Zellfraktionierung von U937-Zellen durch isopyknische Dichtegradientenreinigung

Zusammenfassung

Dieses Fraktionierungsprotokoll wird es Forschern ermöglichen, zytoplasmatische, nukleare, mitochondriale und Membranproteine aus Säugetierzellen zu isolieren. Die beiden letztgenannten subzellulären Fraktionen werden über einen isopyknischen Dichtegradienten weiter gereinigt.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Gewinnung subzellulärer Proteinfraktionen aus Säugetierzellen unter Verwendung einer Kombination aus Detergenzien, mechanischer Lyse und isopyknischer Dichtegradientenzentrifugation. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es nicht auf die alleinige Verwendung von Solubilisierungsdetergenzien angewiesen ist, um subzelluläre Fraktionen zu erhalten. Dadurch ist es möglich, die Plasmamembran von anderen membrangebundenen Organellen der Zelle zu trennen. Dieses Verfahren wird die Bestimmung der Proteinlokalisation in Zellen mit einer reproduzierbaren, skalierbaren und selektiven Methode erleichtern. Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um zytosolische, nukleare, mitochondriale und Plasmamembranproteine aus der menschlichen Monozytenzelllinie U937 zu isolieren. Obwohl für diese Zelllinie optimiert, kann dieses Verfahren als geeigneter Ausgangspunkt für die subzelluläre Fraktionierung anderer Zelllinien dienen. Mögliche Fallstricke des Verfahrens und wie diese vermieden werden können, werden ebenso diskutiert wie Veränderungen, die möglicherweise für andere Zelllinien berücksichtigt werden müssen.

Einleitung

Subzelluläre Fraktionierung ist ein Verfahren, bei dem Zellen lysiert und durch verschiedene Methoden in ihre Bestandteile getrennt werden. Diese Technik kann von Forschern verwendet werden, um die Proteinlokalisierung in Säugetierzellen zu bestimmen oder Proteine mit geringer Abundanz anzureichern, die sonst nicht nachweisbar wären. Während es derzeit Methoden zur subzellulären Fraktionierung gibt, ebenso wie kommerzielle Kits, die erworben werden können, leiden sie unter mehreren Einschränkungen, die dieses Verfahren zu überwinden versucht. Die meisten Zellfraktionierungsmethoden basieren ausschließlich auf Detergenzien^1,2 und basieren auf der Verwendung von Puffern^, die zunehmende Mengen an Detergens enthalten, um verschiedene zelluläre Komponenten zu lösen. Während diese Methode schnell und bequem ist, führt sie zu unreinen Fraktionen. Diese sind so konzipiert, dass Forscher eine oder zwei Komponenten der Zelle leicht isolieren können, sind aber nicht komplex genug, um mehrere subzelluläre Fraktionen gleichzeitig aus einer Probe zu isolieren. Sich ausschließlich auf Reinigungsmittel zu verlassen, führt in der Regel dazu, dass membranumschlossene Organellen und die Plasmamembran wahllos gelöst werden, was die Trennung dieser Komponenten erschwert. Eine zusätzliche Komplikation durch die Verwendung dieser Kits ist die Unfähigkeit der Forscher, sie für bestimmte Anwendungen zu ändern / zu optimieren, da die meisten Komponenten proprietäre Formulierungen sind. Schließlich können diese Kits unerschwinglich teuer sein, mit Einschränkungen in der Anzahl der Anwendungen, die sie für größere Proben nicht ideal machen.

Trotz der Verfügbarkeit von Kits für die Isolierung von Mitochondrien, die nicht auf Detergenzien angewiesen sind, sind sie nicht für die Isolierung der Plasmamembran ausgelegt und liefern signifikant geringere Probenmengen als Standard-Isolierungsprotokolle ^3,4. Während differentielle Zentrifugationsmethoden zeitaufwendiger sind, führen sie oft zu unterschiedlichen Fraktionen, die mit ausschließlich waschmittelbasierten Kits nicht erhalten werden können¹. Die Trennung ohne alleinige Verwendung von Solubilisierungsdetergenzien ermöglicht auch eine weitere Reinigung mittels Ultrazentrifugation und isopyknischen Dichtegradienten, was zu weniger Kreuzkontamination führt. Dieses Fraktionierungsprotokoll demonstriert die Isolierung subzellulärer Fraktionen aus U937-Monozyten unter Verwendung einer Kombination aus Detergenzien- und Hochgeschwindigkeitszentrifugationsansätzen. Diese Methode erleichtert die Isolierung der Kern-, Zytoplasma-, Mitochondrien- und Plasmamembrankomponenten einer Säugetierzelle mit minimaler Kontamination zwischen den Fraktionen.

Protokoll

1. Puffer und Reagenzien vorbereiten

1. Bereiten Sie frische Lösungen von Phosphatase- und Proteaseinhibitoren vor.
   1. 17,4 mg Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) zu 1 ml 100% Ethanol hinzufügen, um eine 100 mM Brühe herzustellen.
      HINWEIS: Tragen Sie Schutzausrüstung beim Umgang mit PMSF, da diese bei Einnahme oder Einatmen und bei Kontakt mit Haut oder Augen gefährlich ist. Es ist ätzend für Augen und Haut.
   2. Bereiten Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers einen handelsüblichen Proteaseinhibitor-Cocktail (100x) vor.
   3. Fügen Sie 91,9 mg Natriumorthovanadat (SOV) zu 1 ml entionisiertem Wasser hinzu, um eine 500 mM Brühe herzustellen.
      HINWEIS: Tragen Sie Schutzausrüstung, wenn Sie mit SOV umgehen, da es gefährlich ist, wenn es verschluckt, eingeatmet oder bei Kontakt mit den Augen ist. Eine starke Überbelichtung kann zum Tod führen.
2. Bereiten Sie den Lysepuffer A, den zytoplasmatischen Isolierungspuffer (CI), den Zellsolubilisierungspuffer (CS), den Kernlysepuffer (NL), den Lysepuffer B, den Zellhomogenisierungspuffer (CH), das Iodixanolverdünnungsmittel und die Reinigungsmittel vor.
   1. 8,7 g Natriumchlorid (NaCl) und 50 ml 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES, 1 M, pH 7,4) zu 950 ml entionisiertem Wasser zugeben, um Lysepuffer A herzustellen (Endkonzentrationen von 150 mM NaCl und 50 mM HEPES).
   2. Stammlösungen von Detergenzien werden wie folgt hergestellt: 0,1 g Natriumdodecylsulfat (SDS) zu 10 ml Lysepuffer A (Endkonzentration von 1% SDS) hinzufügen, 0,1 g Natriumdesoxycholat zu 10 ml Lysepuffer A (Endkonzentration von 1%) hinzufügen, 2,5 mg Digitonin zu 10 ml Lysepuffer A (Endkonzentration von 250 μg/ml) hinzufügen, und 1 ml nichtionisches, nicht denaturierendes Reinigungsmittel (siehe Materialtabelle) zu 9 ml Lysepuffer A (Endkonzentration von 10 % (v/v)) hinzufügen.
   3. Bereiten Sie den CI-Puffer vor, indem Sie 10 μL PMSF-Vorrat (100 mM), 10 μL Proteaseinhibitor (100x), 2 μL SOV-Bestand (500 mM) und 100 μL Standarddigitonin (250 μg/ml) zu 878 μL Lysepuffer A (Endkonzentrationen von 1 mM PMSF, 1x Proteaseinhibitor, 1 mM SOV und 25 μg/ml Digitonin) hinzufügen. Halten Sie die Lösung auf Eis, bis sie zum Zellpellet hinzugefügt wird.
   4. CS-Puffer vorbereiten, indem 10 μL PMSF-Vorrat (100 mM), 10 μL Proteaseinhibitor (100x), 2 μL SOV-Vorrat (500 mM), 100 μL nichtionisches, nicht denaturierendes Waschmittelmaterial (siehe Materialtabelle) (10%) und 118 μL Hexylenglykolvorrat (8,44 M) zu 760 μL Lysepuffer A (Endkonzentrationen von 1 mM PMSF, 1x Proteaseinhibitor, 1 mM SOV, 1% nichtionisches, nicht denaturierendes Reinigungsmittel und 1 M Hexylenglykol). Halten Sie die Lösung auf Eis, bis sie zum Zellpellet hinzugefügt wird.
   5. NL-Puffer werden durch Zugabe von 10 μL PMSF-Vorrat (100 mM), 10 μL Proteaseinhibitor (100x), 2 μL SOV-Bestand (500 mM), 50 μL Natriumdesoxycholat-Brühe (10%), 100 μL SDS-Brühe (1%) und 118 μL Hexylenglykol-Brühe (8,44 M) zu 710 μL Lysepuffer A (Endkonzentrationen von 1 mM PMSF, 1x Proteaseinhibitor, 1 mM SOV, 0,5% Natriumdesoxycholat (v/v), 0,1% SDS (w/v) und 1 M Hexylenglykol). Halten Sie die Lösung auf Eis, bis sie zum Kernpellet hinzugefügt wird.
   6. 20 ml HEPES (1 M, pH 7,4), 0,74 g Kaliumchlorid (KCl), 0,19 g Magnesiumchlorid (_MgCl2), 2 ml Ethylendiamintetraessigsäure (0,5 M EDTA), 2 ml Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (0,5 M EGTA), 38,3 g Mannit und 23,9 g Saccharose zu 980 ml entionisiertem Wasser zugeben, um den Lysepuffer B (Endkonzentrationen von 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM_MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 210 mM Mannit und 70 mM Saccharose).
   7. Bereiten Sie den CH-Puffer vor, indem Sie 10 μL PMSF-Vorrat (100 mM) und 2 μL SOV-Vorrat (500 mM) zu 988 μL Lysepuffer B (Endkonzentrationen von 1 mM PMSF und 1 mM SOV) hinzufügen; passen Sie das Endvolumen an die Anzahl der zu lysierenden Zellen an). Halten Sie die Lösung auf Eis, bis sie zum Zellpellet hinzugefügt wird.
   8. Iodixanolverdünnungsmittel werden durch Zugabe von 12 ml HEPES (1 M, pH 7,4), 447 mg KCl, 114 g_MgCl2, 1,2 ml 0,5 M EDTA, 1,2 ml 0,5 M EGTA, 21,3 g Mannit und 14,4 g Saccharose zu 88 mL entionisiertem Wasser (Endkonzentrationen von 120 mM HEPES, 60 mM KCl, 12 mM MgCl₂, 6 mM EDTA, 6 mM EGTA, 1200 mM Mannit und 420 mM Saccharose).
   9. Lagerpuffer bei 4 °C und Digitonin bei -20 °C.

2. Zytosolische Proteinisolierung

HINWEIS: Die folgenden Schritte ermöglichen das Wachstum und die Expansion von U937-Zellen, gefolgt von der Extraktion zytosolischer Proteine. Bei der verwendeten Konzentration permeabilisiert Diironin die Plasmamembran, ohne sie zu stören, was die Freisetzung zytosolischer Proteine und die Retention anderer zellulärer Proteine ermöglicht.

1. Kultur der Zellen in RPMI 1640 mit 10% fetalem Rinderserum bei 37 °C und 5%_CO2. Stellen Sie sicher, dass die Zellen auf eine Endsumme von 6 x 10⁸ Zellen gezüchtet werden.
   HINWEIS: In diesem Protokoll wurden die Zellen mit einem Standard-Hämozytometer und Mikroskop gezählt.
2. Zentrifugieren Sie die kultivierten Zellen bei 400 × g für 10 min. Nach dem Verwerfen des Überstands wird das Zellpellet in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei Raumtemperatur in einer Endkonzentration von 4 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert und vorsichtig pipettiert, um Klumpen aufzubrechen.
3. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 × g für 10 min, um die Zellen zu pelletieren. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in eiskaltem Lysepuffer A (hergestellt in Schritt 1.2.1) in einer Endkonzentration von 2 × 10⁷ Zellen/ml resuspendiert.
4. Entfernen Sie 7,5 ml der im Lysepuffer A suspendierten Zellen (3 × 10⁷ Zellen) und halten Sie sie auf Eis für die Kernproteinextraktion (Abschnitt 6). Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 4 °C, 400 × g für 10 min, um die Zellen zu pelletieren.
   HINWEIS: Führen Sie alle nachfolgenden Schritte bei 4 °C oder auf Eis durch und kühlen Sie alle Puffer vor.
5. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Zellpellet in CI-Puffer in einer Endkonzentration von 2 × 10⁷ Zellen / ml und pipetten Sie vorsichtig, um Klumpen aufzubrechen. Drehen Sie die Zellsuspension 20 min lang bei 4 °C.
6. Die Zellsuspension wird bei 4 °C, 400 × g für 10 min zentrifugiert und der Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen überführt. Speichern Sie das Zellpellet und lagern Sie es auf Eis. Zentrifugieren Sie den gesammelten Überstand bei 4 °C, 18.000 × g für 20 min zu pelletierten Zelltrümmern.
   HINWEIS: Dieser Hochgeschwindigkeits-Zentrifugationsschritt ist entscheidend, um eine Kontamination der zytosolischen Fraktion mit Organellen und membrangebundenen Proteinen zu verhindern.
7. Entsorgen Sie das Pellet, nachdem Sie den Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen überführt haben. Wiederholen Sie beide Zentrifugationsschritte in Schritt 2.6, bis nach der Zentrifugation kein Pellet mehr erhalten wird.
8. Sammeln Sie den Überstand, der die zytosolische Fraktion ist. Bei kurzfristiger Lagerung (1 Monat) ist darauf zu achten, dass der Überstand bei 4 °C gelagert wird. Für die Langzeitlagerung (>1 Monat) den Überstand mit 1x Laemmli-Puffer mit 1x Reduktionsmittel vermischen, 7 min bei 95 °C erhitzen und bei -20 oder -80°C lagern.
9. Resuspendieren Sie das Zellpellet (aus Schritt 2.6) in Lysepuffer A bei einer Endkonzentration von 4 × 10⁶ Zellen/ml; Pipetten Sie vorsichtig, um Klumpen aufzubrechen.

3. Zellhomogenisierung

HINWEIS: Die folgenden Schritte ermöglichen die mechanische Homogenisierung von digitoninbehandelten Zellen (ab Schritt 2.9), die für die Isolierung der mitochondrialen und Membranproteinfraktionen erforderlich ist.

1. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension im Lysepuffer A (vorbereitet in Schritt 2.9), speichern Sie das Pellet und verwerfen Sie den Überstand, um überschüssiges Digitonin und zytosolische Verunreinigungen aus dem Zellpellet zu entfernen.
   HINWEIS: Wiederholte Waschungen im Lysepuffer A können durchgeführt werden, um überschüssige zytosolische Verunreinigungen zu entfernen.
2. Resuspendieren Sie das Zellpellet in eiskaltem CH-Puffer (hergestellt in Schritt 1.2.7) in einer Endkonzentration von 4 × 10⁶ Zellen/ml. Die Zellsuspension 30 min auf Eis inkubieren.
3. Wenn Sie ein perlenbasiertes Verfahren für die mechanische Lyse verwenden, geben Sie 30 g vorgewaschene 3,2-mm-Edelstahlperlen in ein 50-ml-Sockelrohr, füllen Sie es mit 15 ml Lysepuffer B und legen Sie es zum Abkühlen auf Eis. Wenn Sie einen Dounce-Homogenisator (mit einem eng anliegenden B-Stößel) verwenden, füllen Sie ihn mit einem geeigneten Volumen Lysepuffer B, setzen Sie den Stößel ein und legen Sie ihn zum Abkühlen auf Eis.
4. Nach der Inkubation (Schritt 3.2) wird der Lysepuffer B aus den Bead-Röhrchen (oder dem Dounce-Homogenisator) verworfen und 15 ml der Zellsuspension in das Bead-Röhrchen (oder ein geeignetes Volumen in den Homogenisator) überführt.
5. Wenn Sie die perlenbasierte Methode verwenden, legen Sie die gesäumten Perlenröhrchen mit der Zellsuspension in die Mischvorrichtung und konfigurieren Sie sie so, dass sie 5 Minuten lang bei Geschwindigkeit 8 laufen. Wenn Sie einen Dounce-Homogenisator verwenden, halten Sie ihn auf Eis und führen Sie 40 Durchgänge mit dem Stößel mit langsamen, gleichmäßigen Schlägen durch (oder verwenden Sie eine alternative Methode der mechanischen Zelllyse, wie im Diskussionsabschnitt beschrieben).
   HINWEIS: Wenn Sie ein anderes als das hier verwendete Mischgerät verwenden, müssen Geschwindigkeit und Zeit möglicherweise empirisch bestimmt werden.
6. Das Homogenat in ein sauberes Zentrifugenröhrchen geben und bei 400 × g 10 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen geben und speichern; Entsorgen Sie das Pellet.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert und das Homogenat kurzfristig (24 h) bei 4 °C gelagert werden.

4. Entfernung von Trümmern und Isolierung von rohen mitochondrialen und Membranfraktionen

HINWEIS: Die folgenden Schritte ermöglichen die Entfernung von Zelltrümmern durch Zentrifugieren des Homogenats mit zunehmender Geschwindigkeit. Es folgt eine Differentialzentrifugation zur Isolierung von rohen mitochondrialen und Membranfraktionen.

1. Das Homogenat (ab Schritt 3.6) wird bei 500 × g 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Den Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen geben und das Pellet entsorgen.
2. Zentrifugieren Sie den Überstand (aus Schritt 4.1) bei 1.000 × g für 10 min bei 4 °C. Den Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen geben und das Pellet entsorgen.
3. Zentrifugieren Sie den Überstand (aus Schritt 4.2) bei 2.000 × g für 10 min bei 4 °C. Den Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen geben und das Pellet entsorgen.
4. Zentrifugieren Sie den Überstand (ab Schritt 4.3) bei 4.000 × g für 20 min bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen und speichern Sie das Pellet, das die rohe mitochondriale Fraktion ist.
5. Zentrifugieren des Überstands (ab Schritt 4.4) bei 18.000 × g für 1 h bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand und speichern Sie das Pellet, das die rohe Membranfraktion ist.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert und die pelletierten Proben kurzfristig (24 h) bei 4 °C gelagert werden.

5. Isopyknische Dichtegradientenreinigung

HINWEIS: Die folgenden Schritte verwenden eine isopyknische Dichtegradientenzentrifugation, um die rohen mitochondrialen und Membranfraktionen zu reinigen.

1. Herstellen einer 50%igen (v/v) Arbeitslösung von Jodixanol durch Mischen von 1 Teil Verdünnungsmittel (hergestellt in Schritt 1.1.3) zu 5 Teilen Jodixanol (60%ige Stammlösung (w/v)). Bereiten Sie 10%, 15%, 20%, 25%, 30% und 35% Iodixanollösungen (v/v) durch Mischen von 50% Arbeitslösung (v/v) mit Lysepuffer B in geeigneten Mengen her.
2. Die rohen mitochondrialen und Membranpellets (aus den Schritten 4.4 und 4.5) werden jeweils in 200 μL Lysepuffer B resuspendiert. Auf 45% Iodixanol (v/v) durch Zugabe von 1800 μL Iodixanollösung (50% (v/v)) zu 200 μL des resuspendierten Pellets eingestellt.
3. Erstellen Sie einen diskontinuierlichen Iodixanol-Gradienten wie folgt (passen Sie die Volumina entsprechend der Kapazität des Ultrazentrifugenröhrchens an): Fügen Sie 1 ml 15% Jodixanol (v / v) auf den Boden eines 8 ml, offenen, dünnwandigen Ultrazentrifugenröhrchens hinzu, legen Sie 1 ml 20% Jodixanol (v / v) unter die erste Schicht (durch die Unterlagetechnik), gefolgt von der Unterlagerung von 1 ml von 25%, 1 ml von 30% und 1 ml von 35% Jodixanol (v / v).
   HINWEIS: Bei diesem Schritt sollten 2 Gradienten erzeugt werden, 1 für die mitochondriale Fraktion und 1 für die Membranfraktion.
4. In 1 Gradient fügen Sie die 2 ml des rohen mitochondrialen Pellets (suspendiert in 45% Jodixanol (v / v)) unter Verwendung der Underlay-Technik auf den Boden des Röhrchens unter dem 35% Iodixanol (v / v) hinzu. Im anderen Gradienten fügen Sie die 2 ml des rohen Membranpellets (suspendiert in 45% Iodixanol (v / v)) unter Verwendung der Unterlagstechnik auf den Boden des Röhrchens unterhalb des 35% Jodixanols (v / v) hinzu.
5. Fügen Sie 1 ml 10% Iodixanol (v / v) zur Oberseite jedes Gradientenrohrs hinzu, indem Sie es über die 15% ige Schicht legen. Balancieren Sie die Röhrchen innerhalb von 0,1 g voneinander durch Zugabe von 10% Jodixanol (v / v).
6. Schleudern Sie die Dichtegradientenrohre bei 4 °C für 18 h bei 100.000 × g. Stellen Sie die Beschleunigung und Verzögerung auf die Mindestwerte für die verwendete Ultrazentrifuge ein.
   HINWEIS: Im mitochondrialen Gradienten wird es eine sichtbare Bande an der Grenzfläche zwischen 25% und 30% Iodixanol (v / v) geben. Dies ist die reine mitochondriale Fraktion. Im Membrangradienten befindet sich eine sichtbare Bande in der 15% Iodixanol (v/v) Fraktion. Dies ist die reine Membranfraktion. Es kann zusätzliche Banden in den 25% und 30% Iodixanol (v / v) -Fraktionen im Membrangradienten geben. Dies ist mitochondriale Kontamination.
7. Sammeln Sie Fraktionen von der Oberseite des Röhrchens in 1 ml Aliquots, achten Sie darauf, das Volumen der Fraktion, die die sichtbaren Bänder enthält, zu minimieren und die Pipettenspitze zu wechseln, nachdem jede Schicht gesammelt wurde. Alternativ können Sie die Seite des dünnwandigen Rohrs mit einer Nadel durchstechen und die sichtbaren Bänder sammeln.
8. Lagern Sie die Proben wie in Schritt 2.8 beschrieben, bis zur Überprüfung durch Proteintest und Western Blot.

6. Isolierung von Kernproteinen

HINWEIS: Mit ionischen und nichtionischen Reinigungsmitteln sowie Techniken wie Ultraschall und Zentrifugation werden die folgenden Schritte alle Zellmembranen auflösen und die Isolierung von Kernproteinen ermöglichen.

1. Zentrifugieren Sie das 7,5-ml-Aliquot von Zellen, die im Lysepuffer A suspendiert sind (aus Schritt 2.4), und verwerfen Sie den Überstand. Fügen Sie 800 μL eiskalten CS-Puffer (hergestellt in Schritt 1.2.4) hinzu und suspendieren Sie das Pellet durch Pipettieren und Wirbeln. Inkubieren Sie die Proben auf Eis (oder bei 4 °C) für 30 Minuten, um das Plasma und die Organellenmembranen zu stören und gleichzeitig die Kernproteine zu schützen.
2. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 7.000 × g für 10 min bei 4 °C und verwerfen Sie den Überstand. Nach Zugabe von 1U/μL Benzonase werden dem Kernpellet 800 μL eiskalter NL-Puffer (hergestellt in Schritt 1.2.5) zugegeben. Resuspendieren Sie das Pellet durch vorsichtiges Pipettieren. Inkubieren Sie auf einem End-over-End-Rotator für 30 min bei 4 °C, um die Kernmembran zu stören.
3. 5 s bei 20% Leistung mit Probenröhrchen in einem Eisbad abgekühlt (3x, mit 5 s Pausen zwischen den Impulsen), die zusammen mit Benzonase (in Schritt 6.2 hinzugefügt) die Nukleinsäuren scheren.
4. Zentrifugieren Sie das Schall bei 7.800 × g für 10 min bei 4 °C. Sammle und rette den Überstand, der die Kernfraktion ist. Achten Sie darauf, das unlösliche Pellet nicht zu stören, während Sie den Überstand sammeln. Für die Lagerung können Proben wie in Schritt 2.8 beschrieben vorbereitet werden.

7. Proteinquantifizierung und Western-Blot-Analyse

HINWEIS: Die folgenden Schritte quantifizieren das Gesamtprotein in jeder Fraktion und bestätigen die Reinheit der subzellulären Fraktionen.

1. Führen Sie einen Standard-Bradford-Test durch, um das Gesamtprotein in jeder Fraktion zu quantifizieren. Die erwarteten Proteinerträge finden Sie in Tabelle 1 .
   HINWEIS: Andere Proteinassays wie der Bicchininsäure-Assay (BCA) oder die Absorption bei 280 nm können anstelle eines Bradford-Assays zur Messung des Gesamtproteins verwendet werden.
2. Fraktionen mit 1x Laemmli Puffer mit 1x Reduktionsmittel kombinieren und bei 95 °C 7 min erhitzen. Laden Sie 10 μg jeder Fraktion in ein Standard-SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Gel (PAGE) und lassen Sie das Gel bei 20 mA für 1 h laufen.
3. Die aufgelösten Proteine werden auf eine Polyvinyldifluorid (PVDF)-Membran übertragen, indem ein Standard-Immunoblot-Transfer bei 100 V für 30 min durchgeführt wird. Blockieren Sie die PVDF-Membran mit 5% Milch in 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS), die 0,1% eines nichtionischen Reinigungsmittels (v/v) enthält, für 30 min bei Raumtemperatur.
4. Fügen Sie die entsprechenden primären Antikörper hinzu, um Haushaltsproteine nachzuweisen, die für jede subzelluläre Fraktion spezifisch sind, und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C. Waschen Sie die Membran mit 5% Milch in 1x TBS mit 0,1% des nichtionischen Reinigungsmittels (v/v) für 10 min bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Für dieses Protokoll wurden Antikörper gegen Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH, 1:10000), Histon H3 (1:2000), spannungsabhängigen Anionenkanal (VDAC, 1:1000) und Na,K⁺-ATPase für zytosolische, nukleare, mitochondriale und Membranfraktionen verwendet.
5. Die entsprechenden Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten sekundären Antikörper in die Membran geben (gemäß den Anweisungen des Herstellers verdünnen) und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Membran mit 5% Milch in 1x TBS mit 0,1% des nichtionischen Reinigungsmittels (v/v) für 10 min bei Raumtemperatur. Entwickeln Sie den Blot mit Standard-Chemilumineszenz.

Ergebnisse

Ein schematisches Flussdiagramm dieses Verfahrens (Abbildung 1) fasst visuell die Schritte zusammen, die unternommen wurden, um U937^5-Zellen erfolgreich zu fraktionieren, die in Suspension gezüchtet wurden. Fraktionen, die von der Oberseite des isopyknischen Dichtegradienten in gleichen Volumina (1 ml) gesammelt wurden, zeigen die Reinigung der mitochondrialen und Membranfraktionen (Abbildung 2). Die Verwendung eines Antikörpers gegen V...

Diskussion

Dieses Verfahren ist eine modifizierte Version eines zuvor veröffentlichten Ansatzes zur subzellulären Fraktionierung ohne den Einsatz von Hochgeschwindigkeitszentrifugation¹¹. Diese modifizierte Methode erfordert mehr spezialisierte Ausrüstung, um die besten Ergebnisse zu erzielen, ist aber umfassender und konsistent reproduzierbar.

Die Entwicklung des ursprünglichen Protokolls war aufgrund der Unfähigkeit erforderlich, mitochondriale und Membranproben für die An...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	61-BB50-DX
digitonin	Sigma	D141
end-over-end rotator	ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma	E3889
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118
HEPES	VWR	97064-360
Hexylene glycol	Sigma	68340
Igepal	Sigma	I7771	Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl	Sigma	P9333
Mannitol	Sigma	M9647
MgCl2	Sigma	M8266
NaCl	Sigma	S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm	Seton Scientific	7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium	Sigma	D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML
refrigerated centrifuge	ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor	Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	436143
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma	567540
sonicator	ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge	ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm	Next Advance	SSB32
Sucrose	Sigma	S0389
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	97062-370
Tween 20			non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661