ヒト多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの誘導

要約

自己組織化法を用いて、光受容体の生成を大幅に増加させる可能性のあるCOCOを添加したプロトコルを開発します。

要約

網膜細胞移植は有望な治療アプローチであり、網膜構造を回復し、変性した網膜の視覚能力を安定または改善する可能性があります。それにもかかわらず、細胞補充療法の進歩は現在、高品質で標準化されたヒト網膜の既製の供給源を必要とするという課題に直面しています。したがって、実験には簡単で安定したプロトコルが必要です。ここでは、外因性分子と試薬Aを用いた自己組織化法と、3次元ヒト網膜オルガノイド(RO)を作製するための手動切除法に基づいて、最適化されたプロトコルを開発します。ヒト多能性幹細胞(PSC)由来のROは、光受容体に特異的なマーカーを発現します。多機能アンタゴニストであるCOCOを添加すると、視細胞前駆体および錐体の分化効率が大幅に向上します。細胞株と初代細胞の利点を持ち、後者に関連する調達の問題なしに、このシステムを効率的に使用することで、コンフルエントな網膜細胞、特に光受容体を生成することができます。したがって、PSCからROへの分化は、疾患モデリング、薬物スクリーニング、および細胞移植のための最適で生物学的に関連するプラットフォームを提供します。

概要

多能性幹細胞(PSC)は、自己複製とあらゆる種類の体細胞への分化能力を特徴としています。このように、PSC由来のオルガノイドは再生医療研究において重要な資源となっています。網膜変性は、光受容体(桿体および錐体)および網膜色素上皮の喪失を特徴とする。網膜細胞置換は、この病気の有望な治療法になる可能性があります。しかし、疾患の研究や治療のためにヒト網膜を入手することは現実的ではありません。したがって、多層の天然網膜細胞を効果的かつ首尾よく再現するPSC由来の網膜オルガノイド(RO)は、基礎研究およびトランスレーショナル研究に有益です^1,2,3。私たちの研究は、網膜変性を研究するための十分で質の高い細胞を提供するためにRO分化に焦点を当てています⁴。

ROを微分する方法は絶えず出現しており、2012年に笹井研究室によって3次元(3D)懸濁液分化が開拓されました⁵。ヒト胚性幹細胞(hESC)にCRX-tdTomatoタグを導入して視細胞前駆細胞を特異的に追跡し、Wnt、TGF-β、およびBMP経路の多機能アンタゴニストであるCOCOを添加して方法を変更しました⁶

プロトコル

この研究は、首都医科大学北京同仁病院の施設倫理委員会によって承認されました。H9 hESCはWiCell研究所から入手し、tdTomatoタグ付き細胞株に遺伝子操作しました。

1. ヒトROの生成

1. フィーダーフリー条件下でhESCを培養します。
   1. 6ウェルプレートの1ウェルに1 mLの0.1 mg/mL試薬A(材料表)を37°Cでコーティングし、製造元の指示に従って少なくとも30分間コーティングします。1x10⁶ hESCのアリコートを解凍します。
      注:3 mLの予熱した試薬B(材料表)を準備し、凍結保存された細胞(1 mL)を3 mLの新しい培地に移します。hESCを単一細胞にピペッティングしないでください。
   2. 200 x g で5分間遠心分離し、上清を除去します。
   3. 細胞を2 mLの試薬Bで試薬Aコーティングプレートに播種し、2 mLの試薬Bを毎日交換します。継代細胞は約80%のコンフルエントに達したとき(通常約4日)。
2. 0日目
   1. 培地Iを使用してhESCを単一細胞懸濁液に解離します(表1)。20%(v/v)ノックアウト血清置換(KSR)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(NEAA)、1 mMピ....

結果

模式図は、COCOで前駆細胞を改善するための分化プロトコルを示しています(図1)。PSCからROまで、多くの詳細が結果のばらつきを引き起こす可能性があります。手順全体を追跡するために、すべてのステップ、さらにはすべての媒体のカタログ番号とロット番号を記録することをお勧めします。

ここでは、6、12、18、および45日目の明視野画像を提供?.......

ディスカッション

網膜オルガノイドの分化は、十分な機能的な網膜細胞を生成するための望ましい方法です。このROは、神経網膜に向かう多能性幹細胞によって生成される神経節細胞、双極細胞、および光受容体などの異なる網膜細胞の複合体^である4、⁵、^8、9。コンフルエントなROを採取することはできますが、?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
COCO	R&D Systems	3047-CC-050	DAN Domain family of BMP antagonists
DMEM/F-12	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells	Biological Industry	04-002-1A
GMEM	Gibco	11710-035
KnockOut Serum Replacement-Multi-Species	Gibco	A3181502
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)	sigma	M7145
Pen Strep	Gibco	15140-122
Primesurface 96 V-plate	Sbio	MS9096SZ	Cell aggregation in 1.2.7
Pyruvate	Sigma	S8636
Reagent A	BD	356231	Matrigel in 1.1.1
Reagent B	StemCell	5990	mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2
Reagent C	Gibco	12563-011	TrypLE Express in 1.2
Reagent D	Roche	11284932001	DNase I , in 1.2
Retinoic acid	Sigma	R2625-100MG
SAG	Enzo Life Science	ALX-270-426-M001
Supplement 1	Life Technologies	17502-048	N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III
Taurine	Sigma	T-8691-25G
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056	organoids dissociation in 2.1.3
Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem	Sigma	681669	Wnt inhibitor
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049