JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי ליצור ולהרחיב בחוזקה קרדיומיוציטים אנושיים מתאי דם היקפיים של מטופלים.

Abstract

יצירת קרדיומיוציטים ספציפיים למטופלים מהגרלת דם אחת משכה עניין עצום ברפואה מדויקת על מחלות לב וכלי דם. הבחנה לבבית מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם (iPSCs) מווסתתת על ידי מסלולי איתות מוגדרים החיוניים להתפתחות הלב העוברי. שיטות שונות לבידול לב על פלטפורמות 2-D ו 3-D פותחו עם יעילות שונים ותפוקת cardiomyocyte. זה יש חוקרים תמוהים מחוץ לתחום כמו מגוון של שיטות אלה יכול להיות קשה לעקוב. כאן אנו מציגים פרוטוקול מקיף המפרט ייצור חזק והרחבה של קרדיומיוציטים ספציפיים למטופל מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs). ראשית אנו מתארים פרוטוקול תכנות מחדש IPSC יעילות גבוהה מדגימת הדם של המטופל באמצעות וקטורים וירוס סנדאי ללא שילוב. לאחר מכן אנו מפרטים שיטת בידול מונו-שכבתית קטנה בתיווך מולקולה שיכולה לייצר קרדיומיוציטים מכים מרוב קווי ה- iPSC האנושיים. בנוסף, פרוטוקול הרחבת קרדיומיוציטים מדרגי מוצג באמצעות מולקולה קטנה (CHIR99021) שיכולה להרחיב במהירות קרדיומיוציטים שמקורם בחולים עבור יישומים ברמה תעשייתית וקלינית. בסוף, פרוטוקולים מפורטים לזיהוי מולקולרי ואפיון אלקטרופיזיולוגי של iPSC-CMs אלה מתוארים. אנו מצפים פרוטוקול זה להיות פרגמטי למתחילים עם ידע מוגבל על התפתחות הלב וכלי הדם וביולוגיה של תאי גזע.

Introduction

גילוי תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים על ידי האדם חולל מהפכה ברפואת הלב וכלי הדם המודרנית1,2. IPSCs אנושיים מסוגלים לחדש את עצמם וליצור את כל סוגי התאים בלב, כולל cardiomyocytes, תאי אנדותל, תאי שריר חלקים פיברובלסטים לב. קרדיומיוציטים שמקורם ב- iPSC (iPSC-CMs) יכולים לשמש כמשאבים בלתי מוגבלים למידול מחלות לב וכלי דם תורשתיות גנטית (CVDs) ובדיקת בטיחות הלב לתרופות חדשות3. בפרט, iPSC-CMs המטופל צפויים היטב לחקור אטיולוגיות גנטיות ומולקולריות של קורות חיים שמקורם פגמים cardiomyocytes, כגון תסמונת QT ארוכה4 וקרדיומיופתיה המופרדת (DCM)5. בשילוב עם עריכת הגנום בתיווך CRISPR/Cas9, IPSC-CMs המטופל פתחו שדרה חסרת תקדים כדי להבין את הבסיס הגנטי המורכב של תקליטורי CVD כולל מומים מולדים בלב (CHDs)6,7,8. IPSC-CMs אנושיים הציגו גם פוטנציאל לשמש כמקורות תאים אוטולוגיים לחידוש שריר הלב הפגוע במהלך התקף לב9. בשנים האחרונות, זה הפך להיות בעל חשיבות עליונה כדי ליצור iPSC-CMs אנושי באיכות גבוהה עם תת סוגים מוגדרים (פרזדורים, חדרית ונודאל) עבור התחדשות הלב ובדיקות סמים10.

הבחנה לבבית מ- IPSCs אנושית התקדמה מאוד בעשור האחרון. שיטות בידול עברו מהבחנה ספונטנית מבוססת גוף עוברית (EB) לבידול לבבי מוגדר ומכוון כימית11. מולקולות איתות מרכזיות החיוניות להתפתחות הלב העוברי, כגון Wnt, BMP, Nodal ו- FGF מופעלות כדי לשפר את הבידול הקרדיומיוציטים מ- iPSCs אנושי10,12. התקדמות משמעותית כוללת אפנון רציף של איתות Wnt (הפעלה ואחריו עיכוב) עבור דור חזק של cardiomyocytes מ IPSCs אנושי13,14. מתכונים לביולוגיה מוגדרים כימית נחקרו כדי להקל על ייצור בקנה מידה גדול של להכות cardiomyocytes15,16, אשר יש פוטנציאל להיות משודרג לייצור ברמה תעשייתית וקלינית. יתר על כן, הרחבה חזקה של iPSC-CMs אנושי מוקדם מושגת על ידי חשיפה להפעלת Wnt המרכיבה באמצעות כימי קטן (CHIR99021)17. לאחרונה, קרדיומיוציטים ספציפיים תת-סוג נוצרים באמצעות מניפולציה של חומצה רטינואית (RA) ו Wnt איתות מסלולים בחלונות בידול ספציפיים במהלךמחויבות שושלתקרדיומיוציטים מ- iPSCs אנושי 18,19,20,21,22.

בפרוטוקול זה, אנו מפרטים הליך עבודה לייצור חזק והתפשטות של CMs אנושי שמקורו בתאים מונונוקלאריים של דם היקפי של מטופל. אנו מציגים פרוטוקולים עבור 1) תכנות מחדש של מחשבים אישיים אנושיים ל- iPSCs, 2) דור חזק של קרדיומיוציטים מכים מ- iPSCs אנושיים, 3) התרחבות מהירה של IPSC-CMs מוקדמים, 4) אפיון מולקולרי של IPSC-CMs אנושיים, ו -5) מדידה אלקטרופיזיולוגית של iPSC-CMs אנושיים ברמת התא הבודד על ידי מהדק תיקון. פרוטוקול זה מכסה את ההליכים הניסיוניים המפורטים על המרת תאי דם של מטופלים להכות cardiomyocytes.

Protocol

הפרוטוקולים הניסיוניים וההסכמה מדעת לנבדקים אנושיים אושרו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית (IRB) בבית החולים הלאומי לילדים.

1. הכנת מדיה, פתרונות וריאגנטים של תרבות התאים

  1. הכנת מדיית PBMC
    1. לערבב 20 מ"ל של מדיה תרבות PBMC בזאלי (1x) ו 0.52 מ"ל של תוספת. הוסף 20 μL של SCF ו FLT3 כל אחד (ריכוז מלאי: 100 מיקרוגרם / מ"ל), 4 μL של IL3, IL6 ו- EPO כל אחד (ריכוז מלאי: 100 מיקרוגרם / מ"ל) ו 200 μL של חלופת L-גלוטמין (100x). מערבבים אותם ביסודיות. מסנן במכסה המנוע הסטרילי באמצעות יחידת סינון 0.22-μm. תן שם לזה כמדיה מלאה בדם.
    2. ערבבו 20 מ"ל של מדיה תרבותית PBMC בזאלית (1x) ו-0.52 מ"ל של התוספת. הוסף 200 μL של חלופה L-גלוטמין (100x). מערבבים אותם ביסודיות. סנן באמצעות יחידת סינון של 0.22 מיקרומטר. תן שם לזה כמדיה בדם משלים.
  2. הכנת מדיה E8 מלאה
    1. לערבב 500 מ"ל של E8 בזל מדיה ו 10 מ"ל של תוספת E8 (מופשר לילה ב 4 °C (7 °F) כדי להפוך את המדיה E8 מלאה. יש להקפליל לטמפרטורת החדר (RT) לפני השימוש.
  3. הכנת מדיה מעבירה של IPSC
    1. הוסף 40 μL של מעכב סלע Y-27632 (1:5,000 דילול, ריכוז מלאי: 10 מ"מ) עד 200 מ"ל של מדיה E8 מלאה. מערבבים את זה ביסודיות. יש לתפלות ל-RT לפני השימוש.
  4. הכנת מדיה בידול קרדיומיוצייט
    1. מדיה I: לערבב 500 מ"ל של RPMI1640 עם 10 מ"ל של B27 פחות תוסף אינסולין (50x).
    2. מדיה II: הוסף נפח מתאים של מלאי CHIR99021 (מעכב GSK3) ל- Media I (CHIR99021 ריכוז סופי של 6 מיקרומטר). מערבבים היטב.
    3. מדיה III: הוסף נפח מתאים של מלאי IWR-1 (מעכב Wnt) ל- Media I (IWR-1 ריכוז סופי של 5 מיקרומטר). מערבבים היטב.
    4. מדיה IV: לערבב 500 מ"ל של RPMI1640 עם 10 מ"ל של תוספת B27 (50x). מערבבים היטב.
    5. מדיה V: לערבב 500 מ"ל של RPMI1640 (ללא גלוקוז) עם 10 מ"ל של תוסף B27 (50x). מערבבים היטב.
    6. מדיה VI: הוסף נפח מתאים של מניית CHIR99021 ל- Media IV (CHIR99021 ריכוז סופי של 2 מיקרומטר). מערבבים היטב.
  5. הכנת מדיית העברת IPSC-CM
    1. הוסף 10 מ"ל של החלפת סרום נוקאאוט (KSR) ל- 90 מ"ל של מדיה IV (ריכוז סופי של KSR: 10%). מערבבים היטב.
  6. הכנת מדיית הקפאה של IPSC-CM
    1. הוסף 1 מ"ל של DMSO ל 9 מ"ל של KSR (ריכוזים סופיים: 10% DMSO / 90% KSR) ומערבב היטב.
  7. הכן צלחות מצופות בינוניות מטריצת קרום מרתף
    1. מטריצת ממברנה מרתף להפשיר ב 4 °C (5 °F) לילה aliquot ב 1.5 mL צינורות. הוסף 1 מ"ל של מדיום זה עד 250 מ"ל של מדיה DMEM / F12 (1:250 דילול) ולערבב אותם ביסודיות. יש למרוח 2 מ"ל מהפתרון המדולדל לבאר בצלחת של 6 בארות ולדגירה ב-5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני השימוש.

2. תכנות מחדש של מחשבים אישיים

  1. הפרד מחשבים אישיים מדגימות דם.
    1. לאסוף דגימות דם המטופל (~ 5 מ"ל) ולהעביר לתוך צינורות הפרדת תאי דם (ראה טבלה של חומרים). מערבבים על ידי היפוך 10x.
    2. צנטריפוגה ב 1,500 x g במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. מוציאים את הצינורות בזהירות ומרססים עם 70% אתנול. מתחת למכסה המנוע, הסירו את הכובעים מבלי להפריע לתאים המונונוקלאריים (שכבת באפי). מחשבי PBMCs יהיו בשכבה לבנבנית ממש מתחת לשכבת הפלזמה(איור 1A). לאסוף את כל שכבת באפי באמצעות 1000 μL pipette ולהעביר צינור חרוט 15 מ"ל.
    4. ספר את מספר התא באמצעות מונה תאים אוטומטי. לסובב את הצינור ב 300 x g במשך 25 דקות ב RT.
    5. זרוק את סופר-טבעי. לשטוף עם 10 מ"ל של DPBS (Ca2 +/ מ"ג2 + חינם).
    6. לסובב את הצינור ב 300 x g במשך 15 דקות ב RT.
    7. הסר את סופר-טבעי. כדורים של תאים resuspend ב 1 מ"ל של מדיה הקפאה (KSR בתוספת 10% DMSO). התאם את צפיפות התאים כדי ליצור 1 x 106 תאים לכל אווי.
    8. מניחים את ההקפאה PBMC במיכל הקפאת תאים ושומרים על -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה. מעבירים למיכל חנקן נוזלי לאחסון ארוך למחרת.
  2. תכנות מחדש של iPSC.
    1. הוסף 3 מ"ל של תוספת דם מדיה בצינור חרוט 15 מ"ל. הפשירו מחשבי PBMCs באמבט מים 37 °C והעבירו אותם לצינור חרוטי. ספין ב 300 x g במשך 7 דקות ב RT.
    2. זרוק את סופר-טבעי. מחשבי PBMd resuspend עם מדיית דם מלאה. זרע אותם לשתי בארות של 24 לוחות תרבית רקמות היטב (ללא מטריצת קרום מרתף).
    3. דגירה ב 5% CO2 ב 37 °C (5 °F) לילה. למחרת להסיר בעדינות מחצית המדיה הישנה (0.5 מ"ל) ולהוסיף 0.5 מ"ל של מדיה דם מלא טרי.
    4. שנה מדיה כל יומיים על ידי רענון חצי מהתקשורת הישנה.
    5. לאחר שבוע, לשטוף באגרסיביות את הבאר עם 1 מ"ל של תוספת דם ולהעביר תאים לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
    6. תספור את מספר התא. קח 2 x 105 תאים וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 7 דקות.
    7. זרוק את סופר-טבעי. תאים resuspend עם 300 μL של מדיה בדם מלא. בצע transfection על ידי הוספת נפח מתאים של וירוס סנדאי תכנות וקטורים בהתאם להוראות היצרן. מעבירים אותם לבאר אחת של צלחת 24-well (ללא מטריצת קרום מרתף). דגירה ב 5% CO2 ב 37 °C (5 °F) לילה.
    8. למחרת להסתובב ב 300 x g במשך 7 דקות. הסר את supernatant ו resuspend ב 2 מ"ל של מדיה דם מלא. מעבירים לבאר אחת של צלחת 6 באר מצופה מראש במטריצת קרום המרתף. זהו יום 1 (D1).
    9. אל תיגע בצלחת למחרת.
    10. ב- D3, הסר 1 מ"ל מהמדיה הישנה. הוסף 1 מ"ל של תוספת דם מדיה.
    11. חזור על שלב 2.2.10 ב- D5.
    12. ב- D7, הסר 1 מ"ל מהמדיה הישנה. הוסף 1 מ"ל של מדיה E8 מלאה.
    13. ב- D8, חזור על שלב 2.2.12.
    14. ב- D9, הסר את המדיה הישנה. הוסף 2 מ"ל של מדיית E8 מלאה. תאים מתוכנתים מחדש לחלוטין צפויים לצרף ולהתחיל ליצור מושבות.
    15. רענן עם 2 מ"ל של מדיה מלאה E8 מדי יום.
    16. כשבועיים לאחר התמלת וירוס סנדאי, מושבות IPSC גדולות יופיעו ויהיו מוכנות לקטיף.
    17. חותכים מושבות IPSC מתחת לסטריאומיקוסקופ בשכונה ומעבירים מושבות בודדות לצלחת 24-באר מצופה מטריצת מרתף עמוסה מראש ב-0.5 מ"ל של מדיה מעבירה של iPSC.
    18. רענן עם 0.5 מ"ל של מדיה E8 מלאה מדי יום עד מושבות iPSC לגדול מספיק עבור עובר לתוך צלחת קרום מרתף חדש מצופה מטריצה 6-טוב.

3. תחזוקה ועבר של IPSC אנושיים

  1. כאשר IPSCs אנושיים מגיעים ליותר מ-90% השפעה, הסר מדיה ישנה. יש לשטוף פעם אחת ב-3 מ"ל של DPBS.
  2. הוסף 1 מ"ל של 0.5 מ"מ EDTA בפתרון DPBS. דגירה ב 5% CO2 ב 37 °C (5-8 דקות).
  3. הסר EDTA על ידי שאיפה. הוסף 1 מ"ל של מדיה עוברת iPSC. הסר באופן ידני IPSCs.
  4. קח 600-900 μL של השעיית תא יחיד ולוחות אותם מחדש על צלחת 6-באר מצופה מטריצת מטריצת מרתף (דילול: 1:6 עד 1:10). דגירה ב 5% CO2 ב 37 °C (5 °F) לילה.
  5. רענן עם 2 מ"ל של מדיה מלאה E8 מדי יום. תרבויות IPSC בדרך כלל להגיע למפגש לאחר 3-4 ימים.

4. בידול קרדיומיוצית מוגדר כימית

  1. תרבות IPSCs אנושית במדיה E8 מלאה עד 95% confluent (3-4 ימים).
  2. הסר את המדיה הישנה. הוסף 2 מ"ל של CM בידול מדיה II (6 μM CHIR ב RPMI1640 בתוספת B27 פחות תוסף אינסולין) לכל באר של צלחת 6-well. זה די-0. אל תיגע ב-די-1.
  3. ב- D2, החלף ב- 2 מ"ל של מדיה בידול CM I (RPMI1640 בתוספת B27 פחות תוסף אינסולין).
  4. ב- D3, החליפו ב- 2 מ"ל של מדיה בידול CM III (5 מיקרומטר IWR-1 ב- RPMI1640 בתוספת B27 פחות תוסף אינסולין). אל תיגע ב-די-4.
  5. ב- D5, החלף ב- 2 מ"ל של מדיה בידול CM I.
  6. ב- D7, החלף ב- 2 מ"ל של מדיה IV של בידול CM (RPMI1640 בתוספת תוספת B27). לאחר מכן, לרענן את התקשורת כל יומיים.
  7. ב- D11 כאשר תאים מתכווצים נצפים, החלף ב- 2 מ"ל של מדיה בידול CM V (ללא גלוקוז).
  8. ב- D13, החלף ב- 2 מ"ל של מדיה V של בידול CM.
  9. ב- D15, החלף ב- 2 מ"ל של מדיה IV של בידול CM.
  10. ב- D17-D21, החלף ב- 2 מ"ל של מדיה IV של בידול CM מדי יומיים.

5. מעבר IPSC-CMs אנושי

  1. הסר מדיה ישנה ושטוף תאים עם 3 מ"ל של DPBS פעם אחת.
  2. החל 1 מ"ל של פתרון דיסוציאציה CM (ראה טבלה של חומרים) על כל באר של צלחת 6-באר. דגירה ב 5% CO2 ב 37 °C (5-8 דקות).
  3. נתק באופן מכני iPSC-CMs לתאים בודדים על-ידי צנרת נמרצת.
  4. העבר תאים לתוך צינור חרוט 15 מ"ל. הוסף 2 מ"ל של מדיית העברת CM (10% KSR ב- RMPI1640 בתוספת תוספת B27) כדי לנטרל פתרון דיסוציאציה CM.
  5. ספין ב 300 x g במשך 5 דקות ב RT.
  6. זרוק את סופר-טבעי. תאים המחודשים עם אמצעי האחסון הרצוי של מדיית העברת CM. זרע אותם לתוך צלחת / צלחת מצופה מטריצת מטריצה במרתף. IPSC-CMs אנושי לחדש להכות 1-3 ימים לאחר פטירתו.

6. הרחבת IPSC-CMs אנושיים

  1. יש לשטוף D10-12 ב-iPSC-CMs עם 3 מ"ל של DPBS עבור כל באר של צלחת 6-באר פעם אחת. הוסף 1 מ"ל של פתרון דיסוציאציה CM (שלב 5.2). דגירה ב 5% CO2 ב 37 °C (7-10 דקות).
  2. נתק באופן מכני iPSC-CMs לתאים בודדים על-ידי צנרת נמרצת.
  3. העבר תאים לתוך צינור חרוט 15 מ"ל. הוסף 2 מ"ל של מדיית העברת CM לנטרול פתרון דיסוציאציה CM.
  4. ספין ב 300 x g במשך 5 דקות ב RT.
  5. זרוק את סופר-טבעי. תאים המחודשים עם אמצעי אחסון מתאים של מדיית העברת CM. פיפטה למעלה ולמטה כדי ליצור השעיה של תא בודד. זרע מיליון iPSC-CMs לתוך צלחת מטריצת מטריצת מרתף מצופה 10 ס"מ.
  6. למחרת להסיר מדיה ישנה. הוסף 10 מ"ל של מדיה התפשטות cardiomyocyte (מדיה VI: 2 μM CHIR99021). לשנות את התקשורת כל יומיים.
  7. כאשר iPSC-CMs הופכים למפגש לאחר תרבות של 7-9 ימים, חזור על שלב המעבר להרחבה נוספת של iPSC-CMs.

7. אימונופלואורסצנטיות

  1. לפני כתמי immunofluorescence, זרע iPSC-CMs על כיסויים מצופים מטריצת מטריצת מרתף הממוקמים בצלחת 24 באר (צפיפות זריעה: 0.5-1 x 106 תאים / מ"ל). שמור על iPSC-CMs בתרבות למשך 4 ימים לפחות.
  2. לשטוף תאים באמצעות 1 מ"ל של DPBS פעם אחת.
  3. הוסף 0.5 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) ודגרה במשך 15 דקות ב RT.
  4. לשטוף תאים באמצעות 1 מ"ל של DPBS. חזור פעם אחת.
  5. הוסיפו 0.5 מ"ל של 0.1% טריטון X-100 ודגרפו למשך 20 דקות ב-RT.
  6. לשטוף עם 1 מ"ל של DPBS פעמיים.
  7. הוסף 0.5 מ"ל של 0.2% BSA ב- DPBS (פתרון חסימה). דגירה ב RT במשך 1 שעה.
  8. הוסף 200 μL של נוגדן ראשוני מדולל עם פתרון חסימה (דילול: 1:400-1:1000). דגירה ב 4 °C (5 °F) לילה.
  9. לשטוף תאים באמצעות 0.5 מ"ל של פתרון חסימה במשך 3 דקות עם רועד. חזור פעמיים.
  10. הוסף 200 μL של נוגדן משני מדולל בתמיסת החסימה. דגירה ב RT במשך 1 שעה.
  11. לשטוף תאים שלוש פעמים עם 0.5 מ"ל של DPBS, כל אחד במשך 3 דקות עם רועד.
  12. גרעינים נגדיים עם DAPI (דילול 1:2000) ודגרה למשך 5 דקות ב- RT.
  13. לשטוף תאים שלוש פעמים עם 0.5 מ"ל של DPBS.
  14. הטען תאים על כיסויים על שקופית מיקרוסקופ באמצעות 5 μl של מדיה הרכבה. יש לאחסן ב-4 °C (75°F) ולהגן מפני אור.

8. הכנת דגימת ציטומטריית זרימה

  1. לשטוף iPSC-CMs אנושי עם 3 מ"ל של DPBS פעם אחת.
  2. הוסף 1 מ"ל של פתרון דיסוציאציה CM ודגרה ב 5% CO2 ב 37 °C (7-10 דקות).
  3. נתק תאים באמצעות פיפטה של 1,000 מיקרו-ΜL. העבר מתלה תא לצינור FACS עגול דרך מכסה מסננת. צינור ה- FACS מלא מראש ב- 1 מ"ל של מדיה עוברת IPSC-CM (10% KSR) כדי לנטרל את פעילות האנזים.
  4. ספין ב 300 x g במשך 5 דקות.
  5. הסר supernatant ללא כדורי תא מטרידים. הוסף 250 μL של פתרון קיבעון/פרמיביליזציה (ראה טבלת חומרים). דגירה במשך 20 דקות ב 4 °C (5 °F).
  6. הוסף 1 מ"ל של מאגר פרם/שטיפה. מערבולת בקצרה להסתובב ב 300 x g במשך 4 דקות.
  7. זרוק את סופר-טבעי. הוסף 100 μL של נוגדנים ראשוניים מדוללים (1:200-1:500) במאגר פרם/שטיפה אחד. מערבולת לזמן קצר ודגרה לילה ב 4 °C (5 °F).
  8. לשטוף תאים על ידי הוספת 1 מ"ל של מאגר פרם / לשטוף. מערבולת בקצרה להסתובב ב 300 x g במשך 4 דקות.
  9. זרוק את סופר-טבעי. הוסף 100 μL של נוגדנים משניים מדוללים (1:500-1:1,000). מערבולת בקצרה ודגרה ב RT במשך 1 שעה. יש להגן מפני אור אם נוגדנים משניים מצומדים עם פלואורסצנטיות רגישה לאור.
  10. לשטוף תאים על ידי הוספת 1 מ"ל של מאגר פרם / לשטוף. מערבולת בקצרה להסתובב ב 300 גרם במשך 4 דקות.
  11. זרוק את סופר-טבעי. תאים resuspend עם 400 μL של מאגר כתמי FACS (PBS / 4% FBS). יש לאחסן ב- 4 °C (7%), עד לטעינה למכשיר FACS.

9. QPCR בזמן אמת

  1. הסר מדיה ישנה בתרבות IPSC-CM האנושית. הוסף 500-700 μL של מאגר תמה כדי ליסייט תאים. דגירה במשך 3 דקות ב RT. RT. lysate תא שעיר לעזאזל ולהעביר לצינור 1.5 מ"ל ללא RNase. המשך לחילוץ RNA הכולל באופן מיידי או לאחסן ב -80 °C (70 °F).
  2. בודד RNA כולל באמצעות ערכת חילוץ RNA בהתאם להוראת היצרן.
  3. למדוד את ריכוז הרנ"א ולהעריך את האיכות של RNA הכולל על ידי ספקטרופוטומטר.
  4. בצע תגובת תמלול הפוכה באמצעות ערכת סינתזה של cDNA. הנפח הכולל של תגובת RT הוא 20 μL כולל 4 μL של תערובת תגובה (5x), 1 μL של תמלול הפוך,1 מיקרוגרם של RNA הכולל ומים ללא RNase.
  5. לדגור את תערובת תגובת RT מלאה רוכב אופניים תרמי באמצעות הפרוטוקול הבא: 25 °C (5 דקות); 46 °C (77°F) למשך 20 דקות; 95 °C (75 °F) למשך דקה אחת; החזק ב 4 °C (5 °F).
  6. לדלל את CDNA על ידי 1: 10 באמצעות מים ללא נוקלאז. הגדר תגובת qPCR בזמן אמת על ידי ערבוב 1 μL של תבנית cDNA, 1 μL של פריימרים / בדיקה, 10 μL של תערובת מאסטר qPCR ו 8 μL של מים ללא נוקלאז.
  7. הפעל במערכת PCR בזמן אמת. פרוטוקול רכיבה על אופניים הוא 50 °C 2 דקות (להחזיק), 95 °C 10 דקות (להחזיק), 95 °C 15 שניות, 60 °C 1 דקות, לחזור במשך 40 מחזורים.
  8. אסוף ערכי CT עבור כל גן בכל דגימה. שפע mRNA יחסי מחושב על ידי חיסור ערך CT של גן היעד מערך CT של גן משק בית. ביטוי גנים יחסי מנותח על ידי שיטת 2-ΔΔCT.

10. הקלטת מהדק תיקון תא שלם

  1. נתק iPSC-CMs לתאים בודדים באמצעות פתרון דיסוציאציה CM כפי שתואר בעבר.
  2. תאי זרעים בצפיפות נמוכה על כיסויים מצופים מטריצת מטריצת מרתף. תרבות אותם במשך 3-4 ימים במדיה 4.
  3. משוך פיפטות (התנגדות 0.9-1.5 MΩ) מניני זכוכית בורוסיליקט באמצעות משיכת מיקרו-ectrode אופקית.
  4. תאי דגירה בתמיסה של טיירוד (pH = 7.35).
  5. מילוי פיפטות עם פתרון אלקטרודה (pH = 7.3) המורכב מהכימיקלים הבאים: 120 מ"מ חומצה אספרטית, 20 מ"מ KCl, 2 מ"מ MgCl2, 5 mM HEPES, 10 mM NaCl, 5 mM EGTA, 0.3 מ"מ Na-GTP, 14 mM phosphocreatine, 4 mM K-ATP ו 2mM קריאטין זרחן.
  6. מקם תאים במצב מהדק הנוכחי באמצעות סף דיאסטולי 1.5-2 פעימה נוכחית 5 ms ב 1 הרץ.
  7. הקלט פוטנציאל לפעולה (APs) באמצעות מגבר microelectrode ולוח רכישה מונחה תוכנה.

תוצאות

תכנות מחדש של IPSC אנושי ממחשבים אישיים
לאחר טרום-תרבות עם מדיית דם מלאה במשך 7 ימים, מחשבים אישיים הופכים גדולים עם גרעינים גלויים וציטופלסמה (איור 1B), המציין שהם מוכנים להדבקת וירוסים. לאחר טרנספקט עם גורמי תכנות מחדש של וירוס סנדאי, מחשבי PBMCs יעב...

Discussion

במהלך תכנות מחדש של IPSC, זה קריטי לתרבות PBMCs במשך שבוע אחד עד שהם מוגדלים עם גרעינים ברורים ציטופלסמה. מאחר שמחשבי PBMCs אינם מתרבים, מספר תא מתאים עבור התמרה ויראלית חשוב לתכנות מחדש מוצלח של iPSC. מספר התא של מחשבים אישיים, ריבוי של זיהום (MOI) ו titer של וירוס צריך להיחשב ולהתאים כדי להגיע לתוצאות הת...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי האגודה האמריקאית ללב (AHA) קריירה פיתוח פרס 18CDA34110293 (M-T.Z.), מיזמים נוספים AVIF ו- SVRF פרסים (M-T.Z.), המכונים הלאומיים לבריאות (NIH / NHLBI) מענקים 1R01HL124245, 1R01HL132520 ו R01HL096962 (I.D.). ד"ר מינג-טאו זאו נתמך גם על ידי קרנות סטארט-אפ ממכון המחקר אביגיל וקסנר בבית החולים הלאומי לילדים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ABI 7300 Fast Real-Time PCR SystemThermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Microelectrode AmplifierMolecular DevicesMicroelectrode Amplifier
B27 supplementThermo Fisher Scientific17504044
B27 supplement minus insulinThermo Fisher ScientificA1895601
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization KitBD Biosciences554714Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer
BD Vacutainer CPT tubeBD Biosciences362753Blood cell separation tube
CHIR99021Selleck ChemicalsS2924
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming KitThermo Fisher ScientificA16517Sendai virus reprogramming kit
Digidata 1200BAxon InstrumentsAcquisition board
Direct-zol RNA Miniprep kitZymo ResearchR2050RNA extraction kit
DMEM/F12Thermo Fisher Scientific11330057
Essential 8 mediumThermo Fisher ScientificA1517001E8 media for iPSC culture
GlutaMAX supplementThermo Fisher Scientific35050061L-glutamine alternative
Growth factor reduced MatrigelCorning356231Basement membrane matrix
iScript cDNA Snythesis KitBio-Rad1708891cDNA synthesis
IWR-1-endoSelleck ChemicalsS7086
KnockOut Serum Replacement (KSR)Thermo Fisher Scientific10828028
pCLAMP 7.0Molecular DevicesElectrophysiology data acquisition & analysis software
Recombinant human EPOThermo Fisher ScientificPHC9631
Recombinant human FLT3Thermo Fisher ScientificPHC9414
Recombinant human IL3Peprotech200-03
Recombinant human IL6Thermo Fisher ScientificPHC0065
Recombinant human SCFPeprotech300-07
RPMI 1640 mediumThermo Fisher Scientific11875093
RPMI 1640 medium, no glucoseThermo Fisher Scientific11879020
SlowFade Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificS36936Mounting media
StemPro-34 SFMThermo Fisher Scientific10639011PBMC culture media
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444964qPCR master mix
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol redThermo Fisher ScientificA1217703CM dissociation solution
UltraPure 0.5 M EDTAThermo Fisher Scientific15575020iPSC dissociation solution
Y-27632 2HClSelleck ChemicalsS1049

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  3. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
  4. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  5. Hinson, J. T., et al. Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy. Science. 349 (6251), 982-986 (2015).
  6. Deacon, D. C., et al. Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy. Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).
  7. Gifford, C. A., et al. Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier. Science. 364 (6443), 865-870 (2019).
  8. Lo Sardo, V., et al. Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing. Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).
  9. Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
  10. Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now. Stem Cells. 38, 822-833 (2020).
  11. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  12. Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
  13. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  14. Zhao, M. T., et al. Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).
  15. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  16. Lian, X., et al. Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation. Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).
  17. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  18. Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
  19. Liang, W., et al. Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).
  20. Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
  21. Ren, J., et al. Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes. Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).
  22. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).
  23. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).
  24. Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).
  25. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  26. Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism. Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).
  27. Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. Determinants of cardiac growth and size. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150 (2020).
  28. Campa, V. M., et al. Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).
  29. Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).
  30. Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

168PBMCsIPSCsIPSC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved