Inducción dirigida de organoides retinianos a partir de células madre pluripotentes humanas

Resumen

Utilizando un método de autoorganización, desarrollamos un protocolo con la adición de COCO que podría aumentar significativamente la generación de fotorreceptores.

Resumen

El trasplante de células de la retina es un enfoque terapéutico prometedor, que podría restaurar la arquitectura de la retina y estabilizar o incluso mejorar las capacidades visuales de la retina degenerada. Sin embargo, el progreso en la terapia de reemplazo celular actualmente enfrenta los desafíos de requerir una fuente estándar de retinas humanas estandarizadas y de alta calidad. Por lo tanto, se necesita un protocolo fácil y estable para los experimentos. Aquí, desarrollamos un protocolo optimizado, basado en un método de autoorganización con el uso de moléculas exógenas y reactivo A, así como la escisión manual para generar los organoides tridimensionales de la retina humana (RO). La RO derivada de células madre pluripotentes humanas (PSC) expresa marcadores específicos para los fotorreceptores. Con la adición de COCO, un antagonista multifuncional, la eficiencia de diferenciación de los precursores y conos de fotorreceptores aumenta significativamente. El uso eficiente de este sistema, que tiene los beneficios de las líneas celulares y las células primarias, y sin los problemas de abastecimiento asociados con estas últimas, podría producir células retinianas confluentes, especialmente fotorreceptores. Por lo tanto, la diferenciación de PSC a RO proporciona una plataforma óptima y biorelevante para el modelado de enfermedades, la detección de fármacos y el trasplante celular.

Introducción

Las células madre pluripotentes (PSC) se caracterizan por su auto-renovación y capacidad para diferenciarse en todo tipo de células somáticas. Por lo tanto, los organoides derivados de PSC se han convertido en un recurso importante en la investigación de la medicina regenerativa. La degeneración retiniana se caracteriza por la pérdida de fotorreceptores (bastones y conos) y epitelio pigmentario de la retina. El reemplazo de células retinianas podría ser un tratamiento alentador para esta enfermedad. Sin embargo, no es factible obtener retinas humanas para la investigación y terapia de enfermedades. Por lo tanto, los organoides retinianos (RO) derivados de PSCs, que recapitulan de manera efectiva y exitosa las células retinianas nativas de múltiples capas, son beneficiosos para la investigación básica y traslacional ^1,2,3. Nuestra investigación se centra en la diferenciación de RO para proporcionar células suficientes y de calidad para estudiar la degeneración retiniana⁴.

Los métodos para diferenciar las RO están surgiendo continuamente, con la diferenciación de suspensión tridimensional (3D) iniciada por el laboratorio Sasai en 2012⁵. Introdujimos la etiqueta CRX-tdTomato en las células madre embrionarias humanas (hESCs) para rastrear específicamente las células precursoras de fotorreceptores y modificamos el método con la adición de COCO, un antagonista multifuncional de las vías Wnt, TGF-β y BMP⁶. Se ha demostrado que el COCO mejora eficientemente la eficiencia de diferenciación de los precursores y conos de los fotorreceptores ^6,7.

En conjunto, al modificar el método clásico de diferenciación, hemos desarrollado un protocolo accesible para recolectar abundantes precursores y conos de fotorreceptores de RO humanos para analizar la enfermedad retiniana asociada con los fotorreceptores a través de investigaciones de laboratorio y para su posterior aplicación clínica / trasplante.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética institucional del Hospital Tongren de Beijing, Universidad Médica Capital. Las hESCs H9 se obtuvieron del Instituto de Investigación WiCell y se modificaron genéticamente para la línea celular marcada con tdTomato.

1. Generación de ROs humanas

1. Cultive los hESCs en condiciones libres de alimentador.
   1. Cubra un pocillo de una placa de 6 pocillos con 1 ml de 0,1 mg/ml de reactivo A (tabla de materiales) a 37 °C durante al menos media hora siguiendo las instrucciones del fabricante. Descongelar una alícuota de 1x10⁶ hESCs.
      NOTA: Prepare 3 ml de reactivo B precalentado (Tabla de materiales) y transfiera las células criopreservadas (1 ml) a 3 ml de medio fresco. No canalice las hESCs a células individuales.
   2. Centrifugar a 200 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante.
   3. Sembrar las células en la placa recubierta con reactivo A con 2 ml de reactivo B y cambiar 2 ml de reactivo B diariamente. Células de paso al alcanzar aproximadamente el 80% de confluencia (generalmente alrededor de 4 días).
2. Día 0
   1. Disociar las hESCs a una suspensión unicelular utilizando el medio I (Tabla 1). Prepare el medio I mezclando lo siguiente: reemplazo sérico KnockOut (KSR) al 20% (v/v), solución de aminoácidos no esenciales MEM de 0,1 mM (NEAA), piruvato de 1 mM, IWR-1-endo (IWR1e) de 3 μM, COCO de 30 ng/ml, penicilina de 100 U/ml, estreptomicina (PS) de 100 μg/ml, β-mercaptoetanol de 0,1 mM y medio esencial mínimo de Eagle (GMEM) de Glasgow.
      NOTA: Antes del inicio de la disociación, preparar el medio I y transferir 12 mL de medio I con 20 μM Y-27632 a una placa de Petri de 10 cm, 500 μL de reactivo C (Tabla de materiales) que contenga 0,05 mg/ml de reactivo D (Tabla de materiales) y 20 μM Y-27632 en un tubo de 1,5 ml. Realice los pasos anteriores en la oscuridad, ya que el componente IWR1e en el medio I es sensible a la luz.
   2. Lave las hESCs con 1x tampón salino tamponado con fosfato (DPBS) precalentado de Dulbecco.
   3. Añadir el tubo de reactivo preparado de 500 μL (en 1,5 ml) e incubar las hESCs durante 3,5 min a 37 °C y 5% de_CO2.
   4. Separe las células moviendo el lado y el fondo de la placa durante unos segundos y agregue 500 μL de medio preparado I de la placa de Petri a la placa hESC.
      NOTA: Prepare un tubo de 1.5 ml con 900 μL de 1x DPBS y use un hemocitómetro para el recuento celular.
   5. Recolecte las células en un nuevo tubo de 1,5 ml y pipete la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo y luego saque 100 μL del tubo y luego agréguelos al tubo con 900 μL de DPBS para el recuento celular.
   6. Dispersar la suspensión de células izquierda de 900 μL y luego diluir las células con medio preparado I en la placa de Petri a 9 x 10⁴ células/ml.
      NOTA: El volumen total del medio es de 12 mL; 1.08 x 10 Se necesitan⁶ celdas en total.
   7. Agregue 100 μL de suspensión celular a cada pocillo de una placa de 96 pocillos no adherente, con fondo en V (Tabla de materiales).
      NOTA: Utilice una pipeta multicanal para acortar el tiempo y asegurarse de que cada pocillo contiene un número de celda equivalente. Agite la placa de Petri cada vez antes de retirar las porciones de 100 μL. Es importante que las células estén distribuidas uniformemente.
   8. Girar ligeramente la placa de 96 pocillos en un agitador de baja velocidad durante 5 minutos y luego incubar a 37 °C y 5% de_CO2.
      NOTA: Mantenga el plato en oscuridad. Establezca el día como día 0.
3. Día 2
   1. Agregue un 1% de reactivo A (Tabla de materiales). Preparar el reactivo A (concentración de proteína de 10 mg/ml) añadiendo 133,4 μL de reactivo A en 2 ml de medio I.
      NOTA: Mantener el reactivo A a 4 °C durante la noche antes de usarlo para lograr una fusión completa y uniforme. Tenga en cuenta la información del producto y busque el número de catálogo y el número de lote en el sitio web oficial de la compañía para tener la concentración de proteína del reactivo A, ya que cada botella de reactivo A está en una concentración de proteína diferente. Si la concentración de proteína es baja, un mayor volumen de reactivo A sería útil.
   2. Agregue 20 μL de reactivo A preparado a cada pocillo y pipete dos veces en el centro para dispersar las células muertas.
      NOTA: Mantenga el reactivo A y la placa de 96 pocillos en condiciones frías y complete todos los pasos en hielo. Coloque el plato en la oscuridad.
4. Día 2-12
   1. Limpiar el fondo de la placa de 96 pocillos e incubar a 37 °C y 5% de_CO2 hasta el día 6. En el día 6, cambie la mitad del medio eliminando 58 μL del medio de cada pocillo y agregando 60 μL del medio I.
      NOTA: Utilice una pipeta multicanal para completar el cambio de medio medio. Realice este paso suavemente para asegurarse de que no se retiren los gránulos de células del pozo. Aspirar el medio en una placa de Petri limpia de 10 cm. Si hay gránulos de células en el interior, agréguelos nuevamente a la placa de 96 pocillos.
5. Día 12- 18
   1. Cambiar el medio a medio II (Tabla 1) en el día 12. Preparar el medio II utilizando el reactivo A al 1% (v/v) mezclando lo siguiente: suero bovino fetal al 10%, NEAA al 0,1 mM, piruvato de 1 mM, penicilina de 100 U/ml, estreptomicina de 100 μg/ml, β-mercaptoetanol de 0,1 mM, diclorhidrato SAG de 100 nM y GMEM. Guárdelo en condiciones frescas y oscuras.
   2. Coseche los gránulos celulares en un tubo cónico de 15 ml de la placa de 96 pocillos y permita que los gránulos se asienten naturalmente durante 5 minutos a temperatura ambiente.
      NOTA: Retire el medio y los gránulos suavemente debajo de la superficie para evitar burbujas.
   3. Retire el sobrenadante mientras cuida los organoides. Transfiera los agregados celulares a una placa de suspensión de 10 cm que contenga 18 ml de medio preparado II con reactivo A.
      NOTA: No añadir el medio II preparado en la placa de 10 cm por adelantado, ya que el reactivo A debe estar a 4 °C.
   4. Incubar a 37 °C y 5% de_CO2 hasta el día 18.
6. A partir del día 18
   1. Cambiar el medio a medio III (Tabla 1). Prepare el medio III en condiciones de oscuridad mezclando lo siguiente: 10% FBS, 1xsupplement 1, 0.5 μM de ácido retinoico (AR), 100 μM taurina, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina y mezcla 1:1 de medio de águila modificada (DMEM)/mezcla de nutrientes F-12 de Dulbecco.
   2. El día 18, cuando se genera una vesícula óptica semitransparente, cortar los organoides con un cuchillo microquirúrgico.
      NOTA: Dividir el organoide, generalmente en cuatro piezas, en una placa de Petri con medio II. Cada pieza debe convertirse en una copa óptica intacta en las siguientes semanas.
   3. Agregue todos los pellets al centro del plato. Cosechar las células en un tubo cónico de halcón de 15 ml y permitir el asentamiento natural. Luego retire suavemente el sobrenadante.
      NOTA: Debido a sus tamaños, los organoides se pueden agregar en el centro girando la placa de Petri en una dirección durante 90 ° en un plano horizontal varias veces.
   4. Suspender y dispersar los pellets en dos placas de Petri de 10 cm, con 18 mL de medio III por plato, y transferir suavemente los platos a la incubadora para evitar la agregación celular. Continuar cultivando en medio III a 37 °C y 5% de_CO2 y cambiar el medio semanalmente. La CRX expresada después del día 45 y hasta el día 120, pudimos detectar el segmento externo del fotorreceptor.

2. Análisis de ROs humanas

1. Análisis del sistema de control de los bienes sobre el terreno
   1. Ensamble tres organoides CRX-tdTomato y tres derivados de H9 ES de los platos utilizando las puntas cortadas de 1 ml. Lave los organoides con 1 ml de DPBS precalentados (a temperatura ambiente).
   2. Preparar el tampón de digestión mezclando solución de tripsina-EDTA al 0,25% con 0,05 mg/ml de reactivo D.
   3. Disociar los organoides en células individuales utilizando el tampón de digestión preparado durante 8 min a 37 °C. Luego agregue el mismo volumen de DPBS con 10% de FBS y 0.05 mg / ml de reactivo D para inactivar la reacción.
   4. Suspenda y disperse ligeramente las células y luego filtre usando un filtro celular de 100 μm y use un sistema de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) en una línea láser de excitación de 561 nm y un filtro 780/60 para analizar las señales positivas CRX-tdTomato.
      NOTA: CRX se expresa inicialmente en el día 45 y aumenta con la maduración de los organoides. Se utilizan diez mil celdas para cada prueba, para cada punto de tiempo, se completan al menos tres repeticiones.
2. Cuantificación de la intensidad de fluorescencia de ROs
   1. Prepare los organoides viables al azar para obtener imágenes.
      NOTA: Establezca los parámetros y utilice los mismos filtros y parámetros para todos los monitores de intensidad de fluorescencia.
   2. Capture imágenes y analice la intensidad media de fluorescencia utilizando el software adecuado (por ejemplo, ImageJ).
   3. Importe las imágenes y, a continuación, conviértalas a 8 bits mediante Image | Tipo.
   4. Ajuste el umbral utilizando los parámetros predeterminados de Image | Ajustar | Umbral.
   5. Determine el área medida y, a continuación, evalúe el valor de gris mediante Analizar | Medir.
      NOTA: Los valores medios en el panel de resultados son la intensidad media de fluorescencia del área medida.

Resultados

La ilustración esquemática muestra el protocolo de diferenciación para mejorar las células precursoras con COCO (Figura 1). Desde PSC hasta ROs, numerosos detalles podrían causar variaciones en los resultados. Se recomienda registrar cada paso e incluso el número de catálogo y el número de lote de cada medio para rastrear todo el procedimiento.

En este documento, proporcionamos imágenes de campo brillante para los días 6, 12, 18 y 45 (

Discusión

La diferenciación de organoides retinianos es un método deseable para la generación de amplias células funcionales de la retina. La RO es un compuesto de diferentes células de la retina, como células ganglionares, células bipolares y fotorreceptores, generados por células madre pluripotentes hacia la retina neural 4,5,8,9. Aunque se pueden cosechar RO confluentes, lleva mucho tiempo, lo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
COCO	R&D Systems	3047-CC-050	DAN Domain family of BMP antagonists
DMEM/F-12	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells	Biological Industry	04-002-1A
GMEM	Gibco	11710-035
KnockOut Serum Replacement-Multi-Species	Gibco	A3181502
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)	sigma	M7145
Pen Strep	Gibco	15140-122
Primesurface 96 V-plate	Sbio	MS9096SZ	Cell aggregation in 1.2.7
Pyruvate	Sigma	S8636
Reagent A	BD	356231	Matrigel in 1.1.1
Reagent B	StemCell	5990	mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2
Reagent C	Gibco	12563-011	TrypLE Express in 1.2
Reagent D	Roche	11284932001	DNase I , in 1.2
Retinoic acid	Sigma	R2625-100MG
SAG	Enzo Life Science	ALX-270-426-M001
Supplement 1	Life Technologies	17502-048	N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III
Taurine	Sigma	T-8691-25G
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056	organoids dissociation in 2.1.3
Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem	Sigma	681669	Wnt inhibitor
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049