JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, hasta periferik kan mononükleer hücrelerinden insan kardiyomiyositlerini sağlam bir şekilde üretmek ve genişletmek için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Tek bir kan alımından hastaya özgü kardiyomiyositler üretmek, kardiyovasküler hastalık üzerinde hassas tıbba büyük ilgi çekmiştir. İnsan indüklenen pluripotent kök hücrelerden (iPSC) kardiyak farklılaşma, embriyonik kalp gelişimi için gerekli olan tanımlanmış sinyal yolları ile modüle edilir. 2-B ve 3 boyutlu platformlarda çok sayıda kardiyak farklılaşma yöntemi çeşitli verimlilikler ve kardiyomiyosit verimi ile geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin çeşitliliği takip etmek zor olabileceği için bu, alanın dışındaki araştırmacıların kafasını karıştırdı. Burada, periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC' ler) hastaya özgü kardiyomiyositlerin sağlam bir şekilde üretilmesini ve genişlemesini ayrıntılı olarak anlatan kapsamlı bir protokol sunuyoruz. İlk olarak, entegrasyonsuz Sendai virüs vektörleri kullanarak bir hastanın kan örneğinden yüksek verimli bir iPSC yeniden programlama protokolünü açıklıyoruz. Daha sonra, çoğu insan iPSC hattından dayak kardiyomiyositleri sağlam bir şekilde üretebilen küçük bir molekül aracılı monolayer farklılaşma yöntemini detaylandırıyoruz. Ek olarak, endüstriyel ve klinik sınıf uygulamalar için hasta kaynaklı kardiyomiyositleri hızla genişletebilen küçük bir molekül (CHIR99021) kullanılarak ölçeklenebilir bir kardiyomiyosit genişletme protokolü getirilmiştir. Sonunda, bu iPSC-CM'lerin moleküler tanımlaması ve elektrofizyolojik karakterizasyonu için ayrıntılı protokoller tasvir edilir. Bu protokolün kardiyovasküler gelişim ve kök hücre biyolojisi hakkında sınırlı bilgiye sahip yeni başlayanlar için pragmatik olmasını bekliyoruz.

Giriş

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin keşfi modern kardiyovasküler tıpta devrim yaptı1,2. İnsan iPSC'leri kardiyomiyositler, endotel hücreleri, düz kas hücreleri ve kardiyak fibroblastlar da dahil olmak üzere kalpteki tüm hücre tiplerini kendi kendine yenileyebilir ve üretebilir. Hasta iPSC türevi kardiyomiyositler (iPSC-CM'ler), genetik olarak kalıtsal kardiyovasküler hastalıkların (CVD' ler) modellanması ve yeni ilaçlar için kardiyak güvenliğin test edilebilmesi için süresiz kaynaklar olarak hizmet edebilir3. Özellikle, hasta iPSC-CM'ler, uzun QT sendromu4 ve genişlemiş kardiyomiyopati (DCM)5gibi kardiyomiyositlerdeki kusurlardan elde edilen CVD'lerin genetik ve moleküler etiyolojilerini araştırmaya hazırdır. CRISPR/Cas9 aracılı genom düzenleme ile birlikte, hasta iPSC-CM'ler, doğumsal kalp kusurları (CHD'ler)6,7,8dahil olmak üzere CVD'lerin karmaşık genetik temelini anlamak için benzeri görülmemiş bir yol açmıştır. İnsan iPSC-CM'leri ayrıca kalp krizi sırasında hasarlı miyokard doldurmak için otolog hücre kaynakları olarak hizmet etme potansiyelleri sergilemektedir9. Son yıllarda, kardiyak rejenerasyon ve ilaç testi için tanımlanmış alt tiplere (atriyal, ventriküler ve nodal) sahip yüksek kaliteli insan iPSC-CM'leri üretmek çok önemli hale gelmiştir10.

Kardiyak farklılaşma insan iPSC'lerinden son on yılda büyük ölçüde gelişmiştir. Farklılaşma yöntemleri embriyoid cisim (EB) bazlı spontan farklılaşmadan kimyasal olarak tanımlanmış ve yönlendirilmiş kardiyak farklılaşmaya geçmiştir11. Wnt, BMP, Nodal ve FGF gibi embriyonik kalp gelişimi için gerekli olan anahtar sinyal molekülleri, insan iPSC'lerinden kardiyomiyosit farklılığını arttırmak için manipüle edilir10,12. Önemli gelişmeler, insan iPSC'lerinden sağlam kardiyomiyosit üretimi için Wnt sinyalinin sıralı modülasyonunu (aktivasyonu ve ardından inhibisyon)içerir 13,14. Endüstriyel ve klinik düzeyde üretime yükseltilme potansiyeline sahipolan 15 , 16dayak kardiyomiyositlerinin büyük ölçekli üretimini kolaylaştırmak için kimyasal olarak tanımlanmış kardiyak farklılaşma tarifleri araştırılmıştır. Ayrıca, erken insan iPSC-CM'lerinin sağlam genişlemesi, küçük bir kimyasal (CHIR99021)17kullanılarak constitutive Wnt aktivasyonuna maruz kalarak elde edilir. Son zamanlarda, alt tipe özgü kardiyomiyositler, insan iPSC'lerinden kardiyomiyosit soy taahhüdü sırasında belirli farklılaşma pencerelerinde retinoik asit (RA) ve Wnt sinyal yollarının manipülasyonu yoluyla üretilir18,19,20,21,22.

Bu protokolde, hasta periferik kan mononükleer hücrelerinden kaynaklanan insan CD'lerinin sağlam üretimi ve çoğalması için bir çalışma prosedürünü detaylandırıyoruz. 1) insan PBMC'lerinin iPSC'lere yeniden programlanması, 2) insan iPSC'lerinden sağlam dayak kardiyomiyositleri üretimi, 3) erken iPSC-CM'lerin hızlı genişlemesi, 4) insan iPSC-CM'lerin moleküler karakterizasyonu ve 5) insan iPSC-CM'lerin yama kelepçesi ile tek hücreli düzeyde elektrofizyolojik ölçümü için protokoller sunuyoruz. Bu protokol, hasta kan hücrelerinin dayak kardiyomiyositlerine dönüştürülmesiyle ilgili ayrıntılı deneysel prosedürleri kapsamaktadır.

Protokol

İnsan denekler için deneysel protokoller ve bilgilendirilmiş onay, Nationwide Çocuk Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylandı.

1. Hücre kültürü ortamlarının, çözümlerinin ve reaktiflerinin hazırlanması

  1. PBMC medyayı hazırlama
    1. 20 mL bazal PBMC kültür medya (1x) ve 0,52 mL takviye karıştırın. Her birine 20 μL SCF ve FLT3 (stok konsantrasyonu: 100 μg/mL), her biri 4 μL IL3, IL6 ve EPO (stok konsantrasyonu: 100 μg/mL) ve 200 μL L-glutamin alternatifi (100x) ekleyin. İyice karıştırın. 0,22-μm filtre ünitesi kullanarak steril bir davlumbazda filtreleyin. Bunu Tam Kan Medyası olarak adlandır.
    2. 20 mL bazal PBMC kültür medyasını (1x) ve 0,52 mL'lik Ek'i karıştırın. 200 μL L-glutamin alternatifi (100x) ekleyin. İyice karıştırın. 0,22-μm filtre ünitesi kullanarak filtreleyin. Bunu Supplement Blood Media olarak adlandır.
  2. Eksiksiz E8 ortamı hazırlayın
    1. Tam E8 ortam yapmak için 500 mL E8 bazal ortam ve 10 mL E8 takviyesi (4 °C'de bir gecede çözülür) karıştırın. Kullanmadan önce oda sıcaklığına (RT) dengeyi kullanın.
  3. iPSC geçen medyayı hazırlama
    1. 200 mL komple E8 ortamına 40 μL Y-27632 Kaya inhibitörü (1:5.000 seyreltme, stok konsantrasyonu: 10 mM) ekleyin. İyice karıştırın. Kullanmadan önce RT'ye eşdeğer.
  4. Kardiyomiyosit farklılaşma ortamı hazırlama
    1. Medya I: 500 mL RPMI1640'ı 10 mL B27 eksi insülin takviyesi (50x) ile karıştırın.
    2. Ortam II: Ortam I'e uygun miktarda CHIR99021 (GSK3 inhibitörü) stoğu ekleyin (CHIR99021 son konsantrasyonu 6 μM). İyice karıştırın.
    3. Ortam III: Ortam I'e uygun miktarda IWR-1 (Wnt inhibitörü) stoğu ekleyin (IWR-1 son konsantrasyonu 5 μM). İyice karıştırın.
    4. Medya IV: 500 mL RPMI1640'ı 10 mL B27 takviyesi (50x) ile karıştırın. İyice karıştırın.
    5. Ortam V: 500 mL RPMI1640 'ı (glikozsuz) 10 mL B27 takviyesi (50x) ile karıştırın. İyice karıştırın.
    6. Medya VI: Media IV'e uygun miktarda CHIR99021 stoğu ekleyin (CHIR99021 son konsantrasyonu 2 μM). İyice karıştırın.
  5. iPSC-CM geçen medyayı hazırlama
    1. 90 mL Media IV'e 10 mL Nakavt Serum Replasmanı (KSR) ekleyin (KSR son konsantrasyonu: %10). İyice karıştırın.
  6. iPSC-CM dondurma medyası hazırlama
    1. 9 mL KSR'ye 1 mL DMSO ekleyin (son konsantrasyonlar: %10 DMSO/%90 KSR) ve iyice karıştırın.
  7. Bodrum membran matrisi orta kaplamalı plakaları hazırlayın
    1. Bir gecede 4 °C'de bodrum membran matrisi ortamını ve 1,5 mL tüplerde aliquot çözün. Bu ortamın 1 mL'sini 250 mL'ye kadar DMEM/F12 ortamı (1:250 seyreltme) ekleyin ve iyice karıştırın. Seyreltilmiş çözeltinin kuyu başına 2 mL'sini 6 kuyulu bir plakaya uygulayın ve kullanmadan önce 30 dakika boyunca 37 °C'de% 5 CO2'de kuluçkaya yatırın.

2. PBMC'lerin iPSC yeniden programlanması

  1. PBMC'leri kan örneklerinden ayırın.
    1. Hasta kan örneklerini (~5 mL) toplayın ve kan hücresi ayırma tüplerine aktarın (bkz. Malzeme Tablosu). 10x ters çevirerek karıştırın.
    2. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1.500 x g'da santrifüj.
    3. Tüpleri dikkatlice dışarı alın ve% 70 etanol ile püskürtün. Biyogüvenlik başlığı altında, mononükleer hücreleri (buffy tabakası) rahatsız etmeden kapakları çıkarın. PBMC'ler plazma tabakasının hemen altında beyazımsı bir tabaka halinde olacaktır (Şekil 1A). 1000 μL pipet kullanarak tüm buffy tabakasını toplayın ve 15 mL konik bir tüpe aktarın.
    4. Otomatik hücre sayacı kullanarak hücre numarasını sayın. RT'de 25 dakika boyunca tüpü 300 x g'da döndürün.
    5. Üstnatant atın. 10 mL DPBS ile yıkayın (Ca2+/ Mg2 + ücretsiz).
    6. RT'de 15 dakika boyunca tüpü 300 x g'da döndürün.
    7. Üsttekini çıkarın. Hücre peletlerini 1 mL donma ortamına (KSR artı %10 DMSO) yeniden sunun. Şişe başına 1 x 106 hücre yapmak için hücre yoğunluğunu ayarlayın.
    8. PBMC cryovials'ı bir hücre dondurma kabına yerleştirin ve gece boyunca -80 °C'de tutun. Ertesi gün uzun süre depolama için sıvı azot tankına aktarın.
  2. iPSC yeniden programlama.
    1. 15 mL konik tüpe 3 mL Takviye Kan Ortamı ekleyin. PBMC'leri 37 °C su banyosunda çözün ve konik bir tüpe aktarın. RT'de 7 dakika boyunca 300 x g'da dön.
    2. Üstnatant atın. PBMC'leri Tam Kan Ortamı ile Yeniden Yüt. Onları 24 kuyu doku kültürü plakasının iki kuyusuna tohumlayın (bodrum membran matrisi yoktur).
    3. Bir gecede 37 °C'de%5 CO 2'de kuluçkaya yatırın. Ertesi gün eski ortamın yarısını (0,5 ml) hafifçe çıkarın ve 0,5 mL taze Tam Kan Ortamı ekleyin.
    4. Eski medyanın yarısını yenileyerek medyayı her gün değiştirin.
    5. Bir hafta sonra, kuyuyu 1 mL Takviye Kan Ortamı ile agresif bir şekilde yıkayın ve hücreleri 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.
    6. Cep telefonu numarasını say. 2 x 10 5 hücre alın ve7 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj alın.
    7. Üstnatant atın. Hücreleri 300 μL Tam Kan Ortamı ile yeniden biriktirin. Üreticinin talimatlarına göre uygun sendai virüs yeniden programlama vektörleri hacmi ekleyerek transfection gerçekleştirin. Bunları 24 kuyulu bir plakanın bir kuyusuna aktarın (bodrum membran matrisi yoktur). Bir gecede 37 °C'de%5 CO 2'de kuluçkaya yatırın.
    8. Ertesi gün 7 dakika boyunca 300 x g'da döner. Üstnatant çıkarın ve 2 mL Tam Kan Ortamı'nda yeniden dirilt. Bodrum membran matrisi ile önceden kaplanmış 6 kuyu plakasının bir kuyusuna aktarın. Bugün 1.
    9. Ertesi gün tabağa dokunma.
    10. D3'te, eski ortamın 1 mL'lik kısmını çıkarın. 1 mL Takviye Kan Ortamı ekleyin.
    11. D5'te 2.2.10 adımlarını yineleyin.
    12. D7'de, eski ortamın 1 mL'lik kısmını çıkarın. 1 mL komple E8 ortam ekleyin.
    13. D8'de, 2.2.12 adımlarını yineleyin.
    14. D9'da eski medyayı kaldırın. 2 mL komple E8 ortam ekleyin. Tamamen yeniden programlanmış hücrelerin bağlanması ve koloniler oluşturmaya başlaması beklenir.
    15. Her gün 2 mL komple E8 ortamla yenileyin.
    16. Sendai virüs transdüksiyondan yaklaşık 2 hafta sonra, büyük iPSC kolonileri ortaya çıkacak ve toplamaya hazır olacaktır.
    17. Kaputtaki stereomikroskop altında iPSC kolonilerini kesin ve tek tek kolonileri 0,5 mL iPSC geçen ortamla önceden yüklenmiş bir bodrum membran matrisi kaplı 24 kuyu plakasına aktarın.
    18. iPSC kolonileri yeni bir bodrum membran matrisi kaplı 6 kuyu plakasına geçmek için yeterince büyüyene kadar her gün 0,5 mL tam E8 ortamla yenileyin.

3. İnsan iPSC bakımı ve geçişi

  1. İnsan iPSC'leri %90'ın üzerinde ifluency'ye ulaştığında, eski medyayı kaldırın. Bir kez 3 mL DPBS ile durulayın.
  2. DPBS çözümüne 1 mL 0,5 mM EDTA ekleyin. 5-8 dakika boyunca 37 °C'de % 5 CO2'de kuluçkaya yatır.
  3. Aspirasyonla EDTA'yı kaldırın. 1 mL iPSC geçen ortam ekleyin. iPSC'leri el ile yerinden sökün.
  4. 600-900 μL tek hücreli süspansiyon alın ve bunları bir bodrum membran matrisi kaplı 6 kuyu plakasına (seyreltme: 1:6 ila 1:10) yeniden plakalayın. Bir gecede 37 °C'de%5 CO 2'de kuluçkaya yatırın.
  5. Her gün 2 mL komple E8 ortamla yenileyin. iPSC kültürleri genellikle 3-4 gün sonra izdiah eder.

4. Kimyasal olarak tanımlanmış kardiyomiyosit farklılaşması

  1. Kültür insan iPSC'leri% 95 birliğe (3-4 gün) kadar tam E8 medyasında.
  2. Eski medyayı kaldırın. 6 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 2 mL CM farklılaşma Media II (RPMI1640'ta 6 μM CHIR artı B27 eksi insülin takviyesi) ekleyin. Burası D0. D1'e dokunmayın.
  3. D2'de, 2 mL CM farklılaşması Media I (RPMI1640 artı B27 eksi insülin takviyesi) ile değiştirin.
  4. D3'te, 2 mL CM farklılaşma Media III (RPMI1640'ta 5 μM IWR-1 artı B27 eksi insülin takviyesi) ile değiştirin. D4'e dokunmayın.
  5. D5'te, 2 mL CM farklılaştırma Media I ile değiştirin.
  6. D7'de, 2 mL CM farklılaştırma Media IV (RPMI1640 artı B27 eki) ile değiştirin. Bundan sonra, medyayı her gün yenileyin.
  7. Büzülen hücreler gözlendiğinde D11'de, 2 mL CM farklılaşma Media V (glikoz yok) ile değiştirin.
  8. D13'te, 2 mL CM farklılaştırma Media V ile değiştirin.
  9. D15'te, 2 mL CM farklılaştırma Media IV ile değiştirin.
  10. D17-D21'de, her gün 2 mL CM farklılaştırma Media IV ile değiştirin.

5. Pasaj insan iPSC-CM'leri

  1. Eski medyayı çıkarın ve hücreleri bir kez 3 mL DPBS ile durulayın.
  2. 6 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 1 mL CM ayrışma çözeltisi uygulayın (bkz. Malzeme Tablosu). 5-8 dakika boyunca 37 °C'de % 5 CO2'de kuluçkaya yatır.
  3. Güçlü pipetleme ile iPSC-CM'leri mekanik olarak tek hücrelere ayırır.
  4. Hücreleri 15 mL konik bir tüpe aktarın. CM ayrışma çözümünü nötralize etmek için 2 mL CM geçiş ortamı (RMPI1640'ta %10 KSR artı B27 takviyesi) ekleyin.
  5. RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da dön.
  6. Üstnatant atın. İstenilen cm geçiriş ortamı hacmine sahip hücreleri yeniden biriktirin. Onları bir bodrum membran matrisi kaplı plakaya / yemeğe tohumlayın. İnsan iPSC-CM'leri geçtikten 1-3 gün sonra atmaya devam eder.

6. İnsan iPSC-CD'lerinin genişletilmesi

  1. D10-12'yi 6 kuyulu bir plakanın her kuyusu için 3 mL DPBS ile iPSC-CM'leri bir kez yenerek durulayın. 1 mL CM ayrışma çözümü ekleyin (Adım 5.2). 7-10 dakika boyunca 37 °C'de % 5 CO2'de kuluçkaya yaslanın.
  2. Güçlü pipetleme ile iPSC-CM'leri mekanik olarak tek hücrelere ayırır.
  3. Hücreleri 15 mL konik bir tüpe aktarın. CM ayrışma çözümünü nötralize etmek için 2 mL CM geçiş ortamı ekleyin.
  4. RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da dön.
  5. Üstnatant atın. Hücreleri uygun bir CM geçiriş ortamı hacmiyle yeniden biriktirin. Pipet yukarı ve aşağı tek hücre süspansiyon yapmak için. Bir milyon iPSC-CM'i bodrum membran matrisi kaplı 10 cm'lik bir çanağa tohumlayın.
  6. Ertesi gün eski medyayı kaldırın. 10 mL kardiyomiyosit çoğalma ortamı ekleyin (Ortam VI: 2 μM CHIR99021). Medyayı iki günde bir değiştirin.
  7. iPSC-CM'ler 7-9 günlük kültürden sonra birleştiğinde, iPSC-CM'lerin daha da genişletilmesi için geçiş adımını tekrarlayın.

7. İmmünoresans

  1. İmmünofluoresans boyamadan önce, 24 kuyu plakasına yerleştirilen bodrum membran matrisi kaplı kapaklara tohum iPSC-CM'ler (tohumlama yoğunluğu: 0,5-1 x 106 hücre/mL). iPSC-CD'leri kültürde en az 4 gün boyunca koruyun.
  2. Hücreleri bir kez 1 mL DPBS kullanarak yıkayın.
  3. %4 paraformaldehit (PFA) 0,5 mL ekleyin ve RT'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
  4. Hücreleri 1 mL DPBS kullanarak yıkayın. Bir kez tekrarlayın.
  5. %0,1 Triton X-100'ün 0,5 mL'sini ekleyin ve RT'de 20 dakika kuluçkaya yatırın.
  6. İki kez 1 mL DPBS ile yıkayın.
  7. DPBS'ye %0,2 BSA'nın 0,5 mL'sini ekleyin (engelleme çözümü). RT'de 1 saat kuluçkaya yaslanın.
  8. Blokaj çözeltisi ile seyreltilmiş 200 μL birincil antikor ekleyin (seyreltme: 1:400-1:1000). Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yaslanın.
  9. Hücreleri 0,5 mL blokaj çözeltisi kullanarak 3 dakika boyunca sallama ile yıkayın. İki kez tekrarlayın.
  10. Blokaj çözeltisinde seyreltilmiş 200 μL ikincil antikor ekleyin. RT'de 1 saat kuluçkaya yaslanın.
  11. Hücreleri 0,5 mL DPBS ile üç kez durulayın, her biri sallama ile 3 dakika boyunca.
  12. DAPI (1:2000 seyreltme) ile karşıt çekirdek ve RT'de 5 dakika kuluçkaya yaslanın.
  13. Hücreleri 0,5 mL DPBS ile üç kez durulayın.
  14. Kapaklardaki hücreleri 5 μl montaj ortamı kullanarak bir mikroskop kaydırağı üzerine monte edin. 4 °C'de saklayın ve ışıktan koruyun.

8. Akış sitometrisi numune hazırlama

  1. İnsan iPSC-CM'lerini bir kez 3 mL DPBS ile yıkayın.
  2. 1 mL CM ayrışma çözeltisi ekleyin ve 7-10 dakika boyunca 37 °C'de% 5 CO2'de kuluçkaya yatırın.
  3. 1.000-μL pipet kullanarak hücreleri yerinden sökün. Hücre süspansiyonunu bir süzgeç kapağından yuvarlak bir FACS tüpüne aktarın. FACS tüpü, enzim aktivitesini nötralize etmek için 1 mL iPSC-CM geçen ortam (%10 KSR) ile önceden doldurulur.
  4. 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
  5. Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatant çıkarın. 250 μL Fiksasyon/Permeabilizasyon çözümü ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu). 4 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatır.
  6. 1 mL Perm/Wash tamponu ekleyin. Vortex kısa bir süre ve 4 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
  7. Üstnatant atın. 1x Perm/Wash tampona 100 μL seyreltilmiş primer antikor (1:200-1:500) ekleyin. Girdap kısa bir süre ve 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yaslanın.
  8. 1 mL Perm/Wash tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın. Vortex kısa bir süre ve 4 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
  9. Üstnatant atın. 100 μL seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin (1:500-1:1.000). Vortex kısa bir süre ve RT'de 1 saat kuluçkaya yaslanın. sekonder antikorlar ışığa duyarlı floresan ile eşlenirse ışıktan koruyun.
  10. 1 mL Perm/yıkama tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın. Vortex kısa bir süre ve 4 dakika boyunca 300g döndürün.
  11. Üstnatant atın. Hücreleri 400 μL FACS boyama tamponu (PBS/%4 FBS) ile yeniden biriktirin. Bir FACS cihazına yüklenene kadar 4 °C'de saklayın.

9. Gerçek zamanlı qPCR

  1. İnsan iPSC-CM kültüründeki eski medyayı kaldırın. Lizat hücrelerine 500-700 μL lizis tamponu ekleyin. RT. Scape hücresinde 3 dakika kuluçkaya yaslanın ve 1,5 ml RNase içermeyen bir tüpe aktarın. Hemen toplam RNA ekstraksiyona geçin veya -80 °C'de saklayın.
  2. Üreticinin talimatını takiben bir RNA çıkarma kiti kullanarak toplam RNA'yı izole edin.
  3. RNA konsantrasyonunu ölçün ve toplam RNA'nın kalitesini bir spektrofotometre ile değerlendirin.
  4. CDNA sentez kiti kullanarak ters transkripsiyon reaksiyonunu gerçekleştirin. Toplam RT reaksiyon hacmi, 4 μL reaksiyon karışımı (5x), 1 μL ters transkriptaz, 1 μg toplam RNA ve RNaz içermeyen su dahil olmak üzere 20 μL'dir.
  5. Aşağıdaki protokolü kullanarak bir termal çevrimde tam RT reaksiyon karışımını kuluçkaya yaslayın: 5 dakika boyunca 25 °C; 20 dakika için 46 °C; 1 dakika için 95 °C; 4 °C'de tutun.
  6. Nükleaz içermeyen su kullanarak cDNA'yı 1:10'a kadar seyreltin. 1 μL cDNA şablonu, 1 μL primer / prob, 10 μL qPCR ana karışımı ve 8 μL çekirdeksiz suyu karıştırarak gerçek zamanlı qPCR reaksiyonunun ayarını ayarlayın.
  7. Gerçek zamanlı bir PCR sisteminde çalıştırın. Bisiklet protokolü 50 °C 2 dk (tutma), 95 °C 10 dk (tutma), 95 °C 15 sn, 60 °C 1 dk, 40 döngü boyunca tekrarlayın.
  8. Her örnekteki her gen için CT değerlerini toplayın. Bağıl mRNA bolluğu, hedef genin CT değerinin bir temizlik geninin CT değerinden çıkarılmasıyla hesaplanır. Bağıl gen ekspresy ekspresy 2-ΔΔCT yöntemi ile analiz edilir.

10. Tüm hücreli yama kelepçe kaydı

  1. Daha önce açıklandığı gibi CM ayrıştırma çözümünü kullanarak iPSC-CM'leri tek hücrelere ayır.
  2. Bodrum membran matrisi kaplı kapaklarda düşük yoğunlukta tohum hücreleri. Media IV'te 3-4 gün boyunca kültür edin.
  3. Yatay bir mikroelektoz çekeceği kullanarak borosilikat cam kılcal damarlardan pipetleri (direnç 0,9-1,5 MΩ) çekin.
  4. Tyrode çözeltisinde hücreleri kuluçkaya yatır (pH=7.35).
  5. Pipetleri aşağıdaki kimyasallardan oluşan elektrot çözeltisi (pH=7.3) ile doldurun: 120 mM aspartik asit, 20 mM KCl, 2 mM MgCl2,5 mM HEPES, 10 mM NaCl, 5 mM EGTA, 0.3 mM Na-GTP, 14 mM fosfokreatin, 4 mM K-ATP ve 2mm kreatin fosfokinaz.
  6. Hücreleri 1 Hz'de 1,5-2 diyastolik eşik 5 ms akım darbesi kullanarak mevcut kelepçe moduna yerleştirin.
  7. Bir mikroelektrod amplifikatörü ve yazılım odaklı bir alım kartı kullanarak eylem potansiyellerini (APs) kaydedin.

Sonuçlar

PBMC'lerden insan iPSC yeniden programlanması
7 gün boyunca Complete Blood Media ile ön kültürden sonra, PBMC'ler görünür çekirdek ve sitoplazma ile büyük hale gelir (Şekil 1B), virüs transfeksiyona hazır olduklarını gösterir. Sendai virüsünün yeniden programlanması faktörleri ile transfeksiyondan sonra, PBMC'ler bir hafta daha epigenetik yeniden programlama işleminden geçecektir. Tipik olarak, 1 x 10 5 PBMC'nin tra...

Tartışmalar

iPSC yeniden programlanması sırasında, PBMC'leri net çekirdek ve sitoplazma ile genişleyene kadar 1 hafta boyunca kültürlendirmek önemlidir. PBMC'ler çoğalmadığından, viral transdüksiyon için uygun bir hücre numarası başarılı iPSC yeniden programlanması için önemlidir. PBMC'lerin hücre sayısı, enfeksiyonun çokluğu (MOI) ve virüs titresi göz önünde bulundurulmalı ve en uygun transdüksiyon sonuçlarına ulaşacak şekilde ayarlanmalıdır. Kardiyak farklılaşma için, ilk tohumlama yoğun...

Açıklamalar

Yazarlar rakip finansal çıkarlar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma Amerikan Kalp Derneği (AHA) Kariyer Geliştirme Ödülü 18CDA34110293 (M-T.Z.), Ek Girişimler AVIF ve SVRF ödülleri (M-T.Z.), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH/NHLBI) tarafından desteklendi. 1R01HL132520 ve R01HL096962 (I.D.). Dr. Ming-Tao Zhao, Nationwide Çocuk Hastanesi Abigail Wexner Araştırma Enstitüsü'nden başlangıç fonlarıyla da desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
ABI 7300 Fast Real-Time PCR SystemThermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Microelectrode AmplifierMolecular DevicesMicroelectrode Amplifier
B27 supplementThermo Fisher Scientific17504044
B27 supplement minus insulinThermo Fisher ScientificA1895601
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization KitBD Biosciences554714Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer
BD Vacutainer CPT tubeBD Biosciences362753Blood cell separation tube
CHIR99021Selleck ChemicalsS2924
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming KitThermo Fisher ScientificA16517Sendai virus reprogramming kit
Digidata 1200BAxon InstrumentsAcquisition board
Direct-zol RNA Miniprep kitZymo ResearchR2050RNA extraction kit
DMEM/F12Thermo Fisher Scientific11330057
Essential 8 mediumThermo Fisher ScientificA1517001E8 media for iPSC culture
GlutaMAX supplementThermo Fisher Scientific35050061L-glutamine alternative
Growth factor reduced MatrigelCorning356231Basement membrane matrix
iScript cDNA Snythesis KitBio-Rad1708891cDNA synthesis
IWR-1-endoSelleck ChemicalsS7086
KnockOut Serum Replacement (KSR)Thermo Fisher Scientific10828028
pCLAMP 7.0Molecular DevicesElectrophysiology data acquisition & analysis software
Recombinant human EPOThermo Fisher ScientificPHC9631
Recombinant human FLT3Thermo Fisher ScientificPHC9414
Recombinant human IL3Peprotech200-03
Recombinant human IL6Thermo Fisher ScientificPHC0065
Recombinant human SCFPeprotech300-07
RPMI 1640 mediumThermo Fisher Scientific11875093
RPMI 1640 medium, no glucoseThermo Fisher Scientific11879020
SlowFade Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificS36936Mounting media
StemPro-34 SFMThermo Fisher Scientific10639011PBMC culture media
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444964qPCR master mix
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol redThermo Fisher ScientificA1217703CM dissociation solution
UltraPure 0.5 M EDTAThermo Fisher Scientific15575020iPSC dissociation solution
Y-27632 2HClSelleck ChemicalsS1049

Referanslar

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  3. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
  4. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  5. Hinson, J. T., et al. Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy. Science. 349 (6251), 982-986 (2015).
  6. Deacon, D. C., et al. Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy. Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).
  7. Gifford, C. A., et al. Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier. Science. 364 (6443), 865-870 (2019).
  8. Lo Sardo, V., et al. Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing. Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).
  9. Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
  10. Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now. Stem Cells. 38, 822-833 (2020).
  11. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  12. Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
  13. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  14. Zhao, M. T., et al. Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).
  15. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  16. Lian, X., et al. Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation. Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).
  17. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  18. Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
  19. Liang, W., et al. Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).
  20. Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
  21. Ren, J., et al. Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes. Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).
  22. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).
  23. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).
  24. Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).
  25. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  26. Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism. Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).
  27. Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. Determinants of cardiac growth and size. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150 (2020).
  28. Campa, V. M., et al. Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).
  29. Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).
  30. Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imsel BiyolojiSay 168periferik kan monon kleer h crelerPBMC lerinsan ind klenmi pluripotent k k h creleriPSC lerkardiyak farkl la maiPSC yeniden programlamakardiyomiyosit geni lemesi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır