JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

باستخدام طريقة التنظيم الذاتي ، نقوم بتطوير بروتوكول مع إضافة COCO يمكن أن يزيد بشكل كبير من توليد المستقبلات الضوئية.

Abstract

زرع خلايا الشبكية هو نهج علاجي واعد ، والذي يمكن أن يعيد بنية الشبكية ويستقر أو حتى يحسن القدرات البصرية للشبكية المتدهورة. ومع ذلك، يواجه التقدم المحرز في العلاج ببدائل الخلايا حاليا تحديات تتطلب مصدرا جاهزا لشبكية العين البشرية عالية الجودة والموحدة. لذلك ، هناك حاجة إلى بروتوكول سهل ومستقر للتجارب. هنا ، نقوم بتطوير بروتوكول محسن ، يعتمد على طريقة التنظيم الذاتي باستخدام جزيئات خارجية المنشأ والكاشف A بالإضافة إلى الاستئصال اليدوي لتوليد عضويات شبكية العين البشرية ثلاثية الأبعاد (RO). يعبر RO المشتق من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (PSCs) عن علامات محددة للمستقبلات الضوئية. مع إضافة COCO ، وهو مضاد متعدد الوظائف ، تزداد كفاءة التمايز بين سلائف المستقبلات الضوئية والمخاريط بشكل كبير. الاستخدام الفعال لهذا النظام ، الذي له فوائد خطوط الخلايا والخلايا الأولية ، وبدون مشاكل المصادر المرتبطة بالأخير ، يمكن أن ينتج خلايا شبكية متقاربة ، وخاصة المستقبلات الضوئية. وبالتالي ، فإن التمايز بين PSCs و RO يوفر منصة مثالية وذات صلة بيولوجية لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية وزرع الخلايا.

Introduction

تتميز الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSCs) بتجديدها الذاتي وقدرتها على التمايز إلى جميع أنواع الخلايا الجسدية. وهكذا ، أصبحت المواد العضوية المشتقة من PSCs موردا مهما في أبحاث الطب التجديدي. يتميز تنكس الشبكية بفقدان المستقبلات الضوئية (القضبان والمخاريط) وظهارة صبغة الشبكية. يمكن أن يكون استبدال خلايا الشبكية علاجا مشجعا لهذا المرض. ومع ذلك ، ليس من الممكن الحصول على شبكية العين البشرية لأبحاث الأمراض وعلاجها. لذلك ، فإن عضويات الشبكية (ROs) المشتقة من PSCs ، والتي تلخص بشكل فعال وناجح خلايا الشبكية الأصلية متعددة الطبقات ، مفيدة للبحوث الأساسية والانتقالية1،2،3. يركز بحثنا على تمايز RO لتوفير خلايا كافية وعالية الجودة لدراسة تنكس الشبكية4.

طرق التمييز بين ROs آخذة في الظهور باستمرار ، مع تمايز التعليق ثلاثي الأبعاد (3D) الرائد من قبل مختبر ساساي في عام 20125. قدمنا علامة CRX-tdTomato في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) لتتبع خلايا سلائف المستقبلات الضوئية على وجه التحديد وعدلنا الطريقة بإضافة COCO ، وهو مضاد متعدد الوظائف لمسارات Wnt و TGF-β و BMP6. وقد ثبت أن COCO يحسن بكفاءة كفاءة كفاءة التمايز بين سلائف المستقبلات الضوئية والمخاريط 6,7.

إجمالا ، من خلال تعديل طريقة التمايز الكلاسيكية ، قمنا بتطوير بروتوكول يمكن الوصول إليه لحصاد سلائف المستقبلات الضوئية والمخاريط الوفيرة من ROs البشرية لتحليل مرض الشبكية المرتبط بالمستقبلات الضوئية من خلال التحقيقات المختبرية ولمزيد من التطبيق السريري / الزرع.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية لمستشفى بكين تونغرين ، جامعة كابيتال الطبية. تم الحصول على H9 hESCs من معهد أبحاث WiCell وتمت هندستها وراثيا إلى خط الخلايا الموسوم بالطماطم.

1. توليد ROs البشرية

  1. قم بزراعة hESCs في ظل ظروف خالية من التغذية.
    1. قم بتغطية بئر واحد من صفيحة من 6 آبار ب 1 مل من كاشف 0.1 مجم / مل A (جدول المواد) عند 37 درجة مئوية لمدة نصف ساعة على الأقل باتباع تعليمات الشركة المصنعة. إذابة أليكوت من 1x106 hESCs.
      ملاحظة: تحضير 3 مل من الكاشف B المسخن مسبقا (جدول المواد) ونقل الخلايا المحفوظة بالتجميد (1 مل) إلى 3 مل من الوسط الطازج. لا تقم بماصة hESCs إلى خلايا مفردة.
    2. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق وإزالة السوبرناتانت.
    3. زرع الخلايا في لوحة الكاشف A المغلفة مع 2 مل من الكاشف B وتغيير 2 مل من الكاشف B يوميا. خلايا المرور عند الوصول إلى ما يقرب من 80٪ من الالتقاء (عادة حوالي 4 أيام).
  2. اليوم 0
    1. فصل hESCs إلى تعليق أحادي الخلية باستخدام الوسط I (الجدول 1). قم بإعداد الوسط I عن طريق خلط ما يلي: 20٪ (v / v) استبدال مصل KnockOut (KSR) ، محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM 0.1 mM (NEAA) ، 1 mM pyruvate ، 3 μM IWR-1-endo (IWR1e) ، 30 نانوغرام / مل COCO ، 100 U / mL البنسلين ، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين (PS) ، 0.1 mM β-mercaptoethanol ، والمتوسط الأساسي الأدنى في غلاسكو النسر (GMEM).
      ملاحظة: قبل بدء التفكك ، قم بإعداد الوسط I ونقل 12 مل من الوسط I مع 20 ميكرومتر Y-27632 إلى طبق بتري 10 سم ، و 500 ميكرولتر من الكاشف C (جدول المواد) يحتوي على 0.05 مجم / مل من الكاشف D (جدول المواد) و 20 ميكرومتر Y-27632 في أنبوب 1.5 مل. نفذ الخطوات المذكورة أعلاه في الظلام ، حيث أن المكون IWR1e في الوسط I حساس للضوء.
    2. اغسل hESCs باستخدام المخزن الملحي المخزن الملحي المخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco الذي تم تسخينه مسبقا 1x.
    3. أضف الكاشف المحضر 500 ميكرولتر (في أنبوب 1.5 مل) واحتضن hESCs لمدة 3.5 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    4. افصل الخلايا عن طريق تحريك جانب وأسفل اللوحة لبضع ثوان وأضف 500 ميكرولتر من الوسط المحضر I من طبق بتري إلى طبق hESC.
      ملاحظة: قم بإعداد أنبوب 1.5 مل مع 900 ميكرولتر من 1x DPBS واستخدم مقياس مرقئ الدم لعد الخلايا.
    5. حصاد الخلايا في أنبوب جديد 1.5 مل وماصة تعليق الخلية لأعلى ولأسفل ثم أخرج 100 ميكرولتر من الأنبوب ثم أضف إلى الأنبوب مع 900 ميكرولتر من DPBS لعد الخلايا.
    6. قم بتفريق تعليق الخلايا الأيسر 900 ميكرولتر ثم قم بتخفيف الخلايا ذات الوسط المحضر I في طبق بتري إلى 9 × 104 خلايا / مل.
      ملاحظة: الحجم الكامل للوسط هو 12 مل. هناك حاجة إلى 1.08 × 106 خلايا في المجموع.
    7. أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا إلى كل بئر من صفيحة غير ملتصقة ، ذات قاع V ، 96 بئرا (جدول المواد).
      ملاحظة: استخدم ماصة متعددة القنوات لتقصير الوقت والتأكد من أن كل بئر يحتوي على رقم خلية مكافئ. رج طبق بتري في كل مرة قبل إزالة أجزاء 100 ميكرولتر. من المهم أن يتم توزيع الخلايا بشكل موحد.
    8. قم بتدوير اللوحة ذات ال 96 بئرا برفق في شاكر منخفض السرعة لمدة 5 دقائق ثم احتضنها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
      ملاحظة: احتفظ بالطبق في الظلام. تعيين اليوم كيوم 0.
  3. اليوم 2
    1. أضف 1٪ كاشف A (جدول المواد). تحضير الكاشف A (تركيز البروتين 10 ملغ / مل) عن طريق إضافة 133.4 ميكرولتر من الكاشف A إلى 2 مل من الوسط I.
      ملاحظة: حافظ على الكاشف A عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها قبل الاستخدام لتحقيق ذوبان كامل وموحد. يرجى ملاحظة معلومات المنتج والبحث في رقم الكتالوج ورقم اللوت في الموقع الرسمي للشركة للحصول على تركيز البروتين من الكاشف A حيث أن كل زجاجة من الكاشف A بتركيز بروتين مختلف. إذا كان تركيز البروتين منخفضا ، فسيكون من المفيد زيادة حجم الكاشف A.
    2. أضف 20 ميكرولتر من الكاشف المحضر A إلى كل بئر وماصة مرتين في الوسط لتشتيت الخلايا الميتة.
      ملاحظة: حافظ على الكاشف A ولوحة البئر 96 في ظل ظروف باردة وأكمل جميع الخطوات على الجليد. ضع اللوحة في الظلام.
  4. اليوم 2-12
    1. نظف الجزء السفلي من اللوحة المكونة من 96 بئرا واحتضنها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 حتى اليوم 6. في اليوم 6 ، قم بتغيير نصف الوسط عن طريق إزالة 58 ميكرولتر من الوسط من كل بئر وإضافة 60 ميكرولتر من الوسط I.
      ملاحظة: استخدم ماصة متعددة القنوات لإكمال التغيير نصف المتوسط. قم بإجراء هذه الخطوة بلطف لضمان عدم إزالة كريات الخلايا من البئر. استخرج الوسط في طبق بتري نظيف بحجم 10 سم. إذا كانت هناك كريات خلوية في الداخل ، فأضفها مرة أخرى إلى لوحة 96 بئرا.
  5. اليوم 12-18
    1. تغيير المتوسط إلى المتوسط II (الجدول 1) في اليوم 12. تحضير المتوسط الثاني باستخدام كاشف 1٪ (v / v) A عن طريق خلط ما يلي: 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) ، 0.1 mM NEAA ، 1 mM pyruvate ، 100 U / mL البنسلين ، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين ، 0.1 mM β-mercaptoethanol ، 100 نانومتر SAG ثنائي هيدروكلوريد و GMEM. تخزينها في ظروف باردة ومظلمة.
    2. قم بحصاد كريات الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 مل من الصفيحة المكونة من 96 بئرا واسمح للكريات بالاستقرار بشكل طبيعي لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: قم بإزالة الوسط والكريات بلطف تحت السطح لتجنب الفقاعات.
    3. قم بإزالة السوبرناتانت أثناء العناية بالمواد العضوية. انقل مجاميع الخلايا إلى طبق معلق 10 سم يحتوي على 18 مل من الوسط المحضر II مع الكاشف A.
      ملاحظة: لا تقم بإضافة الوسط المحضر II إلى الطبق الذي يبلغ طوله 10 سم مقدما ، حيث يجب أن يكون الكاشف A عند 4 درجات مئوية.
    4. احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 حتى اليوم 18.
  6. من اليوم 18 فصاعدا
    1. تغيير الوسط إلى المتوسط الثالث (الجدول 1). تحضير الوسط الثالث تحت الظروف المظلمة عن طريق خلط ما يلي: 10٪ FBS ، 1xsupplement 1 ، 0.5 μM حمض الريتينويك (RA) ، 100 ميكرومتر توراين ، 100 U / مل البنسلين ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين و 1: 1 خليط من وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) / خليط المغذيات F-12.
    2. في اليوم 18 ، عندما يتم إنشاء حويصلة بصرية شبه شفافة ، قم بقطع المواد العضوية باستخدام سكين الجراحة المجهرية.
      ملاحظة: شق العضوي، عادة إلى أربع قطع، في طبق بتري مع متوسط II. يجب أن تنمو كل قطعة لتصبح كوبا بصريا سليما في الأسابيع التالية.
    3. قم بتجميع جميع الكريات في وسط الطبق. حصاد الخلايا في أنبوب الصقر المخروطي 15 مل والسماح بالاستقرار الطبيعي. ثم قم بإزالة السوبرناتانت بلطف.
      ملاحظة: نظرا لأحجامها ، يمكن تجميع المواد العضوية في الوسط عن طريق تدوير طبق بتري في اتجاه واحد لمدة 90 درجة على مستوى أفقي عدة مرات.
    4. قم بتعليق الكريات وتفريقها في طبقين بتري بحجم 10 سم ، مع 18 مل من المتوسط الثالث لكل طبق ، وانقل الأطباق بلطف إلى الحاضنة لتجنب تراكم الخلايا. استمر في الزراعة في الوسط الثالث عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 وقم بتغيير الوسط أسبوعيا. تم التعبير عن CRX بعد اليوم 45 وحتى اليوم 120 ، يمكننا اكتشاف الجزء الخارجي من المستقبلات الضوئية.

2. تحليل ROs البشرية

  1. تحليل نظام مراقبة الأصول الأجنبية (FACS)
    1. قم بتجميع ثلاثة CRX-tdTomato وثلاثة عضويات مشتقة من H9 ES من الأطباق باستخدام نصائح 1 مل المقطوعة. اغسل المواد العضوية ب 1 مل من DPBS المسخن مسبقا (درجة حرارة الغرفة).
    2. تحضير المخزن المؤقت للهضم عن طريق خلط 0.25٪ من محلول التربسين-EDTA مع 0.05 ملغ / مل من الكاشف D.
    3. قم بفصل المواد العضوية إلى خلايا مفردة باستخدام مخزن الهضم المخزن المؤقت المحضر لمدة 8 دقائق عند 37 درجة مئوية. ثم أضف نفس الحجم من DPBS مع 10٪ FBS و 0.05 mg / mL من الكاشف D لتعطيل التفاعل.
    4. قم بتعليق الخلايا وتشتيتها برفق ثم قم بالتصفية باستخدام مصفاة خلية 100 ميكرومتر واستخدم نظام فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) عند خط ليزر الإثارة 561 نانومتر ومرشح 780/60 لتحليل الإشارات الإيجابية CRX-tdTomato.
      ملاحظة: يعبر CRX في البداية في اليوم 45 ويزداد مع نضوج المواد العضوية. يتم استخدام عشرة آلاف خلية لكل اختبار ، لكل نقطة زمنية ، يتم إكمال ثلاثة تكرارات على الأقل.
  2. تحديد كمية كثافة التألق ل ROs
    1. إعداد المواد العضوية القابلة للحياة بشكل عشوائي للتصوير.
      ملاحظة: قم بتعيين المعلمات واستخدم نفس الفلاتر والمعلمات لجميع أجهزة مراقبة كثافة التألق.
    2. التقط الصور وقم بتحليل متوسط كثافة التألق باستخدام برنامج مناسب (على سبيل المثال ، ImageJ).
    3. استيراد الصور ثم تحويلها إلى 8 بت باستخدام صورة | النوع.
    4. اضبط العتبة باستخدام المعلمات الافتراضية بواسطة Image | ضبط | العتبة.
    5. تحديد المساحة المقاسة ثم تقييم القيمة الرمادية باستخدام تحليل | القياس.
      ملاحظة: القيم المتوسطة في لوحة النتائج هي متوسط كثافة التألق للمنطقة المقاسة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويصور الرسم التوضيحي التخطيطي بروتوكول التمايز لتحسين خلايا السلائف باستخدام كوكو (الشكل 1). من PSC إلى ROs ، يمكن أن تتسبب العديد من التفاصيل في اختلافات في النتائج. يوصى بتسجيل كل خطوة وحتى رقم الكتالوج ورقم اللوت لكل وسيط لتتبع الإجراء بأكمله.

هنا ، نقدم صورا ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

التمايز العضوي للشبكية هو طريقة مرغوب فيها لتوليد خلايا شبكية وظيفية وافرة. RO هو مركب من خلايا شبكية العين المختلفة ، مثل الخلايا العقدية ، والخلايا ثنائية القطب ، والمستقبلات الضوئية ، التي تولدها الخلايا الجذعية متعددة القدرات نحو شبكية العين العصبية4،5،

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

نشكر أعضاء مختبر 502 على دعمهم الفني وتعليقاتهم المفيدة فيما يتعلق بالمخطوطة. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية لبلدية بكين (Z200014) والبرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2017YFA0105300).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanolLife Technologies21985-023
COCOR&D Systems3047-CC-050DAN Domain family of BMP antagonists
DMEM/F-12Gibco10565-042
DMSOSigmaD2650
DPBSGibcoC141905005BT
EDTAThermo15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem CellsBiological Industry04-002-1A
GMEMGibco11710-035
KnockOut Serum Replacement-Multi-SpeciesGibcoA3181502
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)sigmaM7145
Pen StrepGibco15140-122
Primesurface 96 V-plateSbioMS9096SZCell aggregation in 1.2.7
PyruvateSigmaS8636
Reagent ABD356231Matrigel in 1.1.1
Reagent BStemCell5990mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2
Reagent CGibco12563-011TrypLE Express in 1.2
Reagent DRoche11284932001DNase I , in 1.2
Retinoic acidSigmaR2625-100MG
SAGEnzo Life ScienceALX-270-426-M001
Supplement 1Life Technologies17502-048N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III
TaurineSigmaT-8691-25G
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200056organoids dissociation in 2.1.3
Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - CalbiochemSigma681669Wnt inhibitor
Y-27632 2HClSelleckS1049

References

  1. Xie, H., et al. Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids. Science Advances. 6 (6), 5247(2020).
  2. Lu, Y. F., et al. Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development. Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).
  3. Cowan, C. S., et al. Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  4. Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
  5. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  6. Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366(2020).
  7. Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
  8. Deng, W. L., et al. Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
  9. Gao, M. L., et al. Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128(2020).
  10. Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. The road to restore vision with photoreceptor regeneration. Experimental Eye Research. 202, 108283(2020).
  11. Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).
  12. Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communications. 6, 6286(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

170

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved