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要約

ここでは、患者末梢血単核細胞からヒト心筋細胞を強固に生成・拡張するプロトコルを提示する。

要約

単一の血液引き分けから患者固有の心筋細胞を生成することは、心血管疾患の精密医療に大きな関心を集めています。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)からの心臓分化は、胚性心臓の発達に不可欠なシグナル伝達経路によって調節される。2次元および3次元プラットホーム上の多数の心臓分化方法は、様々な効率および心筋細胞収率と開発された。これらの方法の多様性は従うのが難しい可能性があり、これは現場外の調査官を困惑させた。ここでは、末梢血単核細胞(PBMC)からの患者特異的心筋細胞の堅牢な生成と拡大を詳述した包括的なプロトコルを提示する。まず、非集積センダイウイルスベクターを用いた患者の血液サンプルからの高効率iPSCリプログラミングプロトコルについて説明する。次に、ほとんどのヒトiPSCラインから打ち負かす心筋細胞を堅牢に生成できる、小分子媒介単層分化法を詳述する。さらに、スケーラブルな心筋細胞拡張プロトコルは、産業および臨床グレードのアプリケーションのために患者由来の心筋細胞を急速に拡大することができる低分子(CHIR99021)を使用して導入されています。最後に、これらのiPSC-CMの分子同定と電気生理学的特徴付けのための詳細なプロトコルが描かれています。このプロトコルは、心血管の発達と幹細胞生物学に関する限られた知識を持つ初心者にとって実用的なものになることを期待しています。

概要

ヒト人工多能性幹細胞の発見は、現代の心臓血管医学1,2に革命を起こしました。ヒトのiPSCは、心筋細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、心臓線維芽細胞を含む、心臓内のすべての細胞タイプを自己再生し、生成することができます。iPSC由来心筋細胞(iPSC-CM)は、遺伝的に遺伝性心血管疾患(CVD)をモデル化し、新薬の心の安全性をテストするための無期限のリソースとして役立つことができる3。特に、iPSC-CMは、長いQT症候群4および拡張型心筋症(DCM)5のような心筋細胞の欠陥に由来するCVDの遺伝的および分子的病因を調査する準備が整っている。CRISPR/Cas9媒介ゲノム編集と組み合わせることで、患者iPSC-CMは先天性心不全(CHD)6、7、8を含むCVDの複雑な遺伝的基盤を理解するための前例のない道を開いた。ヒトiPSC-CMは、心臓発作9の間に損傷した心筋を補充するための自己細胞源として役立つ可能性を示している。近年、心臓再生および薬物検査10に対して、定義されたサブタイプ(心房、心室および節状)を有する高品質のヒトiPSC-CMを生成することが最も重要になっている。

ヒトiPSCとの心臓分化は、過去10年間で大きく進歩してきました。分化方法は、胚体(EB)ベースの自発的分化から化学的に定義され、指示された心臓分化11に行った。Wnt、BMP、Nodal、FGFなどの胚性心臓の発達に不可欠な主要なシグナル伝達分子は、ヒトiPSC10,12からの心筋細胞分化を増強するために操作される。顕著な進歩は、ヒトiPSC13,14から心筋細胞の堅牢な生成のためのWntシグナル伝達(活性化後の阻害)の順次変調を含む。化学的に定義された心臓分化のレシピは、産業および臨床レベルの生産にアップグレードされる可能性を有する拍動心筋細胞15、16の大規模な生産を容易にするために探求されてきた。また、初期ヒトiPSC-CMの堅牢な拡張は、小型化学物質(CHIR99021)17を用いた構成的なWnt活性化への曝露によって達成される。最近では、ヒトiPSC18、19、20、21、22からの心筋細胞系統のコミットメント中に特定の分化窓におけるレチノイン酸(RA)およびWntシグナル伝達経路の操作を介してサブタイプ特異的な心筋細胞が生成される。

本プロトコルでは、患者末梢血単核細胞由来のヒトCMの堅牢な生成と増殖のための作業手順を詳述する。1)ヒトPBMCをiPSCにリプログラミングするプロトコル、2)ヒトiPSCからの打ち負拍起動細胞の堅牢な生成、3)初期iPSC-CMの急速な拡大、4)ヒトiPSC-CMの分子特性化、および5)パッチクランプによる単一細胞レベルでのヒトiPSC-CMの電気生理学的測定のためのプロトコルを提示する。このプロトコルは、患者の血液細胞を拍動心筋細胞に変換する詳細な実験手順をカバーしています。

プロトコル

実験議定書とヒト被験者のインフォームド・コンセントは、全国小児病院の機関審査委員会(IRB)によって承認されました。

1. 細胞培養培地、溶液、試薬の製造

  1. PBMC メディアの準備
    1. 20 mLの基礎PBMC培養培地(1x)と0.52 mLのサプリメントを混ぜます。SCFとFLT3の20 μL(ストック濃度:100 μg/mL)、4 μLのIL3、IL6、EPO(ストック濃度:100 μg/mL)、L-グルタミン代替(100x)を200 μL加えます。それらを徹底的に混ぜます。0.22μmのフィルター単位を使用して無菌フードでフィルター。これを完全な血液メディアと名前を付けます。
    2. 20 mL の基礎 PBMC 培養培地 (1x) と 0.52 mL のサプリメントを混合します。L-グルタミン代替(100x)の200 μLを加えます。それらを徹底的に混ぜます。0.22μmのフィルター単位を使用してフィルター。これを補足血液培地とします。
  2. 完全なE8メディアを準備する
    1. E8基底メディア500mLとE8サプリメント10mL(4°Cで一晩解凍)を混ぜて完全なE8メディアを作ります。使用前に室温(RT)に平衡化します。
  3. iPSCパスジングメディアの準備
    1. 40 μLの Y-27632 ロックインヒビター (1:5,000 希釈、ストック濃度: 10 mM) を完全な E8 媒体の 200 mL に加えます。十分に混ぜます。使用前にRTに平衡化します。
  4. 心筋細胞分化培地の準備
    1. メディアI:500 mLのRPMI1640を10 mLのB27マイナスインスリンサプリメント(50x)と混合する。
    2. メディアII:メディアI(CHIR99021最終濃度6μM)に適切な量のCHIR99021(GSK3阻害剤)ストックを追加します。よく混ぜます。
    3. メディアIII:IWR-1(Wnt阻害剤)ストックの適切なボリュームをメディアI(IWR-1最終濃度5μM)に追加します。よく混ぜます。
    4. メディアIV:B27サプリメント(50x)の10 mLとRPMI1640の500 mLを混合します。よく混ぜます。
    5. メディアV:混合 500 rpmI1640 (無グルコース) 10 mL の B27 サプリメント (50x).よく混ぜます。
    6. メディアVI:メディアIV(CHIR99021最終濃度2μM)に適切な量のCHIR99021ストックを追加します。よく混ぜます。
  5. iPSC-CMパッセイメディアの準備
    1. メディアIV(KSR最終濃度:10%)の90 mLにノックアウト血清交換(KSR)の10 mLを加えます。よく混ぜます。
  6. iPSC-CM凍結メディアの準備
    1. 1 mL の DMSO を KSR の 9 mL (最終濃度: 10% DMSO/90% KSR) に加え、よく混ぜます。
  7. 基質膜マトリックス中被覆プレートを準備する
    1. 一晩4°Cで基質膜マトリックス培地を解凍し、1.5 mLチューブでアリコートを行います。この培地の1 mLをDMEM/F12培地(1:250希釈)の250 mLに加え、十分に混ぜます。希釈液2 mLを6ウェルプレートにウェルあたり2 mL塗布し、37°Cで5%CO2 で30分間インキュベートします。

2. PBMCのiPSCリプログラミング

  1. 血液サンプルからPBMCsを分離します。
    1. 患者の血液サンプル(〜5 mL)を収集し、血液細胞分離管に移す( 材料表を参照)。10倍反転して混ぜます。
    2. 室温で30分間1,500 x g の遠心分離機。
    3. 慎重にチューブを取り出し、70%エタノールでスプレーします。バイオセーフティフードの下で、単核細胞(バフィー層)を邪魔することなくキャップを取り外します。PBMCはプラズマ層のすぐ下に白っぽい層になります(図1A)。1000 μL ピペットを使用して全体のバフィー層を収集し、15 mL の円錐管に移します。
    4. 自動セル カウンターを使用してセル番号をカウントします。RTで25分間300 x g でチューブを回転させます。
    5. 上清を捨てます。DPBS(Ca2+/Mg2+無料)10 mLで洗浄してください。
    6. RTで15分間300 x g でチューブを回転させます。
    7. 上清を取り除く。凍結培地の1mL(KSRプラス10%DMSO)で細胞ペレットを再懸濁する。セル密度を調整して、バイアルあたり1 x 106 のセルを作ります。
    8. PBMCクリオビアルを細胞凍結容器に入れ、一晩で-80°Cに保ちます。翌日に長期保存のために液体窒素タンクに移します。
  2. iPSCのリプログラミング。
    1. 15 mLの円錐形の管に3 mLのサプリメント血液培地を加える。37°Cの水浴でPBMCsを解凍し、円錐形のチューブに移します。RTで7分間300 x g でスピンします。
    2. 上清を捨てます。完全な血液メディアでPBMCを再中断します。24ウェル組織培養プレート(基部膜マトリックスなし)の2つの井戸に播種します。
    3. 一晩で5%CO2を37°Cでインキュベートする。翌日は古いメディアの半分(0.5 ml)をそっと取り除き、0.5 mLの新鮮な完全な血液メディアを加えます。
    4. 古いメディアの半分をリフレッシュして、1日おきにメディアを変更します。
    5. 1週間後、1 mLのサプリメント血液培地でウェルを積極的に洗浄し、細胞を15 mL遠心分離チューブに移します。
    6. セル番号をカウントします。2 x 105 細胞と遠心分離機を300 x g で7分間服用します。
    7. 上清を捨てます。完全な血液メディアの300 μLの細胞を再懸濁させる。メーカーの指示に従ってセンダイウイルスリプログラミングベクターの適切な量を追加することにより、トランスフェクションを実行します。24ウェルプレート(基部膜マトリックスなし)の1つの井戸にそれらを転送します。一晩で5%CO2を37°Cでインキュベートする。
    8. 翌日は300×gで7分間スピンします。上清を取り除き、完全な血液メディアの2 mLで再中断します。基膜マトリックスであらかじめコーティングされた6ウェルプレートの1つの井戸に移します。これは 1 日目 (D1) です。
    9. 次の日に皿に触れないでください。
    10. D3 で、古いメディアの 1 mL を取り外します。サプリメント血液培地の1 mLを追加します。
    11. D5 でステップ 2.2.10 を繰り返します。
    12. D7 で、古いメディアの 1 mL を取り外します。完全なE8メディアの1 mLを追加します。
    13. D8 で、ステップ 2.2.12 を繰り返します。
    14. D9 で、古いメディアを取り外します。完全なE8メディアの2 mLを追加します。完全に再プログラムされた細胞は、コロニーの形成を取り付け、開始することが期待される。
    15. 毎日2mLの完全なE8メディアでリフレッシュしてください。
    16. 仙台ウイルスの感染から約2週間で、大型のiPSCコロニーが出現し、ピッキングの準備が整います。
    17. フード内の実体顕微鏡下でiPSCコロニーを切断し、0.5 mLのiPSC通過媒体をプリロードした基質膜マトリックスコーティングされた24ウェルプレートに個々のコロニーを移管します。
    18. iPSCコロニーが新しい基膜マトリックスコーティングされた6ウェルプレートに通過するのに十分な大きさになるまで、毎日0.5 mLの完全なE8培地でリフレッシュしてください。

3. ヒトiPSCのメンテナンスと過渡

  1. ヒトのiPSCが90%以上の合流率に達したら、古いメディアを取り除く。3 mLのDPBSを一度にすすいでください。
  2. DPBS溶液に0.5 mM EDTAの1 mLを加えます。5-8分間、37°Cで5%CO2 でインキュベートします。
  3. 吸引によってEDTAを取り除く。iPSC通過媒体を1 mL追加します。iPSC を手動で取り外します。
  4. 600-900 μLの単一細胞懸濁液を取り、基質膜マトリックスコーティングされた6ウェルプレート(希釈:1:6〜1:10)に再板します。一晩で5%CO2を37°Cでインキュベートする。
  5. 毎日2mLの完全なE8メディアでリフレッシュしてください。iPSC培養は通常3~4日後に合流する。

4. 化学的に定義された心筋細胞分化

  1. 95%コンフルエント(3-4日)まで完全なE8メディアでヒトiPSCを培養する。
  2. 古いメディアを取り外します。6ウェルプレートの各ウェルにCM分化メディアII(RPMI1640の6 μM CHIRとB27マイナスインスリンサプリメント)を2 mL加えます。これはD0です。D1に触れないでください。
  3. D2では、CM分化培地I(RPMI1640プラスB27マイナスインスリンサプリメント)の2 mLに置き換えてください。
  4. D3では、CM分化培地IIIの2 mL(RPMI1640プラスB27マイナスインスリンサプリメントで5μM IWR-1)に交換してください。D4に触れないでください。
  5. D5 では、CM 分化メディア I の 2 mL に置き換えます。
  6. D7では、CM分化メディアIV(RPMI1640プラスB27サプリメント)の2 mLに交換してください。その後、1 日おきにメディアを更新します。
  7. D11上で細胞が収縮する場合、CM分化培地V(無グルコース)の2mLに交換する。
  8. D13 では、CM 分化メディア V の 2 mL に交換します。
  9. D15では、CM分化メディアIVの2 mLに交換してください。
  10. D17-D21 では、CM 分化メディア IV の 2 mL を 1 日おきに交換します。

5. ヒトiPSC-CMの通路

  1. DPBS の 3 mL で古い培地を取り除き、細胞を一度すすい。
  2. 6ウェルプレートの各ウェルにCM解離解液1 mL( 材料表を参照)を適用します。5-8分間、37°Cで5%CO2 でインキュベートします。
  3. iPSC-CMを、激しいピペット処理により単一細胞に機械的に解化する。
  4. 細胞を15 mL円錐形チューブに移します。CMの解離の解決を中和するためにCMの通過媒体(RMPI1640とB27の補足の10%KSR)の2 mLを加える。
  5. RTで5分間300 x g で回転します。
  6. 上清を捨てます。CM通過媒体の所望の容積を有する細胞を再中断する。基部の膜マトリックスコーティングされたプレート/皿に播種します。ヒトiPSC-CMは、通過後1〜3日で殴打を再開します。

6. ヒトiPSC-CMの拡大

  1. 6ウェルプレートのウェルごとに3 mLのDPBSでiPSC-CMを1回打つD10-12をすすいます。CM解離ソリューションを1 mL追加します(ステップ5.2)。37°Cで5%CO2 で7〜10分間インキュベートします。
  2. iPSC-CMを、激しいピペット処理により単一細胞に機械的に解化する。
  3. 細胞を15 mL円錐形チューブに移します。CMの解離の解決を中和するためにCMの通過媒体の2 mLを加える。
  4. RTで5分間300 x g で回転します。
  5. 上清を捨てます。適切な量の CM 通過媒体を持つセルを再中断します。ピペットを上下にして単一細胞懸濁液を作ります。100万個のiPSC-CMを基部の膜マトリックスコーティングされた10cm皿に種分します。
  6. 次の日は古いメディアを削除します。10 mLの心筋細胞増殖培地(メディアVI:2 μM CHIR99021)を加えます。1 日おきにメディアを変更します。
  7. iPSC-CM が 7~9 日培養後にコンフルエントになった場合は、iPSC-CM のさらなる拡張のために、継ぎ手のステップを繰り返します。

7. 免疫蛍光

  1. 免疫蛍光染色の前に、24ウェルプレートに配置された基質膜マトリックスコーティングカバーリップ(シードiPSC-CM:播種密度:0.5-1 x 106 細胞/mL)にシードします。少なくとも 4 日間は、iPSC-CM をカルチャに保持します。
  2. 1 mLのDPBSを使用して細胞を1回洗浄します。
  3. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)の0.5 mLを加え、RTで15分間インキュベートします。
  4. 1 mLのDPBSを用いて細胞を洗浄する。1 回繰り返します。
  5. 0.1%トリトンX-100の0.5 mLを加え、RTで20分間インキュベートします。
  6. 1 mL の DPBS を 2 回洗います。
  7. DPBS(ブロッキング溶液)に0.2%BSAの0.5 mLを加えます。RTで1時間インキュベートする。
  8. ブロッキング溶液で希釈した一次抗体200μLを加える(希釈:1:400-1:1000)。一晩4°Cでインキュベートします。
  9. 0.5 mLのブロッキング溶液を使用して3分間揺れで細胞を洗浄します。2 回繰り返します。
  10. ブロッキング溶液に希釈した200μLの二次抗体を添加します。RTで1時間インキュベートする。
  11. 0.5 mLのDPBSで細胞を3回リンスし、それぞれ3分間揺れ動かします。
  12. カウンターステイン核とDAPI(1:2000希釈)、RTで5分間インキュベートする。
  13. 0.5 mLのDPBSで細胞を3回リンスする。
  14. 5 μlの取り付けメディアを使用して、カバーリップ上のセルを顕微鏡スライドに取り付けます。4°Cで保管し、光から保護します。

8. フローサイトメトリーサンプル調製

  1. 3 mLのDPBSでヒトiPSC-CMを1回洗います。
  2. CM解離液1 mLを加え、37°Cで5%CO2 で7~10分間インキュベートします。
  3. 1,000 μL ピペットを使用して細胞を取り出します。ストレーナーキャップを通して丸いFACSチューブに細胞懸濁液を移す。FACSチューブは、酵素活性を中和するために1mLのiPSC-CM通過媒体(10%KSR)で予め充填されています。
  4. 300 x g で 5 分間スピンします。
  5. 細胞ペレットを乱さずに上清を除去する。250 μLの固定/透過性解析ソリューションを追加します(資料表を参照)。4°Cで20分間インキュベートします。
  6. 1 mL のペルミ/ウォッシュバッファを追加します。渦は短時間で、300 x g で4分間回転します。
  7. 上清を捨てます。1x Perm/Washバッファーに100 μLの希釈一次抗体(1:200-1:500)を加えます。渦を短時間で4°Cで一晩インキュベートする。
  8. ペルミ/ウォッシュバッファーの1 mLを加えて細胞を洗浄します。渦は短時間で、300 x g で4分間回転します。
  9. 上清を捨てます。希釈二次抗体を100 μL加えます(1:500-1:1,000)。渦は短時間、RTで1時間インキュベートする。二次抗体が光感受性蛍光と共役する場合は、光から保護します。
  10. ペルミ/洗浄バッファーの1 mLを加えて細胞を洗浄します。渦は短時間で回転し、300gで4分間回転します。
  11. 上清を捨てます。400 μL の FACS 染色バッファー (PBS/4% FBS) を持つセルを再中断します。FACS機器にロードするまで4°Cで保管してください。

9. リアルタイムの qPCR

  1. 人間のiPSC-CM文化の古いメディアを削除します。500~700 μL のライシスバッファーを細胞のリセートに加えます。RT. スケープ細胞ライセートで3分間インキュベートし、1.5 ml RNaseフリーチューブに移します。RNAの全量抽出を直ちに行うか、-80°Cで保存してください。
  2. メーカーの指示に従って、RNA抽出キットを使用して全RNAを分離します。
  3. RNA濃度を測定し、分光光度計で全RNAの品質を評価します。
  4. cDNA合成キットを用いて逆転写反応を行う。RT反応の総体積は、4 μLの反応ミックス(5x)、1 μLの逆転写酵素、1 μgの全RNAおよびRNaseフリー水を含む20 μLです。
  5. 次のプロトコルを使用してサーマルサイクラーで完全なRT反応ミックスをインキュベート: 25 °C 5分間;46°C 20分間。95°C 1分間。4 °Cで保持します。
  6. ヌクレアーゼを含まない水を用いてcDNAを1:10で希釈する。1 μLのcDNAテンプレート、プライマー/プローブ1 μL、qPCRマスターミックス10 μL、ヌクレアーゼフリー水8 μLを混合して、リアルタイムqPCR反応を設定します。
  7. リアルタイム PCR システムで実行します。サイクリングプロトコルは50°C2分(ホールド)、95°C 10分(ホールド)、95°C 15秒、60°C1分、40サイクル繰り返します。
  8. 各サンプル中の各遺伝子のCT 値を収集する。mRNAの相対的存在量は、ハウスキーピング遺伝子のCT 値から標的遺伝子のCT 値を差し引くことによって計算される。相対遺伝子発現は、2-ΔΔCT 法により解析される。

10. 全セルパッチクランプ記録

  1. 前述のようにCM解解を用いてiPSC-CMを単一細胞に解離する。
  2. 基部膜マトリックスコーティングカバーリップ上の低密度で細胞をシード。メディアIVで3〜4日間培養します。
  3. ホウケイ酸ガラスの毛細血管からピペット(抵抗0.9~1.5 MΩ)を引き出し、水平マイクロ電極プーラーを使用します。
  4. タイロード溶液中の細胞をインキュベートする(pH=7.35)。
  5. ピペットに以下の化学物質で構成される電極溶液(pH=7.3)を充填する:120 mMアスパラギン酸、 20 mM KCl、2 mM MgCl2、5mM HEPES、10 mM NaCl、5 mM EGTA、0.3 mM Na-GTP、14 mMホスホクレアチン、4 mM K-ATPおよび2mMクレアチンホスホキナーゼ。
  6. 1 Hz で 1.5-2 拡張期しきい値 5 ms 電流パルスを使用して、現在のクランプ モードにセルを配置します。
  7. マイクロ電極アンプとソフトウェア駆動型取得ボードを使用して、アクション電位(AP)を記録します。

結果

PBMCからのヒトiPSCリプログラミング
完全な血液培地を7日間用いて培養した後、PBMCsは可視核と細胞質(図1B)で大きくなり、ウイルストランスフェクションの準備ができていることを示す。センダイウイルスのリプログラミング因子によるトランスフェクションの後、PBMCはエピジェネティックなリプログラミングプロセスを1週間受?...

ディスカッション

iPSCリプログラミングの間、明確な核と細胞質で拡大されるまで1週間培養PBMCsに重要です。PBMCsは増殖しないため、iPSCのリプログラミングを成功させるためには、ウイルス導入に適切な細胞数が重要です。PBMCsの細胞数、感染の多重度(MOI)およびウイルスの価動体は、最適なトランスダクション結果に到達するために考慮され、調整されるべきである。心臓分化の場合、初期シード密度は、chiR9...

開示事項

著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。

謝辞

この研究は、米国心臓協会(AHA)キャリア開発賞18CDA34110293(M-T.Z.)、追加ベンチャーズAVIFおよびSVRF賞(M-T.Z.)、国立衛生研究所(NIH NHLBI)が1R01HL1242245、1R01HL1225220およびR010.I096(D010.6)によって支援されました。明タオ・ジャオ博士は、全国小児病院のアビゲイル・ウェクスナー研究所のスタートアップ資金にも支えられてきました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
ABI 7300 Fast Real-Time PCR SystemThermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Microelectrode AmplifierMolecular DevicesMicroelectrode Amplifier
B27 supplementThermo Fisher Scientific17504044
B27 supplement minus insulinThermo Fisher ScientificA1895601
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization KitBD Biosciences554714Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer
BD Vacutainer CPT tubeBD Biosciences362753Blood cell separation tube
CHIR99021Selleck ChemicalsS2924
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming KitThermo Fisher ScientificA16517Sendai virus reprogramming kit
Digidata 1200BAxon InstrumentsAcquisition board
Direct-zol RNA Miniprep kitZymo ResearchR2050RNA extraction kit
DMEM/F12Thermo Fisher Scientific11330057
Essential 8 mediumThermo Fisher ScientificA1517001E8 media for iPSC culture
GlutaMAX supplementThermo Fisher Scientific35050061L-glutamine alternative
Growth factor reduced MatrigelCorning356231Basement membrane matrix
iScript cDNA Snythesis KitBio-Rad1708891cDNA synthesis
IWR-1-endoSelleck ChemicalsS7086
KnockOut Serum Replacement (KSR)Thermo Fisher Scientific10828028
pCLAMP 7.0Molecular DevicesElectrophysiology data acquisition & analysis software
Recombinant human EPOThermo Fisher ScientificPHC9631
Recombinant human FLT3Thermo Fisher ScientificPHC9414
Recombinant human IL3Peprotech200-03
Recombinant human IL6Thermo Fisher ScientificPHC0065
Recombinant human SCFPeprotech300-07
RPMI 1640 mediumThermo Fisher Scientific11875093
RPMI 1640 medium, no glucoseThermo Fisher Scientific11879020
SlowFade Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificS36936Mounting media
StemPro-34 SFMThermo Fisher Scientific10639011PBMC culture media
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444964qPCR master mix
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol redThermo Fisher ScientificA1217703CM dissociation solution
UltraPure 0.5 M EDTAThermo Fisher Scientific15575020iPSC dissociation solution
Y-27632 2HClSelleck ChemicalsS1049

参考文献

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