v）与适量的裂解缓冲液B混合，制备10%，15%，20%，25%，30%和35%碘沙醇溶液（v / v）。
2. 将粗线粒体和膜沉淀（来自步骤4.4和4.5）分别重悬于200μL裂解缓冲液B中.通过将1800μL工作碘沙醇溶液（50%（v / v））添加到200μL重悬沉淀中，调节至45%碘沙醇（v / v）。
3. 创建碘沙醇不连续梯度，如下所示（根据超速离心管的容量调整体积）:将 1 mL 的 15% 碘沙醇 （v/v） 加入 8 mL 开顶薄壁超速离心管的底部，将 1 mL 20% 碘沙醇 （v/v） 置于第一层下方（通过底层技术），然后底层 1 mL 的 25%， 1 mL 的 30% 和 1 mL 的 35% 碘沙醇 （v/v）。
   注意:在此步骤中应创建2个梯度，1个用于线粒体部分，1个用于膜部分。
4. 在 1 个梯度中，使用垫层技术将 2 mL 粗线粒体沉淀（悬浮在 45% 碘沙醇 （v/v） 中）添加到 35% 碘沙醇 （v/v） 下方的管底部。在另一个梯度中，使用垫层技术将 2 mL 的粗膜颗粒（悬浮在 45% 碘沙醇 （v/v） 中）添加到管底部低于 35% 碘沙醇 （v/v）。
5. 将 1 mL 的 10% 碘沙醇 （v/v） 覆盖在每个梯度管的顶部，将其覆盖在 15% 层的顶部。通过添加10%碘沙醇（v / v）在0.1g内平衡试管。
6. 在4°C下以100，000× g旋转密度梯度管18小时。确保将加速和减速设置为所用超速离心机的最小值。
   注意:在线粒体梯度中，在25%和30%碘沙醇（v / v）之间的界面处将有一个可见的带。这是 纯线粒体部分。在膜梯度中，在15%碘沙醇（v / v）馏分中将有一个可见的条带。这是 纯膜部分。膜梯度中的 25% 和 30% 碘沙醇 （v/v） 部分可能存在额外的条带。这是线粒体污染。
7. 以 1 mL 等分试样从管顶部收集馏分，注意尽量减少包含可见条带的馏分的体积，并在收集每层后更换移液器吸头。或者，用针刺穿薄壁管的侧面，并收集可见的条带。
8. 按照步骤2.8中所述储存样品，直到通过蛋白质测定和蛋白质印迹进行验证。

6. 核蛋白分离

注意:使用离子和非离子去垢剂以及超声和离心等技术，以下步骤将溶解所有细胞膜并允许分离核蛋白。

1. 离心悬浮在裂解缓冲液A中的7.5mL等分试样细胞（来自步骤2.4），并弃去上清液。加入 800 μL 冰冷的 CS 缓冲液（在步骤 1.2.4 中制备），并通过移液和涡旋重悬沉淀。将样品在冰上（或在4°C）孵育30分钟以破坏血浆和细胞器膜，同时保护核蛋白。
2. 将细胞悬液在4°C下以7，000× g 离心10分钟，并弃去上清液。加入 800 μL 冰冷的 NL 缓冲液（在步骤 1.2.5 中制备）加入核沉淀中，加入 1U/μL 苯并酶。通过轻轻移液重悬沉淀。在4°C下在端对端旋转器上孵育30分钟以破坏核膜。
3. 用在冰浴中冷却的样品管（3x，脉冲之间有5秒的暂停）以20%的功率超声处理5秒，与苯并酶（在步骤6.2中添加）一起剪切核酸。
4. 将超声处理物在4°C下以7，800× g 离心10分钟。 收集并保存上清液，即 核部分。收集上清液时，确保不要干扰不溶性沉淀。为了储存，可以按照步骤2.8中的说明制备样品。

7. 蛋白质定量和蛋白质印迹分析

注意:以下步骤将量化每个级分中的总蛋白并确认亚细胞级分的纯度。

1. 执行标准的布拉德福德测定以量化每个级分中的总蛋白。有关预期的蛋白质产量，请参阅 表1 。
   注意:其他蛋白质测定，例如二辛可宁酸（BCA）测定或280nm处的吸光度可用于测量总蛋白质，以代替Bradford测定。
2. 将馏分与含有1x还原剂的1x Laemmli缓冲液混合，并在95°C下加热7分钟。将每个级分的10μg加载到标准SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶中，并在20mA下运行凝胶1小时。
3. 通过在100 V下进行标准免疫印迹转印30分钟，将分离的蛋白质转移到聚二氟乙烯（PVDF）膜上。在室温下，在含有0.1%非离子洗涤剂（v / v）的1x Tris缓冲盐水（TBS）中用5%牛奶封闭PVDF膜30分钟。
4. 加入适当的一抗以检测每个亚细胞组分特异性的管家蛋白，并在4°C下孵育过夜。 在室温下用含有0.1%非离子洗涤剂（v / v）的1x TBS中的5%牛奶洗涤膜10分钟。
   注意:对于该协议，针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，1:10000），组蛋白H3（1:2000），电压依赖性阴离子通道（VDAC，1:1000）和Na，K ⁺ - ATP酶的抗体分别用于胞质，核，线粒体和膜组分。
5. 向膜上加入适当的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗（根据制造商的说明稀释），并在室温下孵育1小时。在室温下用含有0.1%非离子洗涤剂（v / v）的1x TBS中的5%牛奶洗涤膜10分钟。使用标准化学发光显影印迹。

结果

该过程的示意图流程图（图1）直观地总结了成功分级分离悬浮生长的U937⁵ 细胞的步骤。从等密度梯度顶部以等体积（1 mL）收集的级分显示了线粒体和膜组分的纯化（图2）。利用针对VDAC（一种定位于线粒^体外膜6的蛋白质）的抗体，表明线粒体部分迁移到25%和30%碘沙醇（v / v）部分（图2A）。使?...

讨论

该方法是先前发表的亚细胞分级分离方法的修改版本，无需使用高速离心¹¹。这种改进的方法需要更专业的设备才能获得最佳结果，但更全面且可重复性一致。

由于无法分离线粒体和膜样品以分析坏死性凋亡期间的蛋白质定位，因此有必要开发初始方案¹²。尝试使用大多数市售试剂盒中发现的完全基于洗涤剂的方法，导致含有质膜和细胞中?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	61-BB50-DX
digitonin	Sigma	D141
end-over-end rotator	ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma	E3889
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118
HEPES	VWR	97064-360
Hexylene glycol	Sigma	68340
Igepal	Sigma	I7771	Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl	Sigma	P9333
Mannitol	Sigma	M9647
MgCl2	Sigma	M8266
NaCl	Sigma	S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm	Seton Scientific	7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium	Sigma	D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML
refrigerated centrifuge	ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor	Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	436143
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma	567540
sonicator	ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge	ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm	Next Advance	SSB32
Sucrose	Sigma	S0389
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	97062-370
Tween 20			non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661