从人多能干细胞中定向诱导视网膜类器官

摘要

使用自组织方法，我们开发了一种添加COCO的协议，可以显着增加光感受器的产生。

摘要

视网膜细胞移植是一种很有前途的治疗方法，它可以恢复视网膜结构并稳定甚至改善退化视网膜的视觉能力。然而，细胞替代疗法的进展目前面临着需要高质量和标准化人类视网膜的现成来源的挑战。因此，实验需要一个简单稳定的方案。在这里，我们开发了一种优化的方案，基于自组织方法，使用外源性分子和试剂A以及手动切除来生成三维人视网膜类器官（RO）。人多能干细胞（PSCs）衍生的RO表达光感受器的特异性标志物。随着多功能拮抗剂COCO的加入，光感受器前体和锥细胞的分化效率显着提高。该系统的有效使用具有细胞系和原代细胞的优点，并且没有与后者相关的来源问题，可以产生汇合的视网膜细胞，尤其是光感受器。因此，PSCs与RO的分化为疾病建模，药物筛选和细胞移植提供了最佳的生物相关平台。

引言

多能干细胞（PSC）的特点是其自我更新和分化成各种体细胞的能力。因此，源自PSCs的类器官已成为再生医学研究的重要资源。视网膜变性的特征是光感受器（视杆细胞和视锥细胞）和视网膜色素上皮的丧失。视网膜细胞置换可能是这种疾病的一种令人鼓舞的治疗方法。然而，获得人类视网膜用于疾病研究和治疗是不可行的。因此，源自 PSC 的视网膜类器官 （RO） 可有效且成功地概括多层天然视网膜细胞，有利于基础和转化研究¹，^2，3。我们的研究重点是RO分化，为研究视网膜变性提供充足和优质的^细胞4。

区分RO的方法不断涌现，Sasai实验室于2012年率先采用三维（3D）悬浮液区分^5。我们在人类胚胎干细胞（hESCs）中引入了CRX-tdTomato标签，以特异性跟踪感光器前体细胞，并通过添加COCO（Wnt，TGF-β和BMP途径的多功能拮抗剂6）来修改^方法。COCO已被证明可以有效地提高感光器前体和视锥细胞的分化效率6^，7。

研究方案

本研究获得首都医科大学附属北京同仁医院机构伦理委员会批准。H9 hESCs是从WiCell研究所获得的，并经过基因工程改造为tdTomato标记的细胞系。

1. 人类RO的产生

1. 在无饲养层条件下培养hESC。
   1. 按照制造商的说明，在 37 °C 下用 1 mL 的 0.1 mg/mL 试剂 A（材料表）涂覆 6 孔板的一个孔至少半小时。解冻 1x10⁶ hESC 的等分试样。
      注意：准备 3 mL 预热试剂 B（材料表），并将冷冻保存的细胞 （1 mL） 转移到 3 mL 新鲜培养基中。不要将hESC移液到单个细胞。
   2. 以200× g 离心5分钟，除去上清液。
   3. 将细胞接种到装有 2 mL 试剂 B 的试剂 A 包被板中，每天更换 2 mL 试剂 B。当达到约80%汇合度（通常约4天）时传代细胞。
2. 第 0 天
   1. 使用培养基I将hESC解离为单细胞悬液（表1）。通过混合以下物质制备培养基 I：20% （v/v） 敲除血清替代 （KSR）、0.1 mM MEM 非必需氨基酸溶液 （NEAA）、1 mM 丙酮酸、3 μM IWR-1-内切 （IWR1e）、30 ng/mL COCO、100 U/mL 青霉素、1....

结果

示意图描述了用COCO改善母离子细胞的分化方案（图1）。从 PSC 到 RO，许多细节都可能导致结果差异。建议记录每个步骤，甚至每种介质的目录号和批号，以跟踪整个过程。

在本文中，我们提供了第6、12、18和45天的明场图像（图2）。在第6天，类器官在96孔板中的直径通常在600μm左右，内部有密集的连接和明亮的边缘（

讨论

视网膜类器官分化是产生充足功能性视网膜细胞的理想方法。RO是由多能干细胞朝向神经视网膜⁴，^5，8，9产生的不同视网膜细胞（例如神经节细胞，双极细胞和光感受器）的复合物。虽然可以收获汇合的RO，但它很耗时，可能需要很长的培养期（长达180天）。然而，对于感光器移植，或研究锥杆或视?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
COCO	R&D Systems	3047-CC-050	DAN Domain family of BMP antagonists
DMEM/F-12	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells	Biological Industry	04-002-1A
GMEM	Gibco	11710-035
KnockOut Serum Replacement-Multi-Species	Gibco	A3181502
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)	sigma	M7145
Pen Strep	Gibco	15140-122
Primesurface 96 V-plate	Sbio	MS9096SZ	Cell aggregation in 1.2.7
Pyruvate	Sigma	S8636
Reagent A	BD	356231	Matrigel in 1.1.1
Reagent B	StemCell	5990	mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2
Reagent C	Gibco	12563-011	TrypLE Express in 1.2
Reagent D	Roche	11284932001	DNase I , in 1.2
Retinoic acid	Sigma	R2625-100MG
SAG	Enzo Life Science	ALX-270-426-M001
Supplement 1	Life Technologies	17502-048	N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III
Taurine	Sigma	T-8691-25G
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056	organoids dissociation in 2.1.3
Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem	Sigma	681669	Wnt inhibitor
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049