Induction dirigée d’organoïdes rétiniens à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Résumé

En utilisant une méthode d’auto-organisation, nous développons un protocole avec l’ajout de COCO qui pourrait augmenter considérablement la génération de photorécepteurs.

Résumé

La transplantation de cellules rétiniennes est une approche thérapeutique prometteuse, qui pourrait restaurer l’architecture rétinienne et stabiliser ou même améliorer les capacités visuelles de la rétine dégénérée. Néanmoins, les progrès dans la thérapie de remplacement cellulaire se heurtent actuellement aux défis de la nécessité d’une source standard de rétines humaines standardisées et de haute qualité. Par conséquent, un protocole facile et stable est nécessaire pour les expériences. Ici, nous développons un protocole optimisé, basé sur une méthode d’auto-organisation avec l’utilisation de molécules exogènes et de réactif A ainsi que l’excision manuelle pour générer les organoïdes tridimensionnels de la rétine humaine (RO). L’OI dérivée des cellules souches pluripotentes humaines (CSP) exprime des marqueurs spécifiques pour les photorécepteurs. Avec l’ajout de COCO, un antagoniste multifonctionnel, l’efficacité de différenciation des précurseurs et des cônes photorécepteurs est considérablement augmentée. L’utilisation efficace de ce système, qui présente les avantages des lignées cellulaires et des cellules primaires, et sans les problèmes d’approvisionnement associés à ces dernières, pourrait produire des cellules rétiniennes confluentes, en particulier des photorécepteurs. Ainsi, la différenciation des CSP en OI fournit une plate-forme optimale et biopertinente pour la modélisation des maladies, le dépistage de médicaments et la transplantation cellulaire.

Introduction

Les cellules souches pluripotentes (CSP) se caractérisent par leur auto-renouvellement et leur capacité à se différencier en toutes sortes de cellules somatiques. Ainsi, les organoïdes dérivés des CSP sont devenus une ressource importante dans la recherche en médecine régénérative. La dégénérescence rétinienne est caractérisée par la perte de photorécepteurs (bâtonnets et cônes) et de pigment rétinien épithélium. Le remplacement des cellules rétiniennes pourrait être un traitement encourageant pour cette maladie. Cependant, il n’est pas possible d’obtenir des rétines humaines pour la recherche et le traitement des maladies. Par conséquent, les organoïdes rétiniens (RO....

Protocole

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique institutionnel de l’hôpital Tongren de Beijing et de la Capital Medical University. Les CSEh H9 ont été obtenues auprès du WiCell Research Institute et génétiquement modifiées sur une lignée cellulaire marquée par tdTomato.

1. Génération d’OI humaines

1. Culture des CSEh dans des conditions sans mangeoire.
   1. Enduire un puits d’une plaque à 6 puits de 1 mL de 0,1 mg/mL du réactif A (tableau des matières) à 37 °C pendant au moins une demi-heure en suivant les instructions du fabricant. Décongeler une partie aliquote de 1x10⁶ CSEh.
      REMARQUE : Prépare....

Résultats

L’illustration schématique illustre le protocole de différenciation pour améliorer les cellules précurseurs avec COCO (Figure 1). Des PSC aux RO, de nombreux détails peuvent entraîner des variations de résultats. Il est recommandé d’enregistrer chaque étape et même le numéro de catalogue et le numéro de lot de chaque support pour suivre l’ensemble de la procédure.

Ici, nous fournissons des images en champ clair pour les jours 6, 12, 18 et 45 (

Discussion

La différenciation organoïde rétinienne est une méthode souhaitable pour la génération de cellules rétiniennes fonctionnelles amples. L’OI est un composite de différentes cellules rétiniennes, telles que les cellules ganglionnaires, les cellules bipolaires et les photorécepteurs, générés par les cellules souches pluripotentes vers la rétine neurale 4,5,8,9. Bien que les OI confl.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
COCO	R&D Systems	3047-CC-050	DAN Domain family of BMP antagonists
DMEM/F-12	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells	Biological Industry	04-002-1A
GMEM	Gibco	11710-035
KnockOut Serum Replacement-Multi-Species	Gibco	A3181502
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)	sigma	M7145
Pen Strep	Gibco	15140-122
Primesurface 96 V-plate	Sbio	MS9096SZ	Cell aggregation in 1.2.7
Pyruvate	Sigma	S8636
Reagent A	BD	356231	Matrigel in 1.1.1
Reagent B	StemCell	5990	mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2
Reagent C	Gibco	12563-011	TrypLE Express in 1.2
Reagent D	Roche	11284932001	DNase I , in 1.2
Retinoic acid	Sigma	R2625-100MG
SAG	Enzo Life Science	ALX-270-426-M001
Supplement 1	Life Technologies	17502-048	N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III
Taurine	Sigma	T-8691-25G
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056	organoids dissociation in 2.1.3
Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem	Sigma	681669	Wnt inhibitor
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049