JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نقدم بروتوكولا لتوليد وتوسيع خلايا القلب البشرية بقوة من خلايا الدم المحيطية أحادية النووية المريض.

Abstract

وقد اجتذب توليد خلايا القلب المريض محددة من سحب الدم واحد اهتماما هائلا في الطب الدقيق على أمراض القلب والأوعية الدموية. يتم تعديل التمايز القلبي عن الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان (iPSCs) من خلال مسارات إشارات محددة ضرورية لنمو القلب الجنيني. تم تطوير العديد من طرق التمايز القلبي على منصات 2-D و 3-D بكفاءات مختلفة وغلة خلايا القلب. وقد حير ذلك المحققين خارج الميدان لأن تنوع هذه الأساليب قد يكون من الصعب اتباعه. هنا نقدم بروتوكول شامل يوضح توليد قوي وتوسيع خلايا القلب الخاصة بالمرضى من خلايا الدم الأحادية النووية الطرفية (PBMCs). نحن أول وصف بروتوكول إعادة برمجة iPSC عالية الكفاءة من عينة دم المريض باستخدام ناقلات فيروس سينداي عدم التكامل. ثم نقوم بتفصيل طريقة تمايز أحادية الطبقة صغيرة بوساطة الجزيء يمكن أن تنتج بقوة ضربات خلايا القلب من معظم خطوط iPSC البشرية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم إدخال بروتوكول توسيع خلايا القلب القابلة للتطوير باستخدام جزيء صغير (CHIR99021) يمكن أن يوسع بسرعة خلايا القلب المشتقة من المريض للتطبيقات الصناعية والسريرية. وفي النهاية، يتم تصوير بروتوكولات مفصلة لتحديد الهوية الجزيئية والتوصيف الكهربي لهذه iPSC-CMs. نتوقع أن يكون هذا البروتوكول عمليا للمبتدئين ذوي المعرفة المحدودة حول تطوير القلب والأوعية الدموية وبيولوجيا الخلايا الجذعية.

Introduction

اكتشاف الخلايا الجذعية المستحثة من قبل الإنسان متعدد القدرات قد أحدثت ثورة في طب القلب والأوعية الدموية الحديث1،2. iPSCs الإنسان قادرون على تجديد الذات وتوليد جميع أنواع الخلايا في القلب، بما في ذلك خلايا القلب والخلايا البطانية وخلايا العضلات الملساء والخلايا الليفية القلبية. يمكن أن تعمل خلايا القلب المشتقة من iPSC (iPSC-CMs) كموارد غير محددة الأجل لنمذجة أمراض القلب والأوعية الدموية الموروثة وراثيا (CVDs) واختبار سلامة القلب للأدوية الجديدة3. على وجه الخصوص ، يستعد المريض iPSC-CMs جيدا للتحقيق في الارتطولوجيا الوراثية والجزيئية للأمراض القلبية الوعائية المشتقة من عيوب في خلايا القلب ، مثل متلازمة QT الطويلة4 واعتلال عضلة القلب المتوسع (DCM)5. جنبا إلى جنب مع CRISPR /Cas9 بوساطة تحرير الجينوم، فتحت المريض iPSC-CMs وسيلة غير مسبوقة لفهم الأساس الوراثي المعقد للأمراض القلبية الوعائية بما في ذلك عيوب القلب الخلقية (CHDs)6،7،8. وقد أظهرت iPSC-CMs الإنسان أيضا إمكانات لتكون بمثابة مصادر الخلايا الذاتية لتجديد عضلة القلب التالفة خلال نوبة قلبية9. في السنوات الأخيرة، أصبح من الأهمية بمكان لتوليد عالية الجودة iPSC-CMs الإنسان مع أنواع فرعية محددة (الأذينية والبطينية والدال) لتجديد القلب واختبار المخدرات10.

وقد تم التمايز القلبي من iPSCs الإنسان متقدمة إلى حد كبير في العقد الماضي. وقد تحولت أساليب التمايز من التمايز التلقائي القائم على الجسم الجنيني (EB) إلى التمايز القلبي المحدد كيميائيا والموجه11. يتم التلاعب جزيئات الإشارات الرئيسية الضرورية لنمو القلب الجنيني، مثل WNT، BMP، العقد، وGFGF لتعزيز التمايز cardiomyocyte من iPSCs الإنسان10،12. وتشمل التطورات الهامة التشكيل التسلسلي للإشارات WNT (التنشيط تليها تثبيط) لتوليد قوي من خلايا القلب من iPSCs الإنسان13،14. تم استكشاف وصفات التمايز القلبي المحددة كيميائيا لتسهيل الإنتاج على نطاق واسع من خلايا القلبالنابضة 15،16، والتي لديها القدرة على الترقية إلى الإنتاج الصناعي والسريري. وعلاوة على ذلك، يتم تحقيق التوسع القوي في وقت مبكر iPSC-CMs الإنسان من خلال التعرض لتنشيط WNT التأسيسية باستخدام مادة كيميائية صغيرة (CHIR99021)17. في الآونة الأخيرة ، يتم إنشاء خلايا القلب الخاصة بالنوع الفرعي من خلال التلاعب بحمض الريتينويك (RA) ومسارات إشارات Wnt في نوافذ تمايز محددة أثناء التزام نسب القلب والخلايا القلبية من iPSCs البشري18و19و20و21و22.

في هذا البروتوكول، نقوم بتفصيل إجراء عمل لتوليد قوي وانتشار CMs الإنسان الناشئة من خلايا الدم المحيطي المريض أحادية النووية. نقدم بروتوكولات ل1) إعادة برمجة PBMCs الإنسان إلى iPSCs، 2) جيل قوي من ضربات خلايا القلب من iPSCs الإنسان، 3) التوسع السريع في وقت مبكر iPSC-CMs، 4) التوصيف الجزيئي للإنسان iPSC-CMs، و 5) القياس الكهربي من iPSC-CMs الإنسان على مستوى خلية واحدة عن طريق المشبك التصحيح. يغطي هذا البروتوكول الإجراءات التجريبية التفصيلية حول تحويل خلايا دم المريض إلى خلايا القلب النابضة.

Protocol

وقد وافق مجلس المراجعة المؤسسية في مستشفى الأطفال على الصعيد الوطني على البروتوكولات التجريبية والموافقة المستنيرة على الأشخاص.

1. إعداد وسائل الإعلام ثقافة الخلية، والحلول، والكواشف

  1. إعداد وسائط PBMC
    1. مزيج 20 مل من الوسائط الثقافية PBMC القاعدية (1x) و 0.52 مل من الملحق. أضف 20 ميكرولتر من SCF و FLT3 لكل منهما (تركيز المخزون: 100 ميكروغرام/مل)، و4 ميكرولتر من IL3 وIL6 وEPO لكل منها (تركيز المخزون: 100 ميكروغرام/مل) و200 ميكرولتر من بديل L-glutamine (100x). مزجها جيدا. فلتر في غطاء معقم باستخدام وحدة تصفية 0.22 ميكرومتر. اسم هذا كما وسائل الإعلام الدم الكامل.
    2. مزيج 20 مل من الوسائط الثقافية PBMC القاعدية (1x) و 0.52 مل من الملحق. إضافة 200 ميكرولتر من بديل L-الجلوتامين (100x). مزجها جيدا. تصفية باستخدام وحدة تصفية 0.22-μm. اسم هذا كما تكملة وسائل الإعلام الدم.
  2. إعداد وسائط E8 كاملة
    1. مزيج 500 مل من وسائل الإعلام القاعدية E8 و 10 مل من E8 الملحق (إذابة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية) لجعل وسائل الإعلام E8 كاملة. توازن إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الاستخدام.
  3. إعداد وسائط تمرير iPSC
    1. إضافة 40 ميكرولتر من Y-27632 مثبطات روك (1:5,000 التخفيف, تركيز المخزون: 10 MM) إلى 200 مل من وسائل الإعلام E8 كاملة. مزجه جيدا. الاعتدال إلى RT قبل الاستخدام.
  4. إعداد وسائط تمايز خلايا القلب
    1. وسائل الإعلام I: مزيج 500 مل من RPMI1640 مع 10 مل من B27 ناقص تكملة الأنسولين (50x).
    2. الوسائط II: إضافة حجم مناسب من مخزون CHIR99021 (مثبط GSK3) إلى Media I (التركيز النهائي ل CHIR99021 من 6 ميكرومتر). تخلط جيدا.
    3. الوسائط الثالثة: أضف حجما مناسبا من مخزون IWR-1 (مثبط Wnt) إلى Media I (التركيز النهائي IWR-1 البالغ 5 ميكرومتر). تخلط جيدا.
    4. وسائل الإعلام الرابع: مزيج 500 مل من RPMI1640 مع 10 مل من الملحق B27 (50x). تخلط جيدا.
    5. الوسائط V: مزيج 500 مل من RPMI1640 (بدون جلوكوز) مع 10 مل من ملحق B27 (50x). تخلط جيدا.
    6. الوسائط السادسة: أضف حجما مناسبا من مخزون CHIR99021 إلى Media IV (التركيز النهائي ل CHIR99021 2 ميكرومتر). تخلط جيدا.
  5. إعداد وسائط تمرير iPSC-CM
    1. إضافة 10 مل من استبدال مصل خروج المغلوب (KSR) إلى 90 مل من الوسائط IV (التركيز النهائي KSR: 10٪). تخلط جيدا.
  6. إعداد وسائط التجميد iPSC-CM
    1. إضافة 1 مل من DMSO إلى 9 مل من KSR (تركيزات النهائي: 10٪ DMSO/90٪ KSR) وتخلط جيدا.
  7. إعداد مصفوفة غشاء الطابق السفلي لوحات متوسطة المغلفة
    1. ذوبان مصفوفة غشاء الطابق السفلي المتوسطة في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها وaliquot في أنابيب 1.5 مل. أضف 1 مل من هذا الوسط إلى 250 مل من وسائط DMEM/F12 (1:250 تخفيف) واخلطها جيدا. تطبيق 2 مل من محلول مخفف لكل بئر في لوحة 6-جيدا واحتضان في 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.

2. iPSC إعادة برمجة PBMCs

  1. فصل PBMCs من عينات الدم.
    1. جمع عينات دم المريض (~ 5 مل) ونقلها إلى أنابيب فصل خلايا الدم (انظر جدول المواد). مزيج عن طريق عكس 10x.
    2. جهاز طرد مركزي عند 1500 × غرام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. أخرج الأنابيب بعناية ورشها بالإيثانول بنسبة 70٪. تحت غطاء محرك السيارة السلامة البيولوجية، وإزالة القبعات دون إزعاج الخلايا أحادية النووية (طبقة برتقالي). وسوف تكون PBMCs في طبقة بيضاء فقط تحت طبقة البلازما (الشكل 1A). جمع طبقة بافي كله باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
    4. عد رقم الخلية باستخدام عداد خلية تلقائي. تدور في أنبوب 300 × ز لمدة 25 دقيقة في RT.
    5. تجاهل الناتنات الفائق. غسل مع 10 مل من DPBS (Ca2 +/ ملغ2 + مجانا).
    6. تدور في أنبوب 300 × ز لمدة 15 دقيقة في RT.
    7. أزل الناتنات الفائق. الكريات خلية Resuspend في 1 مل من وسائل الإعلام تجميد (KSR زائد 10٪ DMSO). ضبط كثافة الخلية لجعل 1 × 106 خلايا في قارورة.
    8. ضع مبردات PBMC في حاوية تجميد الخلايا والحفاظ على -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها. نقل إلى خزان النيتروجين السائل لتخزين لفترة طويلة في اليوم التالي.
  2. iPSC إعادة البرمجة.
    1. إضافة 3 مل من وسائل الإعلام الدم الملحق في أنبوب مخروطي 15 مل. ذوبان PBMCs في 37 درجة مئوية حمام مائي ونقلها إلى أنبوب مخروطي. تدور في 300 × ز لمدة 7 دقائق في RT.
    2. تجاهل الناتنات الفائق. إعادة الإنفاق PBMCs مع وسائل الإعلام الدم الكامل. البذور لهم في بئرين من 24 لوحات زراعة أنسجة الآبار (لا مصفوفة غشاء الطابق السفلي).
    3. احتضان في 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي إزالة بلطف نصف وسائل الإعلام القديمة (0.5 مل) وإضافة 0.5 مل من وسائل الإعلام الدم كاملة جديدة.
    4. تغيير الوسائط كل يومين عن طريق تحديث نصف الوسائط القديمة.
    5. بعد أسبوع, غسل جيدا بقوة مع 1 مل من وسائل الإعلام الدم الملحق ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
    6. عد رقم الخلية. خذ 2 × 105 خلايا وأجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 7 دقائق.
    7. تجاهل الناتنات الفائق. إعادة ضغط الخلايا مع 300 ميكرولتر من وسائل الإعلام الدم الكامل. تنفيذ العدوى عن طريق إضافة الحجم المناسب من ناقلات إعادة برمجة فيروس سينداي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. نقلها إلى بئر واحد من لوحة 24 جيدا (لا مصفوفة غشاء الطابق السفلي). احتضان في 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    8. في اليوم التالي تدور في 300 × ز لمدة 7 دقائق. إزالة supernatant و resuspend في 2 مل من وسائل الإعلام الدم الكامل. نقل إلى بئر واحد من لوحة بئر 6 المغلفة مسبقا مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي. هذا هو اليوم الأول (D1).
    9. لا تلمس الصحن في اليوم التالي
    10. على D3، قم بإزالة 1 مل من الوسائط القديمة. إضافة 1 مل من وسائل الإعلام ملحق الدم.
    11. كرر الخطوة 2.2.10 على D5.
    12. على D7، قم بإزالة 1 مل من الوسائط القديمة. أضف 1 مل من وسائط E8 الكاملة.
    13. على D8 كرر الخطوة 2.2.12.
    14. على D9، قم بإزالة الوسائط القديمة. إضافة 2 مل من وسائط E8 كاملة. ومن المتوقع أن الخلايا المبرمجة تماما لإرفاق والبدء في تشكيل المستعمرات.
    15. تحديث مع 2 مل من وسائل الإعلام E8 كاملة كل يوم.
    16. بعد حوالي أسبوعين من نقل فيروس سينداي، ستظهر مستعمرات iPSC كبيرة وتكون جاهزة للانتقاء.
    17. قطع مستعمرات iPSC تحت مجسم في غطاء محرك السيارة ونقل المستعمرات الفردية إلى غشاء الطابق السفلي مصفوفة المغلفة 24-جيدا لوحة محملة مسبقا مع 0.5 مل من وسائل الإعلام iPSC passaging.
    18. تحديث مع 0.5 مل من وسائل الإعلام E8 كاملة كل يوم حتى مستعمرات iPSC تنمو كبيرة بما يكفي لتمرير في غشاء الطابق السفلي الجديد المغلفة 6-لوحة جيدا.

3. صيانة iPSC الإنسان والتمرير

  1. عندما تصل iPSCs الإنسان أكثر من 90٪ التقاء، وإزالة الوسائط القديمة. شطف مع 3 مل من DPBS مرة واحدة.
  2. إضافة 1 مل من 0.5 mM EDTA في حل DPBS. احتضان في 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية لمدة 5-8 دقائق.
  3. إزالة EDTA حسب الطموح. إضافة 1 مل من وسائط تمرير iPSC. طرد iPSCs يدويا.
  4. خذ 600-900 ميكرولتر من تعليق الخلية الواحدة وإعادة صفيحتها على لوحة غشاء الطابق السفلي المغلفة ب 6-well (التخفيف: 1:6 إلى 1:10). احتضان في 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  5. تحديث مع 2 مل من وسائل الإعلام E8 كاملة كل يوم. عادة ما تصل ثقافات iPSC إلى الالتقاء بعد 3-4 أيام.

4. تمايز خلايا القلب المعرفة كيميائيا

  1. ثقافة iPSCs الإنسان في وسائل الإعلام E8 كاملة حتى التقاء 95٪ (3-4 أيام).
  2. إزالة الوسائط القديمة. إضافة 2 مل من التمايز CM وسائل الإعلام الثاني (6 μM CHIR في RPMI1640 بالإضافة إلى B27 ناقص الأنسولين الملحق) إلى كل بئر من لوحة 6-جيدا. هذا هو D0. لا تلمس على D1.
  3. على D2, استبدال مع 2 مل من التمايز CM وسائل الإعلام I (RPMI1640 بالإضافة إلى B27 ناقص الأنسولين الملحق).
  4. على D3، استبدال مع 2 مل من التمايز CM وسائل الإعلام الثالث (5 ميكرومتر IWR-1 في RPMI1640 بالإضافة إلى B27 ناقص تكملة الأنسولين). لا تلمس على D4.
  5. على D5، استبدال مع 2 مل من التمايز CM وسائل الإعلام I.
  6. على D7, استبدال مع 2 مل من التمايز CM وسائل الإعلام الرابع (RPMI1640 بالإضافة إلى ملحق B27). بعد ذلك، قم بتحديث الوسائط كل يومين.
  7. على D11 عند ملاحظة الخلايا المتعاقدة، استبدال مع 2 مل من التمايز CM وسائل الإعلام الخامس (لا الجلوكوز).
  8. على D13، استبدال مع 2 مل من التمايز CM وسائل الإعلام الخامس.
  9. على D15، استبدال مع 2 مل من التمايز CM وسائل الإعلام الرابع.
  10. على D17-D21، استبدال مع 2 مل من التمايز CM وسائل الإعلام الرابع كل يومين.

5. مرور الإنسان iPSC-CMs

  1. إزالة الوسائط القديمة وشطف الخلايا مع 3 مل من DPBS مرة واحدة.
  2. تطبيق 1 مل من محلول فص التفكك CM (انظر جدول المواد)على كل بئر من لوحة 6-جيدا. احتضان في 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية لمدة 5-8 دقائق.
  3. ينفصم ميكانيكيا iPSC-CMs إلى خلايا واحدة عن طريق الأنابيب قوية.
  4. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة 2 مل من وسائل الإعلام CM passaging (10٪ KSR في RMPI1640 بالإضافة إلى ملحق B27) لتحييد حل تفكك CM.
  5. تدور في 300 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
  6. تجاهل الناتنات الفائق. إعادة إنفاق الخلايا مع الحجم المطلوب من وسائل الإعلام تمرير CM. البذور لهم في غشاء الطابق السفلي مصفوفة المغلفة لوحة / طبق. الإنسان iPSC-CMs استئناف الضرب 1-3 أيام بعد passaging.

6. التوسع في iPSC-CMs البشرية

  1. شطف D10-12 الضرب iPSC-CMs مع 3 مل من DPBS لكل بئر من لوحة 6-جيدا مرة واحدة. إضافة 1 مل من حل فص التفكك CM (الخطوة 5.2). احتضان في 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية لمدة 7-10 دقيقة.
  2. ينفصم ميكانيكيا iPSC-CMs إلى خلايا واحدة عن طريق الأنابيب قوية.
  3. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة 2 مل من وسائل الإعلام CM passaging لتحييد حل تفكك CM.
  4. تدور في 300 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
  5. تجاهل الناتنات الفائق. إعادة تشغيل الخلايا مع حجم مناسب من وسائط تمرير CM. ماصة صعودا وهبوطا لجعل تعليق خلية واحدة. البذور مليون من iPSC-CMs في طبق غشاء الطابق السفلي المغلفة 10 سم.
  6. في اليوم التالي إزالة الوسائط القديمة. إضافة 10 مل من وسائط انتشار خلايا القلب (الوسائط السادسة: 2 ميكرومتر CHIR99021). تغيير وسائل الإعلام كل يومين.
  7. عندما تصبح iPSC-CMs التقاء بعد ثقافة 7-9 أيام، كرر خطوة passaging لمزيد من التوسع في iPSC-CMs.

7. الفلورة المناعية

  1. قبل تلطيخ immunofluorescence، البذور iPSC-CMs على الأغطية المغلفة مصفوفة غشاء الطابق السفلي التي يتم وضعها في لوحة بئر 24 (كثافة البذر: 0.5-1 × 106 خلايا / مل). الحفاظ على iPSC-CMs في الثقافة لمدة 4 أيام على الأقل.
  2. غسل الخلايا باستخدام 1 مل من DPBS مرة واحدة.
  3. أضف 0.5 مل من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) واحتضن لمدة 15 دقيقة في RT.
  4. غسل الخلايا باستخدام 1 مل من DPBS. كرر مرة واحدة.
  5. أضف 0.5 مل من 0.1٪ تريتون X-100 واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT.
  6. اغسله مع 1 مل من DPBS مرتين.
  7. إضافة 0.5 مل من 0.2٪ BSA في DPBS (حل الحظر). احتضان في RT لمدة 1 ساعة.
  8. إضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة مع حل حجب (التخفيف: 1:400-1:1000). حضانة عند 4 °C بين عشية وضحاها.
  9. غسل الخلايا باستخدام 0.5 مل من حل حظر لمدة 3 دقائق مع اهتزاز. كرر مرتين.
  10. إضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخففة في حل الحجب. احتضان في RT لمدة 1 ساعة.
  11. شطف الخلايا ثلاث مرات مع 0.5 مل من DPBS، كل لمدة 3 دقائق مع اهتزاز.
  12. مضادةالنوى مع DAPI (1:2000 التخفيف) واحتضان لمدة 5 دقائق في RT.
  13. شطف الخلايا ثلاث مرات مع 0.5 مل من DPBS.
  14. جبل الخلايا على coverlips على شريحة المجهر باستخدام 5 ميكرولتر من وسائل الإعلام المتصاعدة. يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية ويحمي من الضوء.

8. تدفق إعداد عينة قياس الخلايا

  1. غسل iPSC-CMs الإنسان مع 3 مل من DPBS مرة واحدة.
  2. أضف 1 مل من محلول فصامي CM واحتضن في 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية لمدة 7-10 دقائق.
  3. طرد الخلايا باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب FACS مستدير من خلال غطاء مصفاة. يتم تعبئة أنبوب FACS مسبقا مع 1 مل من وسائط تمرير iPSC-CM (10٪ KSR) لتحييد نشاط الإنزيم.
  4. تدور في 300 × ز لمدة 5 دقائق.
  5. إزالة supernatant دون بيليه الخلية المزعجة. إضافة 250 ميكرولتر من التثبيت / حل Permeabilization (انظر جدول المواد). حضانة لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  6. إضافة 1 مل من المخزن المؤقت Perm/Wash. دوامة لفترة وجيزة وتدور في 300 × ز لمدة 4 دقائق.
  7. تجاهل الناتنات الفائق. إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة (1:200-1:500) في 1x Perm/ غسل العازلة. دوامة لفترة وجيزة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 °C.
  8. غسل الخلايا بإضافة 1 مل من بيرم / غسل العازلة. دوامة لفترة وجيزة وتدور في 300 × ز لمدة 4 دقائق.
  9. تجاهل الناتنات الفائق. أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخففة (1:500-1:1,000). دوامة لفترة وجيزة واحتضان في RT لمدة 1 ساعة. الحماية من الضوء إذا تم اقتران الأجسام المضادة الثانوية مع مضان حساس للضوء.
  10. غسل الخلايا بإضافة 1 مل من بيرم / غسل العازلة. دوامة لفترة وجيزة وتدور في 300g لمدة 4 دقائق.
  11. تجاهل الناتنات الفائق. إعادة الخلايا مع 400 ميكرولتر من العازلة تلطيخ FACS (PBS/ 4٪ FBS). يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يتم تحميله على جهاز FACS.

9. qPCR في الوقت الحقيقي

  1. إزالة الوسائط القديمة في ثقافة iPSC-CM البشرية. إضافة 500-700 ميكرولتر من تحلل العازلة إلى خلايا lysate. احتضان لمدة 3 دقائق في RT. سكيب lysate الخلية ونقلها إلى أنبوب 1.5 مل RNase خالية. انتقل إلى إجمالي استخراج الحمض النووي الريبي على الفور أو تخزينها عند -80 درجة مئوية.
  2. عزل إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام عدة استخراج الحمض النووي الريبي بعد تعليمات الشركة المصنعة.
  3. قياس تركيز الحمض النووي الريبي وتقييم نوعية الحمض النووي الريبي الكلي بواسطة مطياف.
  4. إجراء رد فعل النسخ العكسي باستخدام مجموعة توليف cDNA. الحجم الإجمالي لرد فعل RT هو 20 ميكرولتر بما في ذلك 4 ميكرولتر من مزيج التفاعل (5x) ، 1 ميكرولتر من النسخ العكسي ، 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي والمياه الخالية من RNase.
  5. احتضان مزيج رد فعل RT الكامل في دورة حرارية باستخدام البروتوكول التالي: 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ 46 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة؛ 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة؛ عقد عند 4 °C.
  6. تمييع cDNA بواسطة 1:10 باستخدام المياه الخالية من النيوكليز. إعداد رد فعل qPCR في الوقت الحقيقي عن طريق خلط 1 ميكرولتر من قالب cDNA، 1 ميكرولتر من التمهيديات / التحقيق، 10 ميكرولتر من مزيج qPCR الرئيسي و 8 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز.
  7. تشغيل في نظام PCR في الوقت الحقيقي. بروتوكول ركوب الدراجات هو 50 درجة مئوية 2 دقيقة (عقد)، 95 درجة مئوية 10 دقيقة (عقد)، 95 درجة مئوية 15 ثانية، 60 درجة مئوية 1 دقيقة، كرر لمدة 40 دورة.
  8. جمع قيمC T لكل جين في كل عينة. يتم حساب وفرة مرنا النسبية عن طريق طرح قيمة CT من الجين المستهدف من قيمة CT لجين التدبير المنزلي. يتم تحليل التعبير الجيني النسبي من خلال طريقة 2-ΔΔCT.

10. كامل الخلية التصحيح تسجيل المشبك

  1. فصل iPSC-CMs إلى خلايا مفردة باستخدام حل فص التفكك CM كما هو موضح سابقا.
  2. خلايا البذور في كثافة منخفضة على الأغطية المغلفة مصفوفة غشاء الطابق السفلي. ثقافة لهم لمدة 3-4 أيام في وسائل الإعلام الرابع.
  3. سحب ماصة (المقاومة 0.9-1.5 MΩ) من الشعيرات الدموية الزجاجية borosilicate باستخدام سحب microelectrode الأفقي.
  4. احتضان الخلايا في حل تايرود (pH = 7.35).
  5. ملء ماصة مع محلول القطب الكهربائي (درجة الحموضة = 7.3) تتألف من المواد الكيميائية التالية: 120 mM حمض الأسبارتيك، 20 M M KCl, 2 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 10 mM NaCl, 5 mM EGTA, 0.3 m M Na-GTP, 14 mM فوسفوكرياتين, 4 MM K-ATP و 2mM الكرياتين فوسفوهيكيناسي.
  6. ضع الخلايا في وضع المشبك الحالي باستخدام عتبة انبساطية 1.5-2 5 مللي ثانية نبض التيار في 1 هرتز.
  7. تسجيل إمكانات العمل (APs) باستخدام مكبر للصوت microelectrode ولوحة اقتناء تعتمد على البرامج.

النتائج

إعادة برمجة iPSC البشرية من PBMCs
بعد مرحلة ما قبل الثقافة مع وسائل الإعلام الدم الكامل لمدة 7 أيام، PBMCs تصبح كبيرة مع نواة مرئية والسيتوبلازم(الشكل 1B)،مما يدل على أنها مستعدة لإصابة الفيروس. وبعد إعادة العدوى بعوامل إعادة برمجة فيروس سينداي، ستخضع ?...

Discussion

خلال إعادة برمجة iPSC ، من المهم زراعة PBMCs لمدة أسبوع واحد حتى يتم توسيعها مع نواة واضحة وسيتوبلازم. ونظرا لعدم انتشار PBMCs، فإن رقم الخلية المناسب لاتحواث الفيروس مهم لإعادة برمجة iPSC بنجاح. وينبغي النظر في عدد الخلايا من PBMCs، وتعدد العدوى (MOI) وترايتر الفيروس وتعديلها للوصول إلى نتائج النقل ال?...

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة من قبل جمعية القلب الأمريكية (AHA) جائزة التطوير الوظيفي 18CDA34110293 (M-T.Z.) ، والمشاريع الإضافية AVIF وجوائز SVRF (M-T.Z.) ، المعاهد الوطنية للصحة (NIH / NHLBI) منح 1R01HL124245 ، 1R01HL132520 و R01HL096962 (I.D.). كما تم دعم الدكتور مينغ تاو تشاو من أموال الشركات الناشئة من معهد أبيغيل ويكسنر للأبحاث في مستشفى نيشن وايد للأطفال.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ABI 7300 Fast Real-Time PCR SystemThermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Microelectrode AmplifierMolecular DevicesMicroelectrode Amplifier
B27 supplementThermo Fisher Scientific17504044
B27 supplement minus insulinThermo Fisher ScientificA1895601
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization KitBD Biosciences554714Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer
BD Vacutainer CPT tubeBD Biosciences362753Blood cell separation tube
CHIR99021Selleck ChemicalsS2924
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming KitThermo Fisher ScientificA16517Sendai virus reprogramming kit
Digidata 1200BAxon InstrumentsAcquisition board
Direct-zol RNA Miniprep kitZymo ResearchR2050RNA extraction kit
DMEM/F12Thermo Fisher Scientific11330057
Essential 8 mediumThermo Fisher ScientificA1517001E8 media for iPSC culture
GlutaMAX supplementThermo Fisher Scientific35050061L-glutamine alternative
Growth factor reduced MatrigelCorning356231Basement membrane matrix
iScript cDNA Snythesis KitBio-Rad1708891cDNA synthesis
IWR-1-endoSelleck ChemicalsS7086
KnockOut Serum Replacement (KSR)Thermo Fisher Scientific10828028
pCLAMP 7.0Molecular DevicesElectrophysiology data acquisition & analysis software
Recombinant human EPOThermo Fisher ScientificPHC9631
Recombinant human FLT3Thermo Fisher ScientificPHC9414
Recombinant human IL3Peprotech200-03
Recombinant human IL6Thermo Fisher ScientificPHC0065
Recombinant human SCFPeprotech300-07
RPMI 1640 mediumThermo Fisher Scientific11875093
RPMI 1640 medium, no glucoseThermo Fisher Scientific11879020
SlowFade Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificS36936Mounting media
StemPro-34 SFMThermo Fisher Scientific10639011PBMC culture media
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444964qPCR master mix
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol redThermo Fisher ScientificA1217703CM dissociation solution
UltraPure 0.5 M EDTAThermo Fisher Scientific15575020iPSC dissociation solution
Y-27632 2HClSelleck ChemicalsS1049

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  3. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
  4. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  5. Hinson, J. T., et al. Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy. Science. 349 (6251), 982-986 (2015).
  6. Deacon, D. C., et al. Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy. Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).
  7. Gifford, C. A., et al. Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier. Science. 364 (6443), 865-870 (2019).
  8. Lo Sardo, V., et al. Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing. Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).
  9. Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
  10. Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now. Stem Cells. 38, 822-833 (2020).
  11. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  12. Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
  13. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  14. Zhao, M. T., et al. Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).
  15. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  16. Lian, X., et al. Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation. Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).
  17. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  18. Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
  19. Liang, W., et al. Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).
  20. Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
  21. Ren, J., et al. Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes. Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).
  22. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).
  23. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).
  24. Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).
  25. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  26. Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism. Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).
  27. Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. Determinants of cardiac growth and size. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150 (2020).
  28. Campa, V. M., et al. Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).
  29. Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).
  30. Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

168 PBMCs iPSCs iPSC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved