Генерация и расширение кардиомиоцитов человека из мононуклеарных клеток периферической крови пациента

Резюме

Здесь мы представляем протокол для надежной генерации и расширения кардиомиоцитов человека из мононуклеарных клеток периферической крови пациента.

Аннотация

Получение специфических для пациента кардиомиоцитов из одного забора крови привлекло огромный интерес к прецизионной медицине сердечно-сосудистых заболеваний. Сердечная дифференцировка из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) модулируется определенными сигнальными путями, которые необходимы для эмбрионального развития сердца. Разработаны многочисленные методы сердечной дифференцировки на 2-D и 3-D платформах с различной эффективностью и выходом кардиомиоцитов. Это озадачило исследователей за пределами поля, поскольку разнообразие этих методов может быть трудно проследить. Здесь мы представляем комплексный протокол, который разрабатывает надежную генерацию и расширение специфических для пациента кардиомиоцитов из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs). Сначала мы опишем высокоэффективный протокол перепрограммирования iPSC из образца крови пациента с использованием неинтегрированных векторов вируса Сендай. Затем мы подробно описываем метод дифференцировки монослоя с небольшими молекулами, который может надежно производить бьющиеся кардиомиоциты из большинства линий iPSC человека. Кроме того, масштабируемый протокол расширения кардиомиоцитов вводится с использованием небольшой молекулы (CHIR99021), которая может быстро расширять кардиомиоциты, полученные от пациента, для промышленного и клинического применения. В конце изображены подробные протоколы молекулярной идентификации и электрофизиологической характеристики этих iPSC-CM. Мы ожидаем, что этот протокол будет прагматичным для новичков с ограниченными знаниями в области сердечно-сосудистого развития и биологии стволовых клеток.

Введение

Открытие индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток произвело революцию в современной сердечно-сосудистой^{медицине1,2.} Человеческие ИПСК способны самообновляться и генерировать все типы клеток в сердце, включая кардиомиоциты, эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки и сердечные фибробласты. Кардиомиоциты пациента, полученные из iPSC (iPSC-CMs), могут служить неопределенными ресурсами для моделирования генетически наследуемых сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) и тестирования сердечной безопасности для новых лекарств^3. В частности, пациенты iPSC-CMs хорошо подготовлены....

протокол

Экспериментальные протоколы и информированное согласие для людей были одобрены Институциональным наблюдательным советом (IRB) в Национальной детской больнице.

1. Приготовление сред клеточных культур, растворов и реагентов

1. Подготовка носителя PBMC
   1. Смешайте 20 мл базальной питательной среды PBMC (1x) и 0,52 мл добавки. Добавьте по 20 мкл SCF и FLT3 (концентрация запаса: 100 мкг/мл), по 4 мкл IL3, IL6 и EPO (концентрация запаса: 100 мкг/мл) и 200 мкл L-глутаминовой альтернативы (100x). Тщательно перемешайте. Фильтруйте в стерильной вытяжке с помощью фильтрующего блока 0,22 мкм. Назовите это как Complete Blood Media.

Результаты

Перепрограммирование iPSC человека из PBMCs
После предварительной культивации с полной средой крови в течение 7 дней НБМК становятся большими с видимыми ядрами и цитоплазмой(рисунок 1B),что указывает на то, что они готовы к трансфекции вируса. Пос.......

Обсуждение

Во время перепрограммирования iPSC крайне важно культивировать PBMC в течение 1 недели, пока они не будут увеличены прозрачными ядрами и цитоплазмой. Поскольку PBMC не размножаются, соответствующий номер клеток для вирусной трансдукции важен для успешного перепрограммирования iPSC. Количест?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABI 7300 Fast Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier	Molecular Devices		Microelectrode Amplifier
B27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044
B27 supplement minus insulin	Thermo Fisher Scientific	A1895601
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit	BD Biosciences	554714	Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer
BD Vacutainer CPT tube	BD Biosciences	362753	Blood cell separation tube
CHIR99021	Selleck Chemicals	S2924
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit	Thermo Fisher Scientific	A16517	Sendai virus reprogramming kit
Digidata 1200B	Axon Instruments		Acquisition board
Direct-zol RNA Miniprep kit	Zymo Research	R2050	RNA extraction kit
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11330057
Essential 8 medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	E8 media for iPSC culture
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	L-glutamine alternative
Growth factor reduced Matrigel	Corning	356231	Basement membrane matrix
iScript cDNA Snythesis Kit	Bio-Rad	1708891	cDNA synthesis
IWR-1-endo	Selleck Chemicals	S7086
KnockOut Serum Replacement (KSR)	Thermo Fisher Scientific	10828028
pCLAMP 7.0	Molecular Devices		Electrophysiology data acquisition & analysis software
Recombinant human EPO	Thermo Fisher Scientific	PHC9631
Recombinant human FLT3	Thermo Fisher Scientific	PHC9414
Recombinant human IL3	Peprotech	200-03
Recombinant human IL6	Thermo Fisher Scientific	PHC0065
Recombinant human SCF	Peprotech	300-07
RPMI 1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
RPMI 1640 medium, no glucose	Thermo Fisher Scientific	11879020
SlowFade Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	S36936	Mounting media
StemPro-34 SFM	Thermo Fisher Scientific	10639011	PBMC culture media
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444964	qPCR master mix
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	A1217703	CM dissociation solution
UltraPure 0.5 M EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	iPSC dissociation solution
Y-27632 2HCl	Selleck Chemicals	S1049