JoVE Logo
Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour générer et développer de manière robuste des cardiomyocytes humains à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique du patient.

Résumé

La génération de cardiomyocytes spécifiques au patient à partir d’une seule prise de sang a suscité un énorme intérêt pour la médecine de précision sur les maladies cardiovasculaires. La différenciation cardiaque à partir des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPi) est modulée par des voies de signalisation définies qui sont essentielles au développement cardiaque embryonnaire. De nombreuses méthodes de différenciation cardiaque sur des plateformes 2D et 3D ont été développées avec diverses efficacités et rendements cardiomyocytaires. Cela a intrigué les chercheurs en dehors du terrain, car la variété de ces méthodes peut être difficile à suivre. Nous présentons ici un protocole complet qui élabore la génération et l’expansion robustes de cardiomyocytes spécifiques au patient à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC). Nous décrivons d’abord un protocole de reprogrammation iPSC à haute efficacité à partir de l’échantillon de sang d’un patient en utilisant des vecteurs du virus Sendai non intégrés. Nous détaillons ensuite une méthode de différenciation monocouche médiée par de petites molécules qui peut produire de manière robuste des cardiomyocytes battants à partir de la plupart des lignées iPSC humaines. En outre, un protocole évolutif d’expansion des cardiomyocytes est introduit à l’aide d’une petite molécule (CHIR99021) qui pourrait rapidement étendre les cardiomyocytes dérivés du patient pour des applications de qualité industrielle et clinique. À la fin, des protocoles détaillés pour l’identification moléculaire et la caractérisation électrophysiologique de ces iPSC-CM sont décrits. Nous nous attendons à ce que ce protocole soit pragmatique pour les débutants ayant des connaissances limitées sur le développement cardiovasculaire et la biologie des cellules souches.

Introduction

La découverte de cellules souches pluripotentes induites par l’homme a révolutionné la médecine cardiovasculaire moderne1,2. Les CSPi humaines sont capables de s’auto-renouveler et de générer tous les types de cellules dans le cœur, y compris les cardiomyocytes, les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses et les fibroblastes cardiaques. Les cardiomyocytes dérivés de l’iPSC des patients (iPSC-MC) peuvent servir de ressources indéfinies pour modéliser les maladies cardiovasculaires génétiquement héréditaires (MCV) et tester la sécurité cardiaque pour les nouveaux médicaments3. En particulier, les patients iPSC-CM sont bien placés pour étudier les étiologies génétiques et moléculaires des MCV dérivées de défauts dans les cardiomyocytes, tels que le syndrome du QT long4 et la cardiomyopathie dilatée (DCM)5. Combinés à l’édition du génome médiée par CRISPR / Cas9, les iPSC-CM des patients ont ouvert une voie sans précédent pour comprendre la base génétique complexe des MCV, y compris les malformations cardiaques congénitales (CHD)6,7,8. Les iPSC-CM humains ont également montré le potentiel de servir de sources cellulaires autologues pour reconstituer le myocarde endommagé lors d’une crise cardiaque9. Au cours des dernières années, il est devenu primordial de générer des iPSC-CM humains de haute qualité avec des sous-types définis (auriculaire, ventriculaire et nodal) pour la régénération cardiaque et les tests de médicaments10.

La différenciation cardiaque par rapport aux CSPi humaines a été très avancée au cours de la dernière décennie. Les méthodes de différenciation sont passées de la différenciation spontanée basée sur le corps embryoïde (EB) à la différenciation cardiaque chimiquement définie et dirigée11. Les molécules de signalisation clés essentielles au développement du cœur embryonnaire, telles que Wnt, BMP, Nodal et FGF, sont manipulées pour améliorer la différenciation des cardiomyocytes des CSPi humains10,12. Les progrès significatifs comprennent la modulation séquentielle de la signalisation Wnt (activation suivie d’inhibition) pour une génération robuste de cardiomyocytes à partir de CSPi humains13,14. Des recettes de différenciation cardiaque chimiquement définies ont été explorées pour faciliter la production à grande échelle de cardiomyocytesbattants 15,16, qui ont le potentiel d’être mis à niveau vers la production industrielle et clinique. De plus, l’expansion robuste des premiers iPSC-CM humains est obtenue par exposition à l’activation constitutive de Wnt à l’aide d’un petit produit chimique (CHIR99021)17. Plus récemment, les cardiomyocytes spécifiques au sous-type sont générés par manipulation des voies de signalisation de l’acide rétinoïque (PR) et de Wnt à des fenêtres de différenciation spécifiques lors de l’engagement de la lignée cardiomyocytaire des CSPi humaines18,19,20,21,22.

Dans ce protocole, nous détaillons une procédure de travail pour la génération et la prolifération robustes de MC humaines provenant de cellules mononucléaires du sang périphérique du patient. Nous présentons des protocoles pour 1) reprogrammer les PBMC humains en iPSC, 2) la génération robuste de cardiomyocytes battants à partir d’iPSC humains, 3) l’expansion rapide des iPSC-CM précoces, 4) la caractérisation moléculaire des iPSC-MC humains et 5) la mesure électrophysiologique des iPSC-CM humains au niveau d’une seule cellule par pince de patch. Ce protocole couvre les procédures expérimentales détaillées sur la conversion des cellules sanguines des patients en cardiomyocytes battants.

Protocole

Les protocoles expérimentaux et le consentement éclairé pour les sujets humains ont été approuvés par le Comité d’examen institutionnel (CISR) du Nationwide Children’s Hospital.

1. Préparation des milieux de culture cellulaire, des solutions et des réactifs

  1. Préparer les supports PBMC
    1. Mélanger 20 mL de milieux de culture PBMC basaux (1x) et 0,52 mL de supplément. Ajouter 20 μL de SCF et de FLT3 chacun (concentration en stock : 100 μg/mL), 4 μL d’IL3, d’IL6 et d’EPO chacun (concentration en stock : 100 μg/mL) et 200 μL d’alternative À la L-glutamine (100x). Mélangez-les bien. Filtrer dans une hotte stérile à l’aide d’une unité de filtration de 0,22 μm. Nommez-le comme Complete Blood Media.
    2. Mélanger 20 mL de milieux de culture PBMC basaux (1x) et 0,52 mL du supplément. Ajouter 200 μL d’alternative À la L-glutamine (100x). Mélangez-les bien. Filtrer à l’aide d’une unité de filtration de 0,22 μm. Nommez ceci comme Supplément Blood Media.
  2. Préparer le support E8 complet
    1. Mélanger 500 mL de milieu basal E8 et 10 mL de supplément E8 (décongelé pendant la nuit à 4 °C) pour obtenir un milieu E8 complet. Équilibrer à la température ambiante (RT) avant utilisation.
  3. Préparer les supports de passage iPSC
    1. Ajouter 40 μL d’inhibiteur de roche Y-27632 (dilution 1:5 000, concentration en stock : 10 mM) à 200 mL de milieu E8 complet. Mélangez bien. Équilibrez à RT avant utilisation.
  4. Préparer les milieux de différenciation cardiomyocytaire
    1. Média I : Mélanger 500 mL de RPMI1640 avec 10 mL de B27 moins supplément d’insuline (50x).
    2. Milieu II : Ajouter un volume approprié de CHIR99021 (inhibiteur de GSK3) au milieu I (concentration finale de CHIR99021 de 6 μM). Mélanger.
    3. Milieu III : Ajouter un volume approprié de stock d’IWR-1 (inhibiteur de Wnt) au milieu I (concentration finale d’IWR-1 de 5 μM). Mélanger.
    4. Média IV : Mélanger 500 mL de RPMI1640 avec 10 mL de supplément de B27 (50x). Mélanger.
    5. Média V : Mélanger 500 mL de RPMI1640 (sans glucose) avec 10 mL de supplément de B27 (50x). Mélanger.
    6. Média VI : Ajouter un volume approprié de stock de CHIR99021 au média IV (concentration finale de CHIR99021 de 2 μM). Mélanger.
  5. Préparer les supports de transmission iPSC-CM
    1. Ajouter 10 mL de Knockout Serum Replacement (KSR) à 90 mL de Média IV (concentration finale de KSR : 10 %). Bien mélanger.
  6. Préparer les supports de congélation iPSC-CM
    1. Ajouter 1 mL de DMSO à 9 mL de KSR (concentrations finales : 10 % de DMSO/90 % de KSR) et bien mélanger.
  7. Préparer des plaques à revêtement moyen de la matrice de membrane basale
    1. Décongeler le milieu de la matrice de la membrane basale à 4 °C pendant la nuit et aliquote dans des tubes de 1,5 mL. Ajouter 1 mL de ce milieu à 250 mL de milieu DMEM/F12 (dilution 1:250) et bien mélanger. Appliquer 2 mL de la solution diluée par puits dans une plaque à 6 puits et incuber dans 5 % de CO2 à 37 °C pendant 30 min avant utilisation.

2. Reprogrammation iPSC des PBMC

  1. Séparer les PBMC des échantillons de sang.
    1. Prélever des échantillons de sang de patients (~5 mL) et les transférer dans des tubes de séparation des cellules sanguines (voir tableau des matériaux). Mélanger en inversant 10x.
    2. Centrifuger à 1 500 x g pendant 30 min à température ambiante.
    3. Retirez soigneusement les tubes et vaporisez avec de l’éthanol à 70%. Sous une hotte de biosécurité, retirez les bouchons sans perturber les cellules mononucléaires (couche bouffante). Les PBMC seront dans une couche blanchâtre juste sous la couche de plasma(Figure 1A). Recueillir toute la couche de buffy à l’aide d’une pipette de 1000 μL et transférer dans un tube conique de 15 mL.
    4. Comptez le numéro de cellule à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Faire tourner le tube à 300 x g pendant 25 min à RT.
    5. Jetez le surnageant. Laver avec 10 mL de DPBS (Ca2+/ Mg2+ libre).
    6. Faire tourner le tube à 300 x g pendant 15 min à RT.
    7. Retirez le surnageant. Remettre en suspension les pastilles de cellules dans 1 mL de milieu de congélation (KSR plus 10 % de DMSO). Ajustez la densité cellulaire pour faire 1 x10 6 cellules par flacon.
    8. Placer les cryoviaux PBMC dans un récipient de congélation cellulaire et conserver à -80 °C pendant la nuit. Transférer dans un réservoir d’azote liquide pour un stockage à long terme le lendemain.
  2. Reprogrammation iPSC.
    1. Ajouter 3 mL de supplément de média sanguin dans un tube conique de 15 mL. Décongeler les PBMC au bain-marie à 37 °C et les transférer dans un tube conique. Tourner à 300 x g pendant 7 min à RT.
    2. Jetez le surnageant. Remettre en suspension les PBMC avec des supports sanguins complets. Ensemencez-les dans deux puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits (pas de matrice de membrane basale).
    3. Incuber dans 5% de CO2 à 37 °C pendant la nuit. Le lendemain, retirez doucement la moitié de l’ancien milieu (0,5 ml) et ajoutez 0,5 mL de milieu sanguin complet frais.
    4. Changez de média tous les deux jours en rafraîchissant la moitié des anciens médias.
    5. Après une semaine, lavez agressivement le puits avec 1 mL de média sanguin supplémentaire et transférez les cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
    6. Comptez le numéro de cellule. Prendre 2 x 105 cellules et centrifuger à 300 x g pendant 7 min.
    7. Jetez le surnageant. Remettre en suspension des cellules avec 300 μL de milieu sanguin complet. Effectuer la transfection en ajoutant le volume approprié de vecteurs de reprogrammation du virus Sendai conformément aux instructions du fabricant. Transférez-les dans un puits d’une plaque de 24 puits (pas de matrice de membrane basale). Incuber dans 5% de CO2 à 37 °C pendant la nuit.
    8. Le lendemain, tournez à 300 x g pendant 7 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 2 mL de milieu sanguin complet. Transférer dans un puits d’une plaque de 6 puits pré-enduite d’une matrice de membrane basale. C’est le Jour 1 (J1).
    9. Ne touchez pas l’assiette le lendemain.
    10. Sur D3, retirez 1 mL de l’ancien support. Ajouter 1 mL de supplément de média sanguin.
    11. Répétez l’étape 2.2.10 sur D5.
    12. Sur D7, retirez 1 mL de l’ancien support. Ajoutez 1 mL de média E8 complet.
    13. Sur D8, répétez l’étape 2.2.12.
    14. Sur D9, supprimez l’ancien support. Ajoutez 2 mL de média E8 complet. On s’attend à ce que les cellules entièrement reprogrammées se fixent et commencent à former des colonies.
    15. Rafraîchissez avec 2 mL de média E8 complet chaque jour.
    16. Environ 2 semaines après la transduction du virus Sendai, de grandes colonies d’iPSC apparaîtront et seront prêtes à être cueillies.
    17. Coupez les colonies d’iPSC sous un stéréomicroscope dans le capot et transférez les colonies individuelles sur une plaque de 24 puits recouverte d’une matrice de membrane basale préchargée avec 0,5 mL de milieu de passage iPSC.
    18. Rafraîchissez avec 0,5 mL de milieu E8 complet chaque jour jusqu’à ce que les colonies d’iPSC deviennent suffisamment grandes pour passer dans une nouvelle plaque de 6 puits recouverte d’une matrice de membrane basale.

3. Maintenance et passage humains de l’iPSC

  1. Lorsque les CSPi humains atteignent plus de 90 % de confluence, supprimez les anciens supports. Rincer avec 3 mL de DPBS une fois.
  2. Ajouter 1 mL de 0,5 mM d’EDTA dans la solution DPBS. Incuber dans 5% de CO2 à 37 °C pendant 5-8 min.
  3. Éliminer l’EDTA par aspiration. Ajouter 1 mL de support de passage iPSC. Délogez manuellement les iPSC.
  4. Prendre 600-900 μL de suspension à cellule unique et les plaquer à nouveau sur une plaque de 6 puits recouverte d’une matrice de membrane basale (dilution: 1:6 à 1:10). Incuber dans 5% de CO2 à 37 °C pendant la nuit.
  5. Rafraîchissez avec 2 mL de média E8 complet chaque jour. Les cultures iPSC atteignent généralement la confluence après 3-4 jours.

4. Différenciation des cardiomyocytes chimiquement définie

  1. Cultiver des CSPi humaines dans des milieux E8 complets jusqu’à 95% confluent (3-4 jours).
  2. Supprimez l’ancien support. Ajouter 2 mL de média de différenciation CM II (6 μM CHIR dans RPMI1640 plus B27 moins supplément d’insuline) à chaque puits d’une plaque de 6 puits. C’est D0. Ne touchez pas à D1.
  3. Sur D2, remplacer par 2 mL de média de différenciation CM I (RPMI1640 plus B27 moins supplément d’insuline).
  4. Sur D3, remplacer par 2 mL de média de différenciation CM III (5 μM IWR-1 dans RPMI1640 plus B27 moins supplément d’insuline). Ne touchez pas à D4.
  5. Sur D5, remplacer par 2 mL de différenciation CM Media I.
  6. Sur D7, remplacer par 2 mL de MÉDIA DE DIFFÉRENCIATION CM IV (RPMI1640 plus supplément B27). Par la suite, actualisez les médias tous les deux jours.
  7. Sur D11 lorsque des cellules contractantes sont observées, remplacer par 2 mL de média de différenciation CM V (pas de glucose).
  8. Sur D13, remplacer par 2 mL de différenciation CM Media V.
  9. Sur D15, remplacer par 2 mL de différenciation CM Media IV.
  10. Sur D17-D21, remplacer par 2 mL de différenciation CM Media IV tous les deux jours.

5. Passage des iPSC-CM humains

  1. Retirez les vieux milieux et rincez les cellules avec 3 mL de DPBS une fois.
  2. Appliquer 1 mL de solution de dissociation CM (voir Tableau des matériaux)sur chaque puits d’une plaque de 6 puits. Incuber dans 5% de CO2 à 37 °C pendant 5-8 min.
  3. Dissocier mécaniquement les iPSC-CM en cellules uniques par pipetage vigoureux.
  4. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 mL. Ajouter 2 mL de milieu de passage CM (10% KSR dans RMPI1640 plus supplément B27) pour neutraliser la solution de dissociation CM.
  5. Tourner à 300 x g pendant 5 min à RT.
  6. Jetez le surnageant. Resuspendez les cellules avec un volume souhaité de milieux de passage CM. Ensemencez-les dans une plaque/un plat recouvert d’une matrice de membrane basale. Les iPSC-CM humains recommencent à battre 1 à 3 jours après le passage.

6. Expansion des iPSC-CM humains

  1. Rincez D10-12 en battant les iPSC-CM avec 3 mL de DPBS pour chaque puits d’une plaque de 6 puits une fois. Ajouter 1 mL de solution de dissociation CM (étape 5.2). Incuber dans 5% de CO2 à 37 °C pendant 7-10 min.
  2. Dissocier mécaniquement les iPSC-CM en cellules uniques par pipetage vigoureux.
  3. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 mL. Ajouter 2 mL de milieu de passage CM pour neutraliser la solution de dissociation CM.
  4. Tourner à 300 x g pendant 5 min à RT.
  5. Jetez le surnageant. Remettre en suspension les cellules avec un volume approprié de milieux de passage CM. Pipette de haut en bas pour faire une suspension à cellule unique. Ensemencez un million d’iPSC-CM dans un plat de 10 cm recouvert d’une matrice de membrane basale.
  6. Le lendemain, supprimez les anciens médias. Ajouter 10 mL de milieux de prolifération cardiomyocytaire (Milieu VI : 2 μM CHIR99021). Changez les médias tous les deux jours.
  7. Lorsque les iPSC-CM deviennent confluents après 7 à 9 jours de culture, répétez l’étape de passage pour une expansion ultérieure des iPSC-CM.

7. Immunofluorescence

  1. Avant la coloration par immunofluorescence, ensemencez les iPSC-CM sur des couvercles recouverts de matrice de membrane basale qui sont placés dans une plaque de 24 puits (densité d’ensemencement: 0,5-1 x 106 cellules / mL). Maintenir les iPSC-CM en culture pendant au moins 4 jours.
  2. Lavez les cellules en utilisant 1 mL de DPBS une fois.
  3. Ajouter 0,5 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % et incuber pendant 15 min à TA.
  4. Laver les cellules à l’aide de 1 mL de DPBS. Répétez une fois.
  5. Ajouter 0,5 mL de Triton X-100 à 0,1 % et incuber pendant 20 min à TA.
  6. Laver deux fois avec 1 mL de DPBS.
  7. Ajouter 0,5 mL de 0,2% de BSA dans DPBS (solution bloquante). Incuber à RT pendant 1 h.
  8. Ajouter 200 μL d’anticorps primaire dilué avec une solution bloquante (dilution : 1:400-1:1000). Incuber à 4 °C pendant la nuit.
  9. Laver les cellules à l’aide de 0,5 mL de solution bloquante pendant 3 min en agitant. Répétez deux fois.
  10. Ajouter 200 μL d’anticorps secondaire dilué dans la solution bloquante. Incuber à RT pendant 1 h.
  11. Rincez les cellules trois fois avec 0,5 mL de DPBS, chacune pendant 3 min en agitant.
  12. Contre-taches de noyaux avec DAPI (dilution 1:2000) et incuber pendant 5 min à RT.
  13. Rincez les cellules trois fois avec 0,5 mL de DPBS.
  14. Montez des cellules sur les couvercles sur une lame de microscope à l’aide de 5 μl de support de montage. Conserver à 4 °C et à l’abri de la lumière.

8. Préparation d’échantillons de cytométrie en flux

  1. Lavez les iPSC-CM humains avec 3 mL de DPBS une fois.
  2. Ajouter 1 mL de solution de dissociation CM et incuber dans 5% de CO2 à 37 °C pendant 7-10 min.
  3. Déloger les cellules à l’aide d’une pipette de 1 000 μL. Transférer la suspension de la cellule dans un tube FACS rond à travers un capuchon de crépine. Le tube FACS est pré-rempli de 1 mL de milieu de passage iPSC-CM (10% KSR) pour neutraliser l’activité enzymatique.
  4. Tourner à 300 x g pendant 5 min.
  5. Retirez le surnageant sans perturber les granulés cellulaires. Ajouter 250 μL de solution de fixation/perméabilisation (voir tableau des matériaux). Incuber pendant 20 min à 4 °C.
  6. Ajouter 1 mL de tampon Perm/Wash. Vortex brièvement et rotation à 300 x g pendant 4 min.
  7. Jetez le surnageant. Ajouter 100 μL d’anticorps primaires dilués (1:200-1:500) dans 1x tampon Perm/Wash. Vortex brièvement et incubation pendant la nuit à 4 °C.
  8. Lavez les cellules en ajoutant 1 mL de tampon Perm/Wash. Vortex brièvement et rotation à 300 x g pendant 4 min.
  9. Jetez le surnageant. Ajouter 100 μL d’anticorps secondaires dilués (1:500-1:1 000). Vortex brièvement et incubation à RT pendant 1 h. Protéger de la lumière si les anticorps secondaires sont conjugués avec une fluorescence sensible à la lumière.
  10. Lavez les cellules en ajoutant 1 mL de tampon Perm/wash. Vortex brièvement et rotation à 300g pendant 4 min.
  11. Jetez le surnageant. Remettez en suspension des cellules avec 400 μL de tampon de coloration FACS (PBS/4% FBS). Conserver à 4 °C jusqu’au chargement sur un instrument FACS.

9. QPCR en temps réel

  1. Supprimer les anciens médias dans la culture iPSC-CM humaine. Ajouter 500-700 μL de tampon de lyse aux cellules lysées. Incuber pendant 3 min à RT. Lysat de cellule Scape et transférer dans un tube sans RNase de 1,5 ml. Procéder immédiatement à l’extraction totale de l’ARN ou le stocker à -80 °C.
  2. Isolez l’ARN total à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN en suivant les instructions du fabricant.
  3. Mesurer la concentration d’ARN et évaluer la qualité de l’ARN total à l’aide d’un spectrophotomètre.
  4. Effectuez une réaction de transcription inverse à l’aide d’un kit de synthèse d’ADNc. Le volume total de la réaction RT est de 20 μL, y compris 4 μL de mélange réactionnel (5x), 1 μL de transcriptase inverse, 1 μg d’ARN total et d’eau sans RNase.
  5. Incuber le mélange complet de réaction RT dans un cycleur thermique en utilisant le protocole suivant: 25 °C pendant 5 min; 46 °C pendant 20 min; 95 °C pendant 1 min; maintenir à 4 °C.
  6. Diluer l’ADNc de 1:10 en utilisant de l’eau sans nucléase. Configurez la réaction qPCR en temps réel en mélangeant 1 μL de gabarit d’ADNc, 1 μL d’amorces/sondes, 10 μL de mélange maître de qPCR et 8 μL d’eau sans nucléase.
  7. Exécuter dans un système de PCR en temps réel. Le protocole de cycle est de 50 °C 2 min (maintien), 95 °C 10 min (maintien), 95 °C 15 sec, 60 °C 1 min, répétez pendant 40 cycles.
  8. Recueillir les valeurs CT pour chaque gène dans chaque échantillon. L’abondance relative de l’ARNm est calculée en soustrayant la valeur CT du gène cible de la valeur CT d’un gène d’entretien ménager. L’expression relative des gènes est analysée par la méthode2 -ΔΔCT.

10. Enregistrement de la pince de patch à cellules entières

  1. Dissocier les iPSC-CM en cellules uniques à l’aide d’une solution de dissociation CM comme décrit précédemment.
  2. Cellules de semence à faible densité sur des couvercles recouverts de matrice de membrane basale. Cultivez-les pendant 3-4 jours dans Media IV.
  3. Tirez des pipettes (résistance 0,9-1,5 MΩ) à partir de capillaires en verre borosilicate à l’aide d’un extracteur horizontal à microélectrodes.
  4. Incuber des cellules dans la solution de Tyrode (pH = 7,35).
  5. Remplissez les pipettes avec une solution d’électrode (pH = 7,3) composée des produits chimiques suivants: 120 mM d’acide aspartique, 20 mM KCl, 2 mM MgCl2,5 mM HEPES, 10 mM NaCl, 5 mM EGTA, 0,3 mM Na-GTP, 14 mM phosphocréatine, 4 mM K-ATP et 2 mM créatine phosphokinase.
  6. Placez les cellules en mode de serrage actuel en utilisant une impulsion de courant de 5 ms à seuil diastolique de 1,5-2 à 1 Hz.
  7. Enregistrez les potentiels d’action (AP) à l’aide d’un amplificateur à microélectrodes et d’une carte d’acquisition pilotée par logiciel.

Résultats

Reprogrammation iPSC humaine à partir de PBMC
Après une pré-culture avec des milieux sanguins complets pendant 7 jours, les PBMC deviennent gros avec des noyaux visibles et du cytoplasme (Figure 1B), indiquant qu’ils sont prêts pour la transfection du virus. Après la transfection avec les facteurs de reprogrammation du virus Sendai, les PBMC subiront un processus de reprogrammation épigénétique pendant une autre semaine. En règl...

Discussion

Lors de la reprogrammation iPSC, il est essentiel de cultiver des PBMC pendant 1 semaine jusqu’à ce qu’ils soient élargis avec des noyaux clairs et du cytoplasme. Étant donné que les PBMC ne prolifèrent pas, un nombre de cellules approprié pour la transduction virale est important pour une reprogrammation réussie des CSPi. Le nombre de cellules des PBMC, la multiplicité de l’infection (MOI) et le titre du virus doivent être pris en compte et ajustés pour atteindre les résultats optimaux de transduction. ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par le prix de développement de carrière 18CDA34110293 (M-T.Z.) de l’American Heart Association (AHA), les prix Additional Ventures AVIF et SVRF (M-T.Z.), les subventions 1R01HL124245, 1R01HL132520 et R01HL096962 (I.D.). Le Dr Ming-Tao Zhao a également été soutenu par des fonds de démarrage de l’Institut de recherche Abigail Wexner du Nationwide Children’s Hospital.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
ABI 7300 Fast Real-Time PCR SystemThermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Microelectrode AmplifierMolecular DevicesMicroelectrode Amplifier
B27 supplementThermo Fisher Scientific17504044
B27 supplement minus insulinThermo Fisher ScientificA1895601
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization KitBD Biosciences554714Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer
BD Vacutainer CPT tubeBD Biosciences362753Blood cell separation tube
CHIR99021Selleck ChemicalsS2924
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming KitThermo Fisher ScientificA16517Sendai virus reprogramming kit
Digidata 1200BAxon InstrumentsAcquisition board
Direct-zol RNA Miniprep kitZymo ResearchR2050RNA extraction kit
DMEM/F12Thermo Fisher Scientific11330057
Essential 8 mediumThermo Fisher ScientificA1517001E8 media for iPSC culture
GlutaMAX supplementThermo Fisher Scientific35050061L-glutamine alternative
Growth factor reduced MatrigelCorning356231Basement membrane matrix
iScript cDNA Snythesis KitBio-Rad1708891cDNA synthesis
IWR-1-endoSelleck ChemicalsS7086
KnockOut Serum Replacement (KSR)Thermo Fisher Scientific10828028
pCLAMP 7.0Molecular DevicesElectrophysiology data acquisition & analysis software
Recombinant human EPOThermo Fisher ScientificPHC9631
Recombinant human FLT3Thermo Fisher ScientificPHC9414
Recombinant human IL3Peprotech200-03
Recombinant human IL6Thermo Fisher ScientificPHC0065
Recombinant human SCFPeprotech300-07
RPMI 1640 mediumThermo Fisher Scientific11875093
RPMI 1640 medium, no glucoseThermo Fisher Scientific11879020
SlowFade Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificS36936Mounting media
StemPro-34 SFMThermo Fisher Scientific10639011PBMC culture media
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444964qPCR master mix
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol redThermo Fisher ScientificA1217703CM dissociation solution
UltraPure 0.5 M EDTAThermo Fisher Scientific15575020iPSC dissociation solution
Y-27632 2HClSelleck ChemicalsS1049

Références

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  3. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
  4. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  5. Hinson, J. T., et al. Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy. Science. 349 (6251), 982-986 (2015).
  6. Deacon, D. C., et al. Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy. Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).
  7. Gifford, C. A., et al. Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier. Science. 364 (6443), 865-870 (2019).
  8. Lo Sardo, V., et al. Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing. Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).
  9. Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
  10. Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now. Stem Cells. 38, 822-833 (2020).
  11. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  12. Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
  13. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  14. Zhao, M. T., et al. Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).
  15. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  16. Lian, X., et al. Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation. Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).
  17. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  18. Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
  19. Liang, W., et al. Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).
  20. Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
  21. Ren, J., et al. Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes. Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).
  22. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).
  23. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).
  24. Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).
  25. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  26. Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism. Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).
  27. Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. Determinants of cardiac growth and size. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150 (2020).
  28. Campa, V. M., et al. Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).
  29. Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).
  30. Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

Biologie du d veloppementnum ro 168cellules mononucl aires du sang p riph riquePBMCcellules souches pluripotentes induites par l hommeCSPidiff renciation cardiaquereprogrammation des CSPiexpansion des cardiomyocytes

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.