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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per generare ed espandere in modo robusto i cardiomiociti umani dalle cellule mononucleate del sangue periferico del paziente.

Abstract

La generazione di cardiomiociti specifici del paziente da un singolo prelievo di sangue ha attirato un enorme interesse per la medicina di precisione sulle malattie cardiovascolari. La differenziazione cardiaca dalle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC) è modulata da percorsi di segnalazione definiti che sono essenziali per lo sviluppo del cuore embrionale. Numerosi metodi di differenziazione cardiaca su piattaforme 2D e 3D sono stati sviluppati con varie efficienze e resa cardiomiocitaria. Ciò ha sconcertato gli investigatori al di fuori del campo in quanto la varietà di questi metodi può essere difficile da seguire. Qui presentiamo un protocollo completo che elabora una robusta generazione ed espansione di cardiomiociti specifici del paziente da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). Per prima cosa descriviamo un protocollo di riprogrammazione iPSC ad alta efficienza dal campione di sangue di un paziente utilizzando vettori di virus Sendai non integrati. Quindi descriviamo in dettaglio un piccolo metodo di differenziazione monostrato mediato da molecole che può produrre in modo robusto cardiomiociti battenti dalla maggior parte delle linee iPSC umane. Inoltre, viene introdotto un protocollo di espansione dei cardiomiociti scalabile utilizzando una piccola molecola (CHIR99021) che potrebbe espandere rapidamente i cardiomiociti derivati dal paziente per applicazioni di livello industriale e clinico. Alla fine, vengono illustrati protocolli dettagliati per l'identificazione molecolare e la caratterizzazione elettrofisiologica di questi iPSC-CM. Ci aspettiamo che questo protocollo sia pragmatico per i principianti con conoscenze limitate sullo sviluppo cardiovascolare e sulla biologia delle cellule staminali.

Introduzione

La scoperta di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo ha rivoluzionato la moderna medicina cardiovascolare1,2. Le iPSC umane sono in grado di auto-rinnovarsi e generare tutti i tipi di cellule nel cuore, compresi cardiomiociti, cellule endoteliali, cellule muscolari lisce e fibroblasti cardiaci. I cardiomiociti derivati da iPSC del paziente (iPSC-CM) possono servire come risorse indefinite per modellare le malattie cardiovascolari geneticamente ereditabili (CVD) e testare la sicurezza cardiaca per i nuovi farmaci3. In particolare, i pazienti iPSC-CM sono ben pronti a studiare le eziologie genetiche e molecolari delle CVD derivate da difetti nei cardiomiociti, come la sindrome del QT lungo4 e la cardiomiopatia dilatativa (DCM)5. In combinazione con l'editing del genoma mediato da CRISPR / Cas9, i CM iPSC dei pazienti hanno aperto una strada senza precedenti per comprendere le complesse basi genetiche delle CVD, compresi i difetti cardiaci congeniti (CHD)6,7,8. Gli iPSC-CM umani hanno anche mostrato potenziali per servire come fonti cellulari autologhe per reintegrare il miocardio danneggiato durante un infarto9. Negli ultimi anni, è diventato fondamentale generare iPSC-CM umani di alta qualità con sottotipi definiti (atriale, ventricolare e nodale) per la rigenerazione cardiaca e test antidroga10.

La differenziazione cardiaca dalle iPSC umane è stata notevolmente avanzata negli ultimi dieci anni. I metodi di differenziazione sono passati dalla differenziazione spontanea basata sul corpo embrioide (EB) alla differenziazione cardiaca chimicamente definita e diretta11. Le molecole di segnalazione chiave essenziali per lo sviluppo del cuore embrionale, come Wnt, BMP, Nodal e FGF sono manipolate per migliorare la differenziazione dei cardiomiociti dalle iPSC umane10,12. Progressi significativi includono la modulazione sequenziale della segnalazione Wnt (attivazione seguita da inibizione) per una robusta generazione di cardiomiociti da iPSC umane13,14. Sono state esplorate ricette di differenziazione cardiaca chimicamente definite per facilitare la produzione su larga scala di cardiomiociti battenti15,16, che hanno il potenziale per essere aggiornati alla produzione a livello industriale e clinico. Inoltre, una robusta espansione delle iPSC-CM umane precoci si ottiene mediante l'esposizione all'attivazione costitutiva di Wnt utilizzando una piccola sostanza chimica (CHIR99021)17. Più recentemente, i cardiomiociti specifici del sottotipo sono generati attraverso la manipolazione delle vie di segnalazione dell'acido retinoico (RA) e Wnt in specifiche finestre di differenziazione durante l'impegno del lignaggio dei cardiomiociti dalle iPSC umane18,19,20,21,22.

In questo protocollo, descriviamo in dettaglio una procedura di lavoro per la generazione e la proliferazione robuste di CM umane provenienti da cellule mononucleate del sangue periferico del paziente. Presentiamo protocolli per 1) riprogrammazione di PBMC umani in iPSC, 2) robusta generazione di cardiomiociti battenti da iPSC umane, 3) rapida espansione dei primi iPSC-CM, 4) caratterizzazione molecolare di iPSC-CM umani e 5) misurazione elettrofisiologica di iPSC-CM umani a livello di singola cellula mediante patch clamp. Questo protocollo copre le procedure sperimentali dettagliate sulla conversione delle cellule del sangue del paziente in cardiomiociti pulsanti.

Protocollo

I protocolli sperimentali e il consenso informato per i soggetti umani sono stati approvati dall'Institutional Review Board (IRB) presso il Nationwide Children's Hospital.

1. Preparazione di terreni di coltura cellulare, soluzioni e reagenti

  1. Preparare i supporti PBMC
    1. Mescolare 20 mL di terreno di coltura PBMC basale (1x) e 0,52 mL di integratore. Aggiungere 20 μL di SCF e FLT3 ciascuno (concentrazione di stock: 100 μg/mL), 4 μL di IL3, IL6 ed EPO ciascuno (concentrazione di stock: 100 μg/mL) e 200 μL di alternativa L-glutammina (100x). Mescolarli accuratamente. Filtrare in una cappa sterile utilizzando un'unità filtrante da 0,22 μm. Denominatelo Complete Blood Media.
    2. Mescolare 20 mL di terreno di coltura PBMC basale (1x) e 0,52 mL del supplemento. Aggiungere 200 μL di alternativa L-glutammina (100x). Mescolarli accuratamente. Filtrare utilizzando un'unità filtrante da 0,22 μm. Chiamalo come Supplemento Blood Media.
  2. Preparare un supporto E8 completo
    1. Mescolare 500 mL di mezzi basali E8 e 10 mL di integratore E8 (scongelati durante la notte a 4 °C) per ottenere un mezzo E8 completo. Equilibrare a temperatura ambiente (RT) prima dell'uso.
  3. Preparare i supporti di passaging iPSC
    1. Aggiungere 40 μL di inibitore della roccia Y-27632 (diluizione 1:5.000, concentrazione di stock: 10 mM) a 200 mL di fluido E8 completo. Mescolare accuratamente. Equilibrate a RT prima dell'uso.
  4. Preparare i mezzi di differenziazione dei cardiomiociti
    1. Media I: Mescolare 500 mL di RPMI1640 con 10 mL di B27 meno integratore di insulina (50x).
    2. Media II: Aggiungere un volume appropriato di chir99021 (inibitore GSK3) a Media I (concentrazione finale CHIR99021 di 6 μM). Mescolare accuratamente.
    3. Media III: Aggiungere un volume appropriato di stock IWR-1 (inibitore Wnt) a Media I (concentrazione finale IWR-1 di 5 μM). Mescolare accuratamente.
    4. Media IV: Mescolare 500 mL di RPMI1640 con 10 mL di supplemento B27 (50x). Mescolare accuratamente.
    5. Media V: Miscelare 500 mL di RPMI1640 (senza glucosio) con 10 mL di integratore B27 (50x). Mescolare accuratamente.
    6. Media VI: Aggiungere un volume appropriato di stock CHIR99021 a Media IV (concentrazione finale CHIR99021 di 2 μM). Mescolare accuratamente.
  5. Preparare i supporti di passaging iPSC-CM
    1. Aggiungere 10 ml di Knockout Serum Replacement (KSR) a 90 mL di Media IV (concentrazione finale KSR: 10%). Mescolare bene.
  6. Preparare i supporti di congelamento iPSC-CM
    1. Aggiungere 1 mL di DMSO a 9 mL di KSR (concentrazioni finali: 10% DMSO/90% KSR) e mescolare bene.
  7. Preparare piastre a matrice di membrana basale a rivestimento medio
    1. Mezzo a matrice di membrana basale di disgelo a 4 °C durante la notte e aliquota in tubi da 1,5 mL. Aggiungere 1 mL di questo mezzo a 250 mL di supporto DMEM/F12 (diluizione 1:250) e mescolarli accuratamente. Applicare 2 mL della soluzione diluita per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti e incubare in 5% CO2 a 37 °C per 30 minuti prima dell'uso.

2. Riprogrammazione iPSC dei PBMC

  1. Separare i PBMC dai campioni di sangue.
    1. Raccogliere campioni di sangue del paziente (~ 5 ml) e trasferirli in tubi di separazione delle cellule del sangue (vedere Tabella dei materiali). Mescolare invertendo 10x.
    2. Centrifugare a 1.500 x g per 30 minuti a temperatura ambiente.
    3. Estrarre i tubi con cura e spruzzare con etanolo al 70%. Sotto un cappuccio di biosicurezza, rimuovere i tappi senza disturbare le cellule mononucleate (strato di buffy). I PBMC saranno in uno strato biancastro appena sotto lo strato di plasma (Figura 1A). Raccogliere l'intero strato di buffy utilizzando una pipetta da 1000 μL e trasferirlo in un tubo conico da 15 mL.
    4. Contare il numero di cella utilizzando un contatore di celle automatizzato. Ruotare il tubo a 300 x g per 25 minuti a RT.
    5. Scartare il surnatante. Lavare con 10 ml di DPBS (Ca2+/Mg2+ gratis).
    6. Ruotare il tubo a 300 x g per 15 minuti a RT.
    7. Rimuovere il surnatante. Sostituire i pellet di cellule in 1 mL del mezzo di congelamento (KSR più 10% DMSO). Regolare la densità cellulare per fare 1 x 106 celle per flaconcino.
    8. Posizionare i crioviali PBMC in un contenitore di congelamento cellulare e conservare a -80 °C durante la notte. Trasferire in un serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine il giorno successivo.
  2. Riprogrammazione iPSC.
    1. Aggiungere 3 mL di Supplement Blood Media in un tubo conico da 15 mL. Scongelare i PBMC a bagnomaria a 37 °C e trasferirli in un tubo conico. Girare a 300 x g per 7 minuti a RT.
    2. Scartare il surnatante. Sospendere i PBMC con fluidi sanguigni completi. Seminali in due pozzetti di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzi (nessuna matrice di membrana basale).
    3. Incubare in 5% CO2 a 37 °C durante la notte. Il giorno successivo rimuovere delicatamente metà del vecchio supporto (0,5 ml) e aggiungere 0,5 ml di Terriccio Completo fresco.
    4. Cambia media a giorni alterni rinfrescando metà dei vecchi media.
    5. Dopo una settimana, lavare aggressivamente il pozzo con 1 mL di Supplement Blood Media e trasferire le cellule in un tubo centrifugo da 15 ml.
    6. Contare il numero di cella. Prendere 2 x 105 celle e centrifugare a 300 x g per 7 min.
    7. Scartare il surnatante. Cellule risospese con 300 μL di Complete Blood Media. Eseguire la trasfezione aggiungendo il volume appropriato di vettori di riprogrammazione del virus Sendai secondo le istruzioni del produttore. Trasferirli in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti (nessuna matrice di membrana basale). Incubare in 5% CO2 a 37 °C durante la notte.
    8. Il giorno successivo gira a 300 x g per 7 min. Rimuovere il surnatante e risospendere in 2 ml di Complete Blood Media. Trasferire in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti pre-rivestita con matrice di membrana basale. Questo è il giorno 1 (D1).
    9. Non toccare il piatto il giorno successivo.
    10. Su D3, rimuovere 1 mL del vecchio supporto. Aggiungere 1 ml di supplemento blood media.
    11. Ripetere il passaggio 2.2.10 su D5.
    12. Su D7, rimuovere 1 mL del vecchio supporto. Aggiungere 1 mL di supporto E8 completo.
    13. Su D8, ripetere il passaggio 2.2.12.
    14. Su D9, rimuovere il vecchio supporto. Aggiungere 2 ml di supporti E8 completi. Ci si aspetta che le cellule completamente riprogrammate si attacchino e inizino a formare colonie.
    15. Aggiorna con 2 ml di supporti E8 completi ogni giorno.
    16. Circa 2 settimane dopo la trasduzione del virus Sendai, appariranno grandi colonie di iPSC e saranno pronte per la raccolta.
    17. Tagliare le colonie di iPSC sotto uno stereomicroscopio nel cofano e trasferire le singole colonie in una piastra a 24 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale precaricata con 0,5 mL di mezzi di passaggio iPSC.
    18. Aggiorna con 0,5 mL di supporti E8 completi ogni giorno fino a quando le colonie di iPSC diventano abbastanza grandi da passare in una nuova piastra a 6 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale.

3. Manutenzione e passaging iPSC umano

  1. Quando le iPSC umane raggiungono oltre il 90% di confluenza, rimuovere i vecchi supporti. Risciacquare con 3 ml di DPBS una volta.
  2. Aggiungere 1 mL di 0,5 mM EDTA nella soluzione DPBS. Incubare in 5% CO2 a 37 °C per 5-8 min.
  3. Rimuovere EDTA per aspirazione. Aggiungere 1 mL di supporti di passaging iPSC. Rimuovere manualmente gli iPSC.
  4. Prendere 600-900 μL di sospensione monocellulare e ri-placcarli su una piastra a 6 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale (diluizione: da 1:6 a 1:10). Incubare in 5% CO2 a 37 °C durante la notte.
  5. Aggiorna con 2 ml di supporti E8 completi ogni giorno. Le colture iPSC di solito raggiungono la confluenza dopo 3-4 giorni.

4. Differenziazione dei cardiomiociti chimicamente definita

  1. Coltura di iPSC umane in mezzi E8 completi fino al 95% confluenti (3-4 giorni).
  2. Rimuovere il vecchio supporto. Aggiungere 2 ml di CM differentiation Media II (6 μM CHIR in RPMI1640 più B27 meno integratore di insulina) a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Questo è D0. Non toccare D1.
  3. Su D2, sostituire con 2 mL di CM differenziazione Media I (RPMI1640 più B27 meno integratore di insulina).
  4. Su D3, sostituire con 2 mL di CM differentiation Media III (5 μM IWR-1 in RPMI1640 più B27 meno integratore di insulina). Non toccare D4.
  5. Su D5, sostituire con 2 ml di CM differenziazione Media I.
  6. Su D7, sostituire con 2 ml di cm di differenziazione Media IV (RPMI1640 più supplemento B27). Successivamente, aggiorna i media a giorni alterni.
  7. Su D11 quando si osservano cellule contraenti, sostituire con 2 ml di CM differenziazione Media V (senza glucosio).
  8. Su D13, sostituire con 2 mL di cm di differenziazione Media V.
  9. Su D15, sostituire con 2 ml di CM differenziazione Media IV.
  10. Su D17-D21, sostituire con 2 ml di differenziazione CM Media IV a giorni alterni.

5. Passaggio iPSC-CM umani

  1. Rimuovere i vecchi supporti e risciacquare le celle con 3 ml di DPBS una volta.
  2. Applicare 1 mL di soluzione di dissociazione CM (vedere Tabella dei materiali)su ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Incubare in 5% CO2 a 37 °C per 5-8 min.
  3. Dissociare meccanicamente gli iPSC-CM in singole cellule mediante pipettaggio vigoroso.
  4. Trasferire le celle in un tubo conico da 15 ml. Aggiungere 2 ml di mezzi di passaggio CM (10% KSR in RMPI1640 più supplemento B27) per neutralizzare la soluzione di dissociazione CM.
  5. Girare a 300 x g per 5 minuti a RT.
  6. Scartare il surnatante. Risospese le cellule con un volume desiderato di mezzi di passaggio CM. Seminali in un piatto / piatto rivestito di matrice della membrana basale. Gli iPSC-CM umani riprendono a battere 1-3 giorni dopo il passaggio.

6. Espansione di iPSC-CM umani

  1. Risciacquare D10-12 battendo iPSC-CM con 3 ml di DPBS per ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti una volta. Aggiungere 1 mL di soluzione di dissociazione CM (Fase 5.2). Incubare in 5% CO2 a 37 °C per 7-10 min.
  2. Dissociare meccanicamente gli iPSC-CM in singole cellule mediante pipettaggio vigoroso.
  3. Trasferire le celle in un tubo conico da 15 ml. Aggiungere 2 ml di mezzi di passaggio CM per neutralizzare la soluzione di dissociazione CM.
  4. Girare a 300 x g per 5 minuti a RT.
  5. Scartare il surnatante. Risospese le cellule con un volume appropriato di mezzi di passaggio CM. Pipetta su e giù per fare sospensione a cella singola. Semina un milione di iPSC-CM in un piatto di 10 cm rivestito di matrice a membrana basale.
  6. Il giorno dopo rimuovi i vecchi media. Aggiungere 10 mL di mezzi di proliferazione cardiomiocitaria (Media VI: 2 μM CHIR99021). Cambia i media a giorni alterni.
  7. Quando gli iPSC-CM diventano confluenti dopo 7-9 giorni di coltura, ripetere il passaggio per un'ulteriore espansione degli iPSC-CM.

7. Immunofluorescenza

  1. Prima della colorazione dell'immunofluorescenza, seminare iPSC-CM su coperture rivestite di matrice della membrana basale che vengono poste in una piastra a 24 pozzetti (densità di semina: 0,5-1 x10 6 cellule / mL). Mantenere iPSC-CM in coltura per almeno 4 giorni.
  2. Lavare le celle utilizzando 1 mL di DPBS una volta.
  3. Aggiungere 0,5 ml di paraformaldeide al 4% (PFA) e incubare per 15 minuti a RT.
  4. Lavare le celle utilizzando 1 mL di DPBS. Ripeti una volta.
  5. Aggiungere 0,5 ml di 0,1% Triton X-100 e incubare per 20 minuti a RT.
  6. Lavare con 1 mL di DPBS due volte.
  7. Aggiungere 0,5 ml di BSA allo 0,2% in DPBS (soluzione di blocco). Incubare a RT per 1 ora.
  8. Aggiungere 200 μL di anticorpo primario diluito con soluzione bloccante (diluizione: 1:400-1:1000). Incubare a 4 °C durante la notte.
  9. Lavare le celle utilizzando 0,5 ml di soluzione bloccante per 3 minuti con agitazione. Ripeti due volte.
  10. Aggiungere 200 μL di anticorpo secondario diluito nella soluzione bloccante. Incubare a RT per 1 ora.
  11. Risciacquare le cellule tre volte con 0,5 ml di DPBS, ciascuna per 3 minuti con agitazione.
  12. Nuclei di controstain con DAPI (diluizione 1:2000) e incubare per 5 min a RT.
  13. Risciacquare le cellule tre volte con 0,5 ml di DPBS.
  14. Montare le celle sui coperchi su un vetrino per microscopio utilizzando 5 μl di supporto di montaggio. Conservare a 4 °C e proteggere dalla luce.

8. Preparazione del campione di citometria a flusso

  1. Lavare i CM iPSC umani con 3 ml di DPBS una volta.
  2. Aggiungere 1 mL di soluzione di dissociazione CM e incubare in CO2 al 5% a 37 °C per 7-10 min.
  3. Rimuovere le celle utilizzando una pipetta da 1.000 μL. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo FACS rotondo attraverso un cappuccio del filtro. Il tubo FACS è pre-riempito con 1 mL di mezzo passante iPSC-CM (10% KSR) per neutralizzare l'attività enzimatica.
  4. Girare a 300 x g per 5 min.
  5. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Aggiungere 250 μL di soluzione di fissazione/permeabilizzazione (vedere Tabella dei materiali). Incubare per 20 minuti a 4 °C.
  6. Aggiungere 1 mL di tampone Permanente/Lavaggio. Vortice brevemente e ruota a 300 x g per 4 min.
  7. Scartare il surnatante. Aggiungere 100 μL di anticorpi primari diluiti (1:200-1:500) in 1x tampone Perm/Wash. Vortice brevemente e incubare durante la notte a 4 °C.
  8. Lavare le celle aggiungendo 1 mL di tampone Perm/Wash. Vortice brevemente e ruota a 300 x g per 4 min.
  9. Scartare il surnatante. Aggiungere 100 μL di anticorpi secondari diluiti (1:500-1:1.000). Vortice brevemente e incubare a RT per 1 ora. Proteggere dalla luce se gli anticorpi secondari sono coniugati con fluorescenza sensibile alla luce.
  10. Lavare le celle aggiungendo 1 mL di tampone permanente/lavaggio. Vortice brevemente e girare a 300g per 4 min.
  11. Scartare il surnatante. Celle risospese con 400 μL di tampone colorante FACS (PBS/4% FBS). Conservare a 4 °C fino al caricamento su uno strumento FACS.

9. QPCR in tempo reale

  1. Rimuovere i vecchi media nella cultura umana iPSC-CM. Aggiungere 500-700 μL di tampone di lisi alle cellule lisate. Incubare per 3 minuti a RT. Scape cell lysate e trasferire in un tubo privo di RNasi da 1,5 ml. Procedere immediatamente all'estrazione totale dell'RNA o conservare a -80 °C.
  2. Isolare l'RNA totale utilizzando un kit di estrazione dell'RNA seguendo le istruzioni del produttore.
  3. Misurare la concentrazione di RNA e valutare la qualità dell'RNA totale con uno spettrofotometro.
  4. Eseguire la reazione di trascrizione inversa utilizzando un kit di sintesi del cDNA. Il volume totale della reazione RT è di 20 μL di cui 4 μL di miscela di reazione (5x), 1 μL di trascrittasi inversa, 1 μg di RNA totale e acqua priva di RNasi.
  5. Incubare la miscela di reazione RT completa in un termociclatore utilizzando il seguente protocollo: 25 °C per 5 min; 46 °C per 20 min; 95 °C per 1 min; tenere a 4 °C.
  6. Diluire il cDNA entro 1:10 usando acqua priva di nucleasi. Impostare la reazione qPCR in tempo reale mescolando 1 μL di modello di cDNA, 1 μL di primer/sonda, 10 μL di miscela master qPCR e 8 μL di acqua priva di nucleasi.
  7. Esegui in un sistema PCR in tempo reale. Il protocollo di ciclo è 50 °C 2 min (hold), 95 °C 10 min (hold), 95 °C 15 sec, 60 °C 1 min, ripetere per 40 cicli.
  8. Raccogliere i valoriC T per ciascun gene in ciascun campione. L'abbondanza relativa di mRNA viene calcolata sottraendo il valore CT del gene bersaglio dal valore CT di un gene di pulizia. L'espressione genica relativa viene analizzata con il metodo2 -ΔΔCT.

10. Registrazione del morsetto patch a cella intera

  1. Dissociare iPM-CM in singole celle utilizzando la soluzione di dissociazione CM come descritto in precedenza.
  2. Cellule di semi a bassa densità su coperture rivestite con matrice di membrana basale. Coltivali per 3-4 giorni in Media IV.
  3. Tirare pipette (resistenza 0,9-1,5 MΩ) da capillari di vetro borosilicato utilizzando un estrattore di microelettrodi orizzontale.
  4. Incubare le cellule nella soluzione di Tyrode (pH=7,35).
  5. Riempire le pipette con una soluzione di elettrodi (pH=7,3) composta dalle seguenti sostanze chimiche: 120 mM di acido aspartico, 20 mM KCl, 2 mM MgCl2,5 mM HEPES, 10 mM NaCl, 5 mM EGTA, 0,3 mM Na-GTP, 14 mM fosfocreatina, 4 mM K-ATP e 2mM creatina fosfochinasi.
  6. Posizionare le celle nella modalità di bloccaggio corrente utilizzando un impulso di corrente di 1,5-2 diastolico di 5 ms a 1 Hz.
  7. Registra i potenziali d'azione (AP) utilizzando un amplificatore a microelettrodo e una scheda di acquisizione basata su software.

Risultati

Riprogrammazione iPSC umana da PBMC
Dopo la pre-coltura con Complete Blood Media per 7 giorni, le PBMC diventano grandi con nuclei visibili e citoplasma (Figura 1B), indicando che sono pronte per la trasfezione del virus. Dopo la trasfezione con i fattori di riprogrammazione del virus Sendai, i PBMC saranno sottoposti a un processo di riprogrammazione epigenetica per un'altra settimana. In genere, otteniamo 30-50 colonie di iPSC dalla tras...

Discussione

Durante la riprogrammazione iPSC, è fondamentale coltivare PBMC per 1 settimana fino a quando non vengono ingranditi con nuclei chiari e citoplasma. Poiché i PBMC non proliferano, un numero di cellule appropriato per la trasduzione virale è importante per una riprogrammazione iPSC di successo. Il numero di cellule pbMC, la molteplicità dell'infezione (MOI) e il titolo del virus devono essere considerati e regolati per raggiungere i risultati di trasduzione ottimali. Per la differenziazione cardiaca, la densità inizi...

Divulgazioni

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Questo studio è stato supportato dall'American Heart Association (AHA) Career Development Award 18CDA34110293 (M-T.Z.), Additional Ventures AVIF e SVRF awards (M-T.Z.), National Institutes of Health (NIH / NHLBI) sovvenzioni 1R01HL124245, 1R01HL132520 e R01HL096962 (I.D.). Il Dr. Ming-Tao Zhao è stato anche supportato da fondi di avvio dell'Abigail Wexner Research Institute presso il Nationwide Children's Hospital.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
ABI 7300 Fast Real-Time PCR SystemThermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Microelectrode AmplifierMolecular DevicesMicroelectrode Amplifier
B27 supplementThermo Fisher Scientific17504044
B27 supplement minus insulinThermo Fisher ScientificA1895601
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization KitBD Biosciences554714Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer
BD Vacutainer CPT tubeBD Biosciences362753Blood cell separation tube
CHIR99021Selleck ChemicalsS2924
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming KitThermo Fisher ScientificA16517Sendai virus reprogramming kit
Digidata 1200BAxon InstrumentsAcquisition board
Direct-zol RNA Miniprep kitZymo ResearchR2050RNA extraction kit
DMEM/F12Thermo Fisher Scientific11330057
Essential 8 mediumThermo Fisher ScientificA1517001E8 media for iPSC culture
GlutaMAX supplementThermo Fisher Scientific35050061L-glutamine alternative
Growth factor reduced MatrigelCorning356231Basement membrane matrix
iScript cDNA Snythesis KitBio-Rad1708891cDNA synthesis
IWR-1-endoSelleck ChemicalsS7086
KnockOut Serum Replacement (KSR)Thermo Fisher Scientific10828028
pCLAMP 7.0Molecular DevicesElectrophysiology data acquisition & analysis software
Recombinant human EPOThermo Fisher ScientificPHC9631
Recombinant human FLT3Thermo Fisher ScientificPHC9414
Recombinant human IL3Peprotech200-03
Recombinant human IL6Thermo Fisher ScientificPHC0065
Recombinant human SCFPeprotech300-07
RPMI 1640 mediumThermo Fisher Scientific11875093
RPMI 1640 medium, no glucoseThermo Fisher Scientific11879020
SlowFade Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificS36936Mounting media
StemPro-34 SFMThermo Fisher Scientific10639011PBMC culture media
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444964qPCR master mix
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol redThermo Fisher ScientificA1217703CM dissociation solution
UltraPure 0.5 M EDTAThermo Fisher Scientific15575020iPSC dissociation solution
Y-27632 2HClSelleck ChemicalsS1049

Riferimenti

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