Induzione diretta di organoidi retinici da cellule staminali pluripotenti umane

Riepilogo

Utilizzando un metodo auto-organizzante, sviluppiamo un protocollo con l'aggiunta di COCO che potrebbe aumentare significativamente la generazione di fotorecettori.

Abstract

Il trapianto di cellule retiniche è un approccio terapeutico promettente, che potrebbe ripristinare l'architettura retinica e stabilizzare o addirittura migliorare le capacità visive della retina degenerata. Tuttavia, i progressi nella terapia di sostituzione cellulare devono attualmente affrontare le sfide di richiedere una fonte pronta all'uso di retine umane standardizzate e di alta qualità. Pertanto, è necessario un protocollo facile e stabile per gli esperimenti. Qui, sviluppiamo un protocollo ottimizzato, basato su un metodo auto-organizzante con l'uso di molecole esogene e reagente A e l'escissione manuale per generare gli organoidi tridimensionali della retina umana (RO). La RO derivata dalle cellule staminali pluripotenti umane (PSC) esprime marcatori specifici per i fotorecettori. Con l'aggiunta di COCO, un antagonista multifunzionale, l'efficienza di differenziazione dei precursori e dei coni dei fotorecettori è significativamente aumentata. L'uso efficiente di questo sistema, che ha i vantaggi delle linee cellulari e delle cellule primarie, e senza i problemi di approvvigionamento associati a queste ultime, potrebbe produrre cellule retiniche confluenti, in particolare fotorecettori. Pertanto, la differenziazione delle PSC in RO fornisce una piattaforma ottimale e biorilevante per la modellizzazione della malattia, lo screening farmacologico e il trapianto di cellule.

Introduzione

Le cellule staminali pluripotenti (PSC) sono caratterizzate dal loro auto-rinnovamento e dalla capacità di differenziarsi in tutti i tipi di cellule somatiche. Pertanto, gli organoidi derivati dalle PSC sono diventati una risorsa importante nella ricerca sulla medicina rigenerativa. La degenerazione retinica è caratterizzata dalla perdita di fotorecettori (coni e bastoncelli) e dall'epitelio pigmentato retinico. La sostituzione delle cellule retiniche potrebbe essere un trattamento incoraggiante per questa malattia. Tuttavia, non è possibile ottenere retine umane per la ricerca e la terapia della malattia. Pertanto, gli organoidi retinici (RO) derivati dalle PSC, che ricapitolano efficacemente e con successo le cellule retiniche native multistrato, sono utili per la ricerca di base e traslazionale ^1,2,3. La nostra ricerca si concentra sulla differenziazione RO per fornire cellule sufficienti e di qualità per studiare la degenerazione retinica⁴.

I metodi per differenziare i RO stanno emergendo continuamente, con la differenziazione tridimensionale (3D) delle sospensioni sperimentata dal laboratorio Sasai nel 2012⁵. Abbiamo introdotto il tag CRX-tdTomato nelle cellule staminali embrionali umane (hESC) per tracciare specificamente le cellule precursori dei fotorecettori e modificato il metodo con l'aggiunta di COCO, un antagonista multifunzionale dei percorsi Wnt, TGF-β e BMP⁶. COCO ha dimostrato di migliorare efficacemente l'efficienza di differenziazione dei precursori e dei coni dei fotorecettori ^6,7.

Complessivamente, modificando il metodo di differenziazione classico, abbiamo sviluppato un protocollo accessibile per raccogliere abbondanti precursori e coni di fotorecettori da RO umane per analizzare la malattia retinica associata ai fotorecettori attraverso indagini di laboratorio e per ulteriori applicazioni cliniche / trapianti.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal Comitato etico istituzionale del Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. Le hESC H9 sono state ottenute dal WiCell Research Institute e geneticamente modificate su linea cellulare tdTomato-tagged.

1. Generazione di RO umane

1. Coltura degli hESC in condizioni prive di alimentatore.
   1. Rivestire un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con 1 mL di reagente A da 0,1 mg/mL (Tabella dei materiali) a 37 °C per almeno mezz'ora seguendo le istruzioni del fabbricante. Scongelare un'aliquota di 1x10⁶ hESC.
      NOTA: Preparare 3 ml di reagente B preriscaldato (Tabella dei materiali) e trasferire le cellule crioconservate (1 ml) in 3 ml di terreno fresco. Non pipettare le hESC su singole celle.
   2. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
   3. Seminare le cellule nella piastra rivestita di reagente A con 2 ml di reagente B e cambiare 2 ml di reagente B al giorno. Cellule di passaggio quando raggiungono circa l'80% di confluenza (di solito circa 4 giorni).
2. Giorno 0
   1. Dissociare le hESC in una sospensione unicellulare utilizzando il mezzo I (Tabella 1). Preparare il mezzo I miscelando quanto segue: 20% (v/v) di sostituzione del siero KnockOut (KSR), 0,1 mM di soluzione di aminoacidi non essenziali MEM (NEAA), 1 mM di piruvato, 3 μM IWR-1-endo (IWR1e), 30 ng/mL di COCO, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina (PS), 0,1 mM di β-mercaptoetanolo e il mezzo essenziale minimo (GMEM) di Glasgow's Eagle.
      NOTA: Prima dell'inizio della dissociazione, preparare il mezzo I e trasferire 12 ml di terreno I con 20 μM Y-27632 in una capsula di Petri da 10 cm, 500 μL di reagente C (Tabella dei materiali) contenente 0,05 mg/ml di reagente D (Tabella dei materiali) e 20 μM di Y-27632 in una provetta da 1,5 ml. Eseguire i passaggi precedenti al buio, poiché il componente IWR1e in medium I è sensibile alla luce.
   2. Lavare le hESC con tampone salino tampone fosfato (DPBS) 1x Dulbecco preriscaldato.
   3. Aggiungere il reagente preparato da 500 μL (nella provetta da 1,5 ml) e incubare gli hESC per 3,5 minuti a 37 °C e al 5% di CO₂.
   4. Staccare le cellule facendo scorrere il lato e il fondo della piastra per alcuni secondi e aggiungere 500 μL di mezzo preparato I dalla piastra di Petri nella piastra hESC.
      NOTA: Preparare un tubo da 1,5 mL con 900 μL di 1x DPBS e utilizzare un emocitometro per il conteggio delle cellule.
   5. Raccogliere le cellule in un nuovo tubo da 1,5 ml e pipettare la sospensione cellulare su e giù, quindi estrarre 100 μL dal tubo e quindi aggiungere nel tubo con 900 μL di DPBS per il conteggio delle cellule.
   6. Disperdere la sospensione cellulare sinistra da 900 μL e quindi diluire le cellule con il mezzo preparato I nella capsula di Petri a 9 x 10⁴ cellule/ml.
      NOTA: L'intero volume del mezzo è di 12 ml; 1,08 x 10⁶ celle sono necessarie in totale.
   7. Aggiungere 100 μL di sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra non aderente, con fondo a V, a 96 pozzetti (tabella dei materiali).
      NOTA: utilizzare una pipetta multicanale per ridurre il tempo e assicurarsi che ogni pozzetto contenga un numero di cella equivalente. Agitare la capsula di Petri ogni volta prima di rimuovere porzioni da 100 μL. È importante che le cellule siano distribuite uniformemente.
   8. Ruotare leggermente la piastra a 96 pozzetti in uno shaker a bassa velocità per 5 minuti e quindi incubare a 37 °C e 5% di CO₂.
      NOTA: Tenere la piastra al buio. Imposta il giorno come giorno 0.
3. Giorno 2
   1. Aggiungere l'1% di reagente A (tabella dei materiali). Preparare il reagente A (concentrazione proteica di 10 mg/ml) aggiungendo 133,4 μL di reagente A in 2 mL di mezzo I.
      NOTA: Mantenere il reagente A a 4 °C durante la notte prima dell'uso per ottenere una fusione completa e uniforme. Si prega di notare le informazioni sul prodotto e cercare il numero di catalogo e il numero di lotto nel sito ufficiale dell'azienda per avere la concentrazione proteica del reagente A poiché ogni flacone di reagente A è a una diversa concentrazione proteica. Se la concentrazione proteica è bassa, sarebbe utile un aumento del volume del reagente A.
   2. Aggiungere 20 μL di reagente A preparato a ciascun pozzetto e pipettare due volte al centro per disperdere le cellule morte.
      NOTA: Mantenere il reagente A e la piastra a 96 pozzetti in condizioni fresche e completare tutti i passaggi sul ghiaccio. Posizionare il piatto al buio.
4. Giorno 2-12
   1. Pulire il fondo della piastra a 96 pozzetti e incubare a 37 °C e 5% CO₂ fino al giorno 6. Al giorno 6, cambiare metà del terreno rimuovendo 58 μL del mezzo da ciascun pozzetto e aggiungendo 60 μL di mezzo I.
      NOTA: utilizzare una pipetta multicanale per completare la sostituzione del mezzo mezzo. Eseguire questo passaggio delicatamente per assicurarsi che nessun pellet cellulare venga rimosso dal pozzo. Aspirare il mezzo in una capsula di Petri pulita da 10 cm. Se ci sono pellet di celle all'interno, aggiungili nuovamente alla piastra a 96 pozzetti.
5. Giorno 12- 18
   1. Cambiare il medio in medio II (Tabella 1) al giorno 12. Preparare il mezzo II utilizzando il reagente A all'1% (v/v) miscelando quanto segue: siero bovino fetale al 10% (FBS), 0,1 mM NEAA, 1 mM piruvato, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina, 0,1 mM di β-mercaptoetanolo, 100 nM SAG dicloridrato e GMEM. Conservalo in condizioni fresche e buie.
   2. Raccogliere i pellet cellulari in un tubo conico da 15 ml dalla piastra a 96 pozzetti e lasciare che i pellet si depositino naturalmente per 5 minuti a temperatura ambiente.
      NOTA: Rimuovere delicatamente il mezzo e il pellet sotto la superficie per evitare bolle.
   3. Rimuovere il surnatante mentre ci si prende cura degli organoidi. Trasferire gli aggregati cellulari in un piatto di sospensione di 10 cm contenente 18 mL di mezzo preparato II con reagente A.
      NOTA: Non aggiungere il mezzo preparato II nella capsula da 10 cm in anticipo, poiché il reagente A deve essere a 4 °C.
   4. Incubare a 37 °C e 5% CO₂ fino al giorno 18.
6. Dal giorno 18 in poi
   1. Modificare il mezzo in medio III (tabella 1). Preparare il mezzo III in condizioni di oscurità mescolando quanto segue: 10% FBS, 1xsupplement 1, 0,5 μM di acido retinoico (RA), 100 μM di taurina, 100 U / mL di penicillina, 100 μg / mL di streptomicina e 1: 1 miscela di terreno di aquila modificata (DMEM) / miscela di nutrienti F-12 di Dulbecco.
   2. Il giorno 18, quando viene generata una vescicola ottica semitrasparente, tagliare gli organoidi usando un coltello microchirurgico.
      NOTA: Tagliare l'organoide, di solito in quattro pezzi, in una capsula di Petri con mezzo II. Ogni pezzo dovrebbe crescere in una tazza ottica intatta nelle settimane successive.
   3. Aggregare tutti i pellet al centro del piatto. Raccogliere le cellule in un tubo conico da 15 ml e consentire un decantamento naturale. Quindi rimuovere delicatamente il surnatante.
      NOTA: A causa delle loro dimensioni, gli organoidi possono essere aggregati al centro ruotando la capsula di Petri in una direzione per 90° su un piano orizzontale alcune volte.
   4. Sospendere e disperdere i pellet in due piastre di Petri da 10 cm, con 18 ml di mezzo III per piatto, e trasferire delicatamente i piatti nell'incubatore per evitare l'aggregazione cellulare. Continuare la coltura in mezzo III a 37 °C e 5% di CO₂ e cambiare il terreno settimanalmente. Il CRX espresso dopo il giorno 45 e fino al giorno 120, abbiamo potuto rilevare il segmento esterno del fotorecettore.

2. Analisi delle RO umane

1. Analisi FACS
   1. Assemblare tre organoidi CRX-tdTomato e tre organoidi derivati da H9 ES dai piatti utilizzando le punte tagliate da 1 ml. Lavare gli organoidi con 1 mL di DPBS preriscaldato (temperatura ambiente).
   2. Preparare il tampone di digestione mescolando la soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% con 0,05 mg/ml di reagente D.
   3. Dissociare gli organoidi in singole cellule utilizzando il tampone di digestione preparato per 8 minuti a 37 °C. Quindi aggiungere lo stesso volume di DPBS con FBS al 10% e 0,05 mg / ml di reagente D per inattivare la reazione.
   4. Sospendete e disperdere leggermente le cellule e quindi filtrate utilizzando un filtro cellulare da 100 μm e utilizzare un sistema di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) a linea laser di eccitazione a 561 nm e filtro 780/60 per analizzare i segnali positivi CRX-tdTomato.
      NOTA: CRX si esprime inizialmente al giorno 45 e aumenta con la maturazione degli organoidi. Diecimila celle vengono utilizzate per ogni test, per ogni timepoint, vengono completate almeno tre ripetizioni.
2. Quantificazione dell'intensità di fluorescenza dei RO
   1. Preparare gli organoidi vitali in modo casuale per l'imaging.
      NOTA: Impostare i parametri e utilizzare gli stessi filtri e parametri per tutti i monitor di intensità di fluorescenza.
   2. Cattura immagini e analizza l'intensità media della fluorescenza utilizzando un software adatto (ad esempio, ImageJ).
   3. Importare le immagini e quindi convertirle a 8 bit utilizzando Image | Tipo.
   4. Regolare la soglia utilizzando i parametri predefiniti per | immagine Regolare | Soglia.
   5. Determinare l'area misurata e quindi valutare il valore di grigio utilizzando Analizza | Misura.
      NOTA: I valori medi nel pannello dei risultati sono l'intensità media di fluorescenza dell'area misurata.

Risultati

L'illustrazione schematica illustra il protocollo di differenziazione per migliorare le cellule precursori con COCO (Figura 1). Da PSC a RO, numerosi dettagli potrebbero causare variazioni di risultato. Si consiglia di registrare ogni fase e anche il numero di catalogo e il numero di lotto di ogni mezzo per tracciare l'intera procedura.

Qui, forniamo immagini in campo chiaro per i giorni 6, 12, 18 e 45 (Figura 2). Il giorno 6, gli org...

Discussione

La differenziazione organoide retinica è un metodo auspicabile per la generazione di ampie cellule retiniche funzionali. Il RO è un composto di diverse cellule retiniche, come cellule ganglionari, cellule bipolari e fotorecettori, generate da cellule staminali pluripotenti verso la retina neurale 4,5,8,9. Sebbene i RO confluenti possano essere raccolti, richiede molto tempo, il che può richi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
COCO	R&D Systems	3047-CC-050	DAN Domain family of BMP antagonists
DMEM/F-12	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells	Biological Industry	04-002-1A
GMEM	Gibco	11710-035
KnockOut Serum Replacement-Multi-Species	Gibco	A3181502
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)	sigma	M7145
Pen Strep	Gibco	15140-122
Primesurface 96 V-plate	Sbio	MS9096SZ	Cell aggregation in 1.2.7
Pyruvate	Sigma	S8636
Reagent A	BD	356231	Matrigel in 1.1.1
Reagent B	StemCell	5990	mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2
Reagent C	Gibco	12563-011	TrypLE Express in 1.2
Reagent D	Roche	11284932001	DNase I , in 1.2
Retinoic acid	Sigma	R2625-100MG
SAG	Enzo Life Science	ALX-270-426-M001
Supplement 1	Life Technologies	17502-048	N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III
Taurine	Sigma	T-8691-25G
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056	organoids dissociation in 2.1.3
Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem	Sigma	681669	Wnt inhibitor
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049