患者外周血单核细胞中人心肌细胞的生成和扩增

摘要

在这里，我们提出了一种方案，可以从患者外周血单核细胞中稳健地产生和扩增人心肌细胞。

摘要

通过单次抽血产生患者特异性心肌细胞，引起了人们对心血管疾病精准医学的极大兴趣。与人类诱导多能干细胞（iPSCs）的心脏分化由对胚胎心脏发育至关重要的明确信号通路调节。已经开发了2-D和3-D平台上的许多心脏分化方法，具有不同的效率和心肌细胞产量。这让该领域以外的调查人员感到困惑，因为这些方法的多样性可能难以遵循。在这里，我们提出了一个全面的方案，详细阐述了外周血单核细胞（PBMC）患者特异性心肌细胞的稳健生成和扩增。我们首先描述了使用非整合仙台病毒载体从患者血液样本中获取的高效iPSC重编程方案。然后，我们详细介绍了一种小分子介导的单层分化方法，该方法可以从大多数人类iPSC系中稳健地产生跳动的心肌细胞。此外，还引入了一种使用小分子（CHIR99021）的可扩展心肌细胞扩增方案，该方案可以快速扩增患者来源的心肌细胞，用于工业和临床级应用。最后，描述了这些iPSC-CM的分子鉴定和电生理学表征的详细方案。我们希望该协议对于心血管发育和干细胞生物学知识有限的初学者来说是务实的。

引言

人类诱导多能干细胞的发现彻底改变了现代心血管医学^1，2。人类iPSCs能够自我更新和产生心脏中的所有细胞类型，包括心肌细胞，内皮细胞，平滑肌细胞和心脏成纤维细胞。患者iPSC衍生的心肌细胞（iPSC-CM）可以作为无限期的资源，用于模拟遗传性心血管疾病（CVD）和测试新药的心脏安全性^3。特别是，患者 iPSC-CM 已准备好研究源自心肌细胞缺陷的 CVD 的遗传和分子病因，例如长 QT 综合征⁴和扩张型心肌病 （DCM）^5。结合CRISPR / Cas9介导的基因组编辑，患者iPSC-CM开辟了一条前所未有的途径来了解CVD的复杂遗传基础^，包括先天性心脏缺陷（CHD）6，7，8。人类iPSC-CM还显示出在心脏病发作期间作为自体细胞来源补充受损心肌的潜力⁹。近年来，产生具有明确亚型（心房，心室和淋巴结）的高质量人iPSC-CM对于心脏再生和药物检测至关重要¹⁰。

在过去十年中，心脏与人类iPSCs的鉴别已经取得了长足的进步。分化方法已经从基于胚体（EB）的自发分化到化学定义和定向的心脏分化^11。对胚胎心脏发育至关重要的关键信号分子，如 Wnt ， BMP ，节点和 FGF 纵以增强心肌细胞与人类 iPSCs 的分化^{10 ， 12 。}重大进展包括Wnt信号传导的顺序调节（激活然后抑制），用于从人iPSCs中稳健地产生心肌细胞^13，14。化学定义的心脏分化配方已被探索，以促进大规模生产跳动的心肌细胞^15，16，这些细胞有可能升级到工业和临床水平的生产。此外，早期人类iPSC-CM的稳健扩增是通过使用小化学物质（CHIR99021）暴露于构成性Wnt活化来实现^的17。最近，亚型特异性心肌细胞是通过在人类iPSCs的心肌细胞谱系承诺期间在特定分化窗口中操纵视黄酸（RA）和Wnt信号通路而产生的18，19，20，21，22。

在该协议中，我们详细介绍了来自患者外周血单核细胞的人CM的稳健生成和增殖的工作程序。我们提出了1）将人类PBMC重新编程为iPSCs的协议，2）从人iPSCs中稳健地产生跳动的心肌细胞，3）早期iPSC-CM的快速扩增，4）人类iPSC-CM的分子表征，以及5）通过膜片钳在单细胞水平上对人类iPSC-CM进行电生理学测量。该协议涵盖了将患者血细胞转化为跳动心肌细胞的详细实验程序。

研究方案

人类受试者的实验方案和知情同意由全国儿童医院的机构审查委员会（IRB）批准。

1. 细胞培养基、溶液和试剂的制备

1. 准备 PBMC 介质
   1. 混合20 mL基础PBMC培养基（1x）和0.52 mL补充剂。分别加入20μL SCF和FLT3（储备浓度:100μg/ mL），分别加入4μLIL3，IL6和EPO（储备浓度:100μg/ mL）和200μLLLLLLLLLLLL谷氨酰胺替代品（100x）。将它们彻底混合。使用0.22μm过滤装置在无菌罩中过滤。将其命名为全血培养基。
   2. 混合20 mL基础PBMC培养基（1x）和0.52 mL补充剂。加入200μLLL谷氨酰胺替代品（100x）。将它们彻底混合。使用 0.22 μm 过滤装置进行过滤。将其命名为补充血液培养基。
2. 准备完整的 E8 介质
   1. 混合500 mL E8基础培养基和10 mL E8补充剂（在4°C解冻过夜）以制成完整的E8培养基。使用前平衡至室温（RT）。
3. 准备 iPSC 传代介质
   1. 将40μLY-27632岩石抑制剂（1:5，000稀释，储备浓度:10mM）加入200mL完整的E8培养基中。彻底混合。使用前平衡至室温。
4. 准备心肌细胞分化培养基
   1. 培养基 I:将 500 mL RPMI1640 与 10 mL B27 减去胰岛素补充剂 （50x） 混合。
   2. 培养基II:将适当体积的CHIR99021（GSK3抑制剂）储备液加入培养基I（CHIR99021终浓度为6μM）。彻底混合。
   3. 培养基III:将适当体积的IWR-1（Wnt抑制剂）储备液加入培养基I（IWR-1终浓度为5μM）。彻底混合。
   4. 培养基 IV:将 500 mL RPMI1640 与 10 mL B27 补充剂 （50x） 混合。彻底混合。
   5. 培养基 V:将 500 mL RPMI1640（无葡萄糖）与 10 mL B27 补充剂 （50x） 混合。彻底混合。
   6. 培养基VI:向培养基IV中加入适当体积的CHIR99021储备液（CHIR99021终浓度为2μM）。彻底混合。
5. 准备 iPSC-CM 传导介质
   1. 将 10 mL 去核血清替代物 （KSR） 加入 90 mL 培养基 IV （KSR 终浓度:10%）。混合均匀。
6. 准备 iPSC-CM 冷冻培养基
   1. 将 1 mL DMSO 加入 9 mL KSR（终浓度:10% DMSO/90% KSR）中，充分混合。
7. 制备基底膜基质介质包衣板
   1. 在4°C下解冻基底膜基质培养基过夜，并在1.5mL管中等分试样。将1 mL该培养基加入250 mL DMEM / F12培养基（1:250稀释）中并充分混合。在6孔板中每孔施用2mL稀释溶液，并在使用前在37°C下在5%CO₂ 中孵育30分钟。

2. PBMC的iPSC重编程

1. 将 PBMC 与血液样本分开。
   1. 收集患者血液样本（~5 mL）并转移到血细胞分离管中（ 材料表）。倒置 10 倍混合。
   2. 在室温下以1，500×g离心30分钟。
   3. 小心地取出试管，喷洒70%乙醇。在生物安全罩下，在不干扰单核细胞（黄铁层）的情况下取下盖子。PBMC将位于等离子体层正下方的白色层中（图1A）。使用1000μL移液器收集整个buffy层，并转移到15 mL锥形管中。
   4. 使用自动细胞计数器计算细胞数量。在室温下以300×g旋转管子25分钟。
   5. 丢弃上清液。用10毫升DPBS（Ca^{2 +}/ Mg^{2 +} 游离）洗涤。
   6. 在室温下以300×g旋转管子15分钟。
   7. 除去上清液。将细胞沉淀重悬于1mL冷冻培养基（KSR加10%DMSO）中。调整细胞密度，使每瓶1×10⁶ 个细胞。
   8. 将PBMC冷冻管置于细胞冷冻容器中，并在-80°C下过夜。转移到液氮罐中，第二天长期储存。
2. iPSC 重编程。
   1. 在 15 mL 锥形管中加入 3 mL 补充血液培养基。在37°C水浴中解冻PBMC并将其转移到锥形管中。在室温下以300 x g 旋转7分钟。
   2. 丢弃上清液。用全血培养基重悬PMC。将它们接种到24孔组织培养板（无基底膜基质）的两个孔中。
   3. 在37°C下孵育5%CO₂ 过夜。第二天轻轻取出一半的旧培养基（0.5毫升），并加入0.5毫升新鲜的全血培养基。
   4. 每隔一天更换一次媒体，刷新一半的旧媒体。
   5. 一周后，用1 mL补充血液培养基积极洗涤孔，并将细胞转移到15 mL离心管中。
   6. 计算单元格编号。取2×10⁵个细胞，以300×g离心7分钟。
   7. 丢弃上清液。用300μL全血培养基重悬细胞。根据制造商的说明，通过添加适当体积的仙台病毒重编程载体来进行转染。将它们转移到24孔板的一个孔中（无基底膜基质）。在37°C下孵育5%CO₂ 过夜。
   8. 第二天以300 x g 旋转7分钟。取出上清液并重悬于2 mL全血培养基中。转移到预涂有基底膜基质的6孔板的一个孔中。这是第1天（D1）。
   9. 第二天不要碰盘子。
   10. 在 D3 上，取出 1 mL 旧培养基。加入 1 mL 补充血液培养基。
   11. 在 D5 上重复步骤 2.2.10。
   12. 在 D7 上，取出 1 mL 旧介质。加入 1 mL 完整的 E8 培养基。
   13. 在 D8 上，重复步骤 2.2.12。
   14. 在 D9 上，取出旧介质。加入 2 mL 完整的 E8 培养基。完全重编程的细胞有望附着并开始形成菌落。
   15. 每天使用 2 mL 完整 E8 培养基进行刷新。
   16. 仙台病毒转导后约2周，将出现大型iPSC菌落并准备采摘。
   17. 在罩中的立体显微镜下切割iPSC菌落，并将单个菌落转移到预装有0.5mL iPSC传代培养基的基底膜基质包覆的24孔板中。
   18. 每天用0.5 mL完整的E8培养基刷新，直到iPSC菌落长得足够大，可以传导到新的基底膜基质包被的6孔板中。

3. 人体iPSC维护和传代

1. 当人类iPSC达到90%以上的汇合度时，请移除旧介质。用 3 mL DPBS 冲洗一次。
2. 在DPBS溶液中加入1 mL 0.5 mM EDTA。在37°C下在5%CO₂ 中孵育5-8分钟。
3. 通过抽吸去除EDTA。加入 1 mL iPSC 传代培养基。手动移出 iPSC。
4. 取600-900μL单细胞悬浮液，并将其重新接种到基底膜基质包被的6孔板上（稀释:1:6至1:10）。在37°C下孵育5%CO₂ 过夜。
5. 每天使用 2 mL 完整 E8 培养基进行刷新。iPSC 培养物通常在 3-4 天后达到汇合。

4. 化学定义的心肌细胞分化

1. 在完全E8培养基中培养人iPSCs，直到95%汇合（3-4天）。
2. 卸下旧介质。向6孔板的每个孔中加入2mLCM分化培养基II（RPMI1640中的6μM CHIR加上B27减去胰岛素补充剂）。这是 D0。不要触摸 D1。
3. 在D2上，用2 mL CM分化培养基I（RPMI1640加B27减去胰岛素补充剂）代替。
4. 在D3上，用2mLCM分化培养基III代替（RPMI1640中的5μM IWR-1加上B27减去胰岛素补充剂）。不要触摸 D4。
5. 在 D5 上，用 2 mL CM 鉴别培养基 I 替换。
6. 在 D7 上，用 2 mL CM 分化培养基 IV（RPMI1640 加 B27 补充剂）代替。此后，每隔一天刷新一次介质。
7. 在D11上观察到收缩细胞时，用2mLCM分化培养基V（无葡萄糖）代替。
8. 在 D13 上，用 2 mL CM 鉴别培养基 V 替换。
9. 在 D15 上，用 2 mL CM 分化培养基 IV 代替。
10. 在 D17-D21 上，每隔一天用 2 mL CM 分化培养基 IV 替换。

5. 通过人类 iPSC-CM

1. 取出旧培养基并用3 mL DPBS冲洗细胞一次。
2. 将1mL的CM解离溶液（见 材料表）应用于6孔板的每个孔。在37°C下在5%CO₂ 中孵育5-8分钟。
3. 通过剧烈移液将iPSC-CM机械解离成单细胞。
4. 将细胞转移到15 mL锥形管中。加入2 mL CM传代培养基（RMPI1640中的10%KSR加B27补充剂）以中和CM解离溶液。
5. 在室温下以300 x g 旋转5分钟。
6. 丢弃上清液。重悬具有所需体积CM传导培养基的细胞。将它们播种到基底膜基质涂层的板/皿中。人类iPSC-CM在传代后1-3天恢复跳动。

6. 人类iPSC-CM的扩展

1. 用3 mL DPBS冲洗D10-12打孔iPSC-CM，用于6孔板的每个孔一次。加入1mLCM解离溶液（步骤5.2）。在37°C下在5%CO₂ 中孵育7-10分钟。
2. 通过剧烈移液将iPSC-CM机械解离成单细胞。
3. 将细胞转移到15 mL锥形管中。加入2 mLCM传导培养基以中和CM解离溶液。
4. 在室温下以300 x g 旋转5分钟。
5. 丢弃上清液。用适当体积的CM传导培养基重悬细胞。上下移液以产生单细胞悬浮液。将100万个iPSC-CM接种到基底膜基质包被的10厘米培养皿中。
6. 第二天取出旧介质。加入10mL心肌细胞增殖培养基（培养基VI:2μM CHIR99021）。每隔一天更换一次媒体。
7. 当iPSC-CM在培养7-9天后汇合时，重复传代步骤以进一步扩增iPSC-CM。

7. 免疫荧光

1. 在免疫荧光染色之前，将iPSC-CM接种到基底膜基质包被的盖玻片上，盖玻片置于24孔板中（接种密度:0.5-1×10⁶ 个细胞/ mL）。在培养物中维持 iPSC-CM 至少 4 天。
2. 使用1 mL DPBS洗涤细胞一次。
3. 加入0.5毫升4%多聚甲醛（PFA），并在室温下孵育15分钟。
4. 使用1 mL DPBS洗涤细胞。重复一次。
5. 加入0.5毫升0.1%Triton X-100，在室温下孵育20分钟。
6. 用 1 mL DPBS 洗涤两次。
7. 在DPBS（封闭溶液）中加入0.5毫升0.2%BSA。在室温下孵育1小时。
8. 加入用封闭溶液稀释的200μL一抗（稀释:1:400-1:1000）。在4°C孵育过夜。
9. 使用0.5mL封闭溶液洗涤细胞3分钟，摇动。重复两次。
10. 加入200μL稀释在封闭溶液中的二抗。在室温下孵育1小时。
11. 用0.5 mL DPBS冲洗细胞三次，每次摇动3分钟。
12. 用DAPI（1:2000稀释）复染细胞核，并在室温下孵育5分钟。
13. 用0.5 mL DPBS冲洗细胞三次。
14. 使用5μl安装培养基将盖玻片上的细胞安装到显微镜载玻片上。储存在4°C并避光。

8. 流式细胞术样品制备

1. 用 3 mL DPBS 清洗人 iPSC-CM 一次。
2. 加入1mL的CM解离溶液，并在37°C下在5%CO₂ 中孵育7-10分钟。
3. 使用1，000μL移液器移出细胞。通过过滤器盖将细胞悬浮液转移到圆形FACS管中。FACS管预先填充了1 mL iPSC-CM传代培养基（10%KSR）以中和酶活性。
4. 以300 x g 旋转5分钟。
5. 除去上清液而不干扰细胞沉淀。加入250μL固定/透化溶液（见材料表）。在4°C下孵育20分钟。
6. 加入 1 mL 烫发/洗涤缓冲液。短暂涡旋，以300×g旋转4分钟。
7. 丢弃上清液。在1x Perm/Wash缓冲液中加入100μL稀释的一抗（1:200-1:500）。短暂涡旋并在4°C下孵育过夜。
8. 通过加入1 mL烫发/洗涤缓冲液来洗涤细胞。短暂涡旋，以300×g旋转4分钟。
9. 丢弃上清液。加入100μL稀释的二抗（1:500-1:1，000）。短暂涡旋，在室温下孵育1小时。如果二抗与光敏荧光偶联，请避光。
10. 通过加入1 mL烫发/洗涤缓冲液来洗涤细胞。短暂涡旋，以300g旋转4分钟。
11. 丢弃上清液。用400μLFACS染色缓冲液（PBS / 4%FBS）重悬细胞。储存在4°C，直到装载到FACS仪器上。

9. 实时 qPCR

1. 去除人类iPSC-CM培养物中的旧培养基。加入500-700μL裂解缓冲液以裂解细胞。在室温下孵育3分钟，Scape细胞裂解物并转移到1.5ml无RNase管中。立即进行总RNA提取或储存在-80°C。
2. 按照制造商的说明，使用RNA提取试剂盒分离总RNA。
3. 测量RNA浓度并通过分光光度计评估总RNA的质量。
4. 使用cDNA合成试剂盒进行逆转录反应。RT反应的总体积为20μL，包括4μL反应混合物（5x），1μL逆转录酶，1μg总RNA和不含RNase的水。
5. 使用以下方案在热循环仪中孵育完整的RT反应混合物:25°C5分钟;46 °C 20分钟;95 °C 1分钟;保持在4°C。
6. 使用不含核酸酶的水以1:10稀释cDNA。通过混合1μL cDNA模板，1μL引物/探针，10μLqPCR预混液和8μL无核酸酶水来设置实时qPCR反应。
7. 在实时荧光定量 PCR 系统中运行。循环方案为50°C 2分钟（保持），95°C10分钟（保持），95°C15秒，60°C1分钟，重复40次循环。
8. 收集每个样品中每个基因的C_T 值。相对mRNA丰度是通过从管家基因的C_T 值中减去靶基因的C_T 值来计算的。通过^2-ΔΔCT 方法分析相对基因表达。

10. 全细胞膜片钳记录

1. 如前所述，使用CM解离溶液将iPSC-CM解离成单个细胞。
2. 在基底膜基质包被的盖玻片上以低密度播种细胞。在培养基IV中培养3-4天。
3. 使用水平微电极拉拔器从硼硅酸盐玻璃毛细管中拉出移液器（电阻0.9-1.5 MΩ）。
4. 在Tyrode的溶液中孵育细胞（pH = 7.35）。
5. 用由以下化学品组成的电极溶液（pH = 7.3）填充移液器:120 mM天冬氨酸，20 mM KCl，2 mM MgCl_2，5mM HEPES，10 mM NaCl，5 mM EGTA，0.3 mM Na-GTP，14 mM磷酸肌酸，4 mM K-ATP和2mM肌酸磷酸激酶。
6. 使用1.5-2舒张阈值5 ms电流脉冲（1 Hz）将电池置于电流钳位模式。
7. 使用微电极放大器和软件驱动的采集板记录动作电位（AP）。

结果

从 PBMC 进行人类 iPSC 重编程
用全血培养基预培养7天后，PBMC变大，可见细胞核和细胞质（图1B），表明它们已准备好进行病毒转染。在用仙台病毒重编程因子转染后，PBMC将再经历一周的表观遗传重编程过程。通常，我们从1 x 10 5 PBMC的转染中获得^30-50 个iPSC菌落，重编程效率为0.03%-0.05%。完全重编程的细胞在被引入到完整的E8培养...

讨论

在 iPSC 重编程期间，培养 PBMC 持续 1 周至关重要，直到它们被透明细胞核和细胞质扩增。由于PBMC不会增殖，因此用于病毒转导的适当细胞数对于成功的iPSC重编程非常重要。应考虑并调整PBMC的细胞数，感染的多重性（MOI）和病毒的滴度，以达到最佳的转导结果。对于心脏分化，初始播种密度对于iPSCs在施用CHIR99021当天达到90%以上的汇合至关重要。一方面，如果iPSCs在心脏分化时汇合较少，CHIR99021将...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABI 7300 Fast Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier	Molecular Devices		Microelectrode Amplifier
B27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044
B27 supplement minus insulin	Thermo Fisher Scientific	A1895601
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit	BD Biosciences	554714	Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer
BD Vacutainer CPT tube	BD Biosciences	362753	Blood cell separation tube
CHIR99021	Selleck Chemicals	S2924
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit	Thermo Fisher Scientific	A16517	Sendai virus reprogramming kit
Digidata 1200B	Axon Instruments		Acquisition board
Direct-zol RNA Miniprep kit	Zymo Research	R2050	RNA extraction kit
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11330057
Essential 8 medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	E8 media for iPSC culture
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	L-glutamine alternative
Growth factor reduced Matrigel	Corning	356231	Basement membrane matrix
iScript cDNA Snythesis Kit	Bio-Rad	1708891	cDNA synthesis
IWR-1-endo	Selleck Chemicals	S7086
KnockOut Serum Replacement (KSR)	Thermo Fisher Scientific	10828028
pCLAMP 7.0	Molecular Devices		Electrophysiology data acquisition & analysis software
Recombinant human EPO	Thermo Fisher Scientific	PHC9631
Recombinant human FLT3	Thermo Fisher Scientific	PHC9414
Recombinant human IL3	Peprotech	200-03
Recombinant human IL6	Thermo Fisher Scientific	PHC0065
Recombinant human SCF	Peprotech	300-07
RPMI 1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
RPMI 1640 medium, no glucose	Thermo Fisher Scientific	11879020
SlowFade Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	S36936	Mounting media
StemPro-34 SFM	Thermo Fisher Scientific	10639011	PBMC culture media
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444964	qPCR master mix
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	A1217703	CM dissociation solution
UltraPure 0.5 M EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	iPSC dissociation solution
Y-27632 2HCl	Selleck Chemicals	S1049