Gerichtete Induktion retinaler Organoide aus humanen pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Mit einer selbstorganisierenden Methode entwickeln wir ein Protokoll mit dem Zusatz von COCO, das die Bildung von Photorezeptoren signifikant erhöhen könnte.

Zusammenfassung

Die retinale Zelltransplantation ist ein vielversprechender Therapieansatz, der die Netzhautarchitektur wiederherstellen und die Sehfähigkeit der degenerierten Netzhaut stabilisieren oder sogar verbessern könnte. Dennoch steht der Fortschritt in der Zellersatztherapie derzeit vor der Herausforderung, eine handelsübliche Quelle für qualitativ hochwertige und standardisierte menschliche Netzhäute zu benötigen. Daher ist ein einfaches und stabiles Protokoll für die Experimente erforderlich. Hier entwickeln wir ein optimiertes Protokoll, basierend auf einer selbstorganisierenden Methode unter Verwendung von exogenen Molekülen und Reagenz A sowie manueller Exzision zur Erzeugung der dreidimensionalen menschlichen Netzhautorganoide (RO). Die von humanen pluripotenten Stammzellen (PSCs) abgeleiteten RO exprimieren spezifische Marker für Photorezeptoren. Mit der Zugabe von COCO, einem multifunktionalen Antagonisten, wird die Differenzierungseffizienz von Photorezeptorvorläufern und Zapfen signifikant erhöht. Die effiziente Nutzung dieses Systems, das die Vorteile von Zelllinien und Primärzellen hat, und ohne die damit verbundenen Beschaffungsprobleme, könnte konfluente Netzhautzellen, insbesondere Photorezeptoren, produzieren. Somit bietet die Differenzierung von PSCs zu RO eine optimale und biorelevante Plattform für Krankheitsmodellierung, Wirkstoffscreening und Zelltransplantation.

Einleitung

Pluripotente Stammzellen (PSCs) zeichnen sich durch ihre Selbsterneuerung und die Fähigkeit aus, sich in alle Arten von Körperzellen zu differenzieren. Daher sind Organoide, die von PSCs abgeleitet sind, zu einer wichtigen Ressource in der Forschung der regenerativen Medizin geworden. Die Netzhautdegeneration ist durch den Verlust von Photorezeptoren (Stäbchen und Zapfen) und des retinalen Pigmentepithels gekennzeichnet. Der retinale Zellersatz könnte eine ermutigende Behandlung für diese Krankheit sein. Es ist jedoch nicht möglich, menschliche Netzhäute für die Erforschung und Therapie von Krankheiten zu erhalten. Daher sind retinale Organoide (ROs), die von PSCs abg....

Protokoll

Diese Studie wurde von der institutionellen Ethikkommission des Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, genehmigt. H9 hESCs wurden vom WiCell Research Institute gewonnen und gentechnisch zu tdTomato-markierten Zelllinien verändert.

1. Erzeugung menschlicher ROs

1. Kultur der hESCs unter feederfreien Bedingungen.
   1. Beschichten Sie eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 1 ml 0,1 mg/ml Reagenz A (Table of Materials) bei 37 °C für mindestens eine halbe Stunde gemäß den Anweisungen des Herstellers. Ein Aliquot von 1x10⁶ hESC auftauen.
      HINWEIS: Bereiten Sie 3 ml vorgewärmtes Reagenz B (

Ergebnisse

Die schematische Darstellung zeigt das Differenzierungsprotokoll zur Verbesserung von Vorläuferzellen mit COCO (Abbildung 1). Von PSC bis ROs können zahlreiche Details zu Ergebnisschwankungen führen. Es wird empfohlen, jeden Schritt und sogar die Katalognummer und Chargennummer jedes Mediums aufzuzeichnen, um den gesamten Vorgang zu verfolgen.

Hier stellen wir Hellfeldbilder für die Tage 6, 12, 18 und 45 bereit (Abbildung 2). An T.......

Diskussion

Die retinale Organoiddifferenzierung ist eine wünschenswerte Methode zur Erzeugung reichlich funktionsfähiger Netzhautzellen. Die RO ist ein Verbund aus verschiedenen Netzhautzellen, wie Ganglienzellen, bipolaren Zellen und Photorezeptoren, die von pluripotenten Stammzellen in Richtung der neuronalen Netzhaut 4,5,8,9 erzeugt werden. Obwohl konfluente ROs geerntet werden könnten, ist es zeita.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
COCO	R&D Systems	3047-CC-050	DAN Domain family of BMP antagonists
DMEM/F-12	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells	Biological Industry	04-002-1A
GMEM	Gibco	11710-035
KnockOut Serum Replacement-Multi-Species	Gibco	A3181502
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)	sigma	M7145
Pen Strep	Gibco	15140-122
Primesurface 96 V-plate	Sbio	MS9096SZ	Cell aggregation in 1.2.7
Pyruvate	Sigma	S8636
Reagent A	BD	356231	Matrigel in 1.1.1
Reagent B	StemCell	5990	mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2
Reagent C	Gibco	12563-011	TrypLE Express in 1.2
Reagent D	Roche	11284932001	DNase I , in 1.2
Retinoic acid	Sigma	R2625-100MG
SAG	Enzo Life Science	ALX-270-426-M001
Supplement 1	Life Technologies	17502-048	N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III
Taurine	Sigma	T-8691-25G
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056	organoids dissociation in 2.1.3
Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem	Sigma	681669	Wnt inhibitor
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049