JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Используя самоорганизующийся метод, мы разрабатываем протокол с добавлением COCO, который может значительно увеличить генерацию фоторецепторов.

Аннотация

Трансплантация клеток сетчатки является перспективным терапевтическим подходом, который может восстановить архитектуру сетчатки и стабилизировать или даже улучшить зрительные возможности дегенерированной сетчатки. Тем не менее, прогресс в клеточной заместительной терапии в настоящее время сталкивается с проблемами, связанными с необходимостью использования готового источника высококачественной и стандартизированной сетчатки человека. Поэтому для экспериментов необходим простой и стабильный протокол. Здесь мы разрабатываем оптимизированный протокол, основанный на самоорганизующемся методе с использованием экзогенных молекул и реагента А, а также ручного иссечения для генерации трехмерных органоидов сетчатки человека (RO). Ro, полученный из плюрипотентных стволовых клеток человека (PSC), экспрессирует специфические маркеры для фоторецепторов. С добавлением КОКО, многофункционального антагониста, эффективность дифференцировки предшественников и колбочек фоторецепторов значительно повышается. Эффективное использование этой системы, которая имеет преимущества клеточных линий и первичных клеток, и без проблем с источниками, связанных с последними, может производить сливающиеся клетки сетчатки, особенно фоторецепторы. Таким образом, дифференциация PSC в RO обеспечивает оптимальную и биорелевантную платформу для моделирования заболеваний, скрининга лекарств и трансплантации клеток.

Введение

Плюрипотентные стволовые клетки (PSC) характеризуются их самообновлением и способностью дифференцироваться во все виды соматических клеток. Таким образом, органоиды, полученные из PSC, стали важным ресурсом в исследованиях регенеративной медицины. Дегенерация сетчатки характеризуется потерей фоторецепторов (палочек и колбочек) и пигментного эпителия сетчатки. Замена клеток сетчатки может быть обнадеживающим лечением этого заболевания. Тем не менее, невозможно получить сетчатку человека для исследования и терапии заболеваний. Таким образом, органоиды сетчатки (RO), полученные из PSC, которые эффективно и успешно рекапитулируют многослойные нативные клетки сетчатки, полезны для фундаментальных и трансляционных исследований 1,2,3. Наше исследование сосредоточено на дифференцировке РО для обеспечения достаточных и качественных клеток для изучения дегенерации сетчатки4.

Методы дифференциации РО постоянно появляются, с трехмерной (3D) дифференциацией суспензии, впервые предложенной лабораторией Sasai в 2012году 5. Мы ввели метку CRX-tdTomato в эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs) для конкретного отслеживания клеток-предшественников фоторецепторов и модифицировали метод с добавлением COCO, многофункционального антагониста путей Wnt, TGF-β и BMP6. Было показано, что COCO эффективно повышает эффективность дифференцировки предшественников фоторецепторов и колбочек 6,7.

В целом, модифицируя классический метод дифференцировки, мы разработали доступный протокол для сбора обильных предшественников фоторецепторов и колбочек из ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ РО для анализа заболевания сетчатки, связанного с фоторецепторами, посредством лабораторных исследований и для дальнейшего клинического применения / трансплантации.

протокол

Это исследование было одобрено институциональным комитетом по этике Пекинской больницы Тунжэнь, Столичного медицинского университета. H9 hESCs были получены из Научно-исследовательского института WiCell и генетически модифицированы для клеточной линии, помеченной tdTomato.

1. Генерация человеческих РО

  1. Культивируйте гЭСК в условиях, свободных от кормушки.
    1. Покрыть одну лунку 6-луночной пластины 1 мл 0,1 мг/мл реагента А (Таблица материалов) при 37 °C в течение не менее получаса в соответствии с инструкциями завода-изготовителя. Разморозить аликвоту 1х106 хЭСК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте 3 мл предварительно подогретого реагента B (Таблица материалов) и перенесите криоконсервированные клетки (1 мл) в 3 мл свежей среды. Не пипетку гЭСК в отдельные ячейки.
    2. Центрифугу при 200 х г в течение 5 мин и удаляют супернатант.
    3. Засейте клетки в пластину реагента, покрытую А, 2 мл реагента В и ежедневно меняйте 2 мл реагента В. Прохождение клеток при достижении примерно 80% слияния (обычно около 4 дней).
  2. День 0
    1. Диссоциировать hESCs на одноклеточную суспензию с использованием среды I (таблица 1). Приготовьте среду I, смешав следующее: 20% (v/v) заменитель сыворотки KnockOut (KSR), 0,1 мМ MEM раствора заменимых аминокислот (NEAA), 1 мМ пирувата, 3 мкМ IWR-1-эндо (IWR1e), 30 нг/мл COCO, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (PS), 0,1 мМ β-меркаптоэтанола и минимальной незаменимой среды Глазго Eagle (GMEM).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом диссоциации подготовьте среду I и перенесите 12 мл среды I с 20 мкМ Y-27632 в чашку Петри 10 см, 500 мкл реагента C (Таблица материалов), содержащего 0,05 мг/мл реагента D (Таблица материалов) и 20 мкМ Y-27632 в пробирке объемом 1,5 мл. Выполните вышеуказанные шаги в темноте, так как компонент IWR1e в среде I является светочувствительным.
    2. Промывайте гЭСК предварительно нагретым 1x буфером фосфатно-буферного физиологического раствора (DPBS) Dulbecco.
    3. Добавьте подготовленную 500 мкл реагента (в 1,5 мл) и инкубируйте гЭСК в течение 3,5 мин при 37 °C и 5% CO2.
    4. Отсоедините ячейки, щелкнув боковой и нижней частью пластины в течение нескольких секунд и добавьте 500 мкл подготовленной среды I из чашки Петри в пластину hESC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте трубку объемом 1,5 мл с 900 мкл 1x DPBS и используйте гемоцитометр для подсчета клеток.
    5. Соберите клетки в новой трубке объемом 1,5 мл и пипетку клеточной суспензии вверх и вниз, а затем извлеките 100 мкл из трубки, а затем добавьте в трубку 900 мкл DPBS для подсчета клеток.
    6. Диспергируют левую клеточную суспензию 900 мкл и затем разбавляют клетки подготовленной средой I в чашке Петри до 9 х 104 клеток/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Весь объем среды составляет 12 мл; Всего необходимо 1,08 х 106 ячеек.
    7. Добавьте 100 мкл клеточной суспензии к каждой лунке неадгезионной пластины с V-образным дном, 96-луночной (Таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте многоканальную пипетку, чтобы сократить время и убедиться, что каждая скважина содержит эквивалентный номер ячейки. Каждый раз встряхивайте чашку Петри, прежде чем удалить порции по 100 мкл. Важно, чтобы клетки были равномерно распределены.
    8. Слегка открутите 96-луночную пластину в низкоскоростном шейкере в течение 5 мин, а затем инкубируйте при 37 °C и 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите пластину в темноте. Установите день как день 0.
  3. День 2
    1. Добавьте 1% реагента А (Таблица материалов). Готовят реагент А (концентрация белка 10 мг/мл), добавляя 133,4 мкл реагента А в 2 мл среды I.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выдерживайте реагент А при 4 °C в течение ночи перед использованием для достижения полного и равномерного плавления. Пожалуйста, обратите внимание на информацию о продукте и выполните поиск по каталожному номеру и номеру партии на официальном сайте компании, чтобы иметь концентрацию белка реагента А, так как каждая бутылка реагента А находится в разной концентрации белка. Если концентрация белка низкая, будет полезен увеличенный объем реагента А.
    2. Добавьте 20 мкл подготовленного реагента А к каждой лунке и дважды в центре пипетку, чтобы рассеять мертвые клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте реагент А и 96-луночную пластину в прохладных условиях и выполните все этапы на льду. Поместите тарелку в темное место.
  4. День 2-12
    1. Очистите дно 96-луночной плиты и инкубируйте при 37 °C и 5% CO2 до 6-го дня. На 6-й день изменяют половину среды, удаляя 58 мкл среды из каждой лунки и добавляя 60 мкл среды I.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте многоканальную пипетку для завершения половинной смены среды. Проведите этот этап осторожно, чтобы убедиться, что из колодца не удаляются гранулы клеток. Аспирируйте среду в чистую 10 см чашку Петри. Если внутри есть гранулы клеток, добавьте их обратно в 96-луночную пластину.
  5. День 12- 18
    1. Переведите среду на среднюю II (таблица 1) на 12-й день. Готовят среду II с использованием 1% (v/v) реагента A путем смешивания следующего: 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 0,1 мМ NEAA, 1 мМ пирувата, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,1 мМ β-меркаптоэтанола, 100 нМ дигидрохлорида SAG и ГМЭМ. Храните его в прохладных и темных условиях.
    2. Соберите гранулы ячейки в конической трубке объемом 15 мл из 96-луночной пластины и дайте гранулам естественным образом осесть в течение 5 мин при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно удалите среду и гранулы под поверхность, чтобы избежать пузырьков.
    3. Удалите супернатант во время ухода за органоидами. Переложите клеточные агрегаты в 10 см суспензионную посуду, содержащую 18 мл подготовленной среды II с реагентом А.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте подготовленную среду II в тарелку размером 10 см заранее, так как реагент А должен быть при температуре 4 °C.
    4. Инкубировать при 37 °C и 5% CO2 до 18 дня.
  6. Начиная с 18-го дня
    1. Переведите среду на среду III (таблица 1). Приготовьте среду III в темных условиях, смешивая следующее: 10% FBS, 1xsupplement 1, 0,5 мкМ ретиноевой кислоты (РА), 100 мкМ таурина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и смесь 1:1 модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM)/питательной смеси F-12.
    2. На 18 день, когда образуется полупрозрачный зрительный пузырь, разрежьте органоиды с помощью микрохирургического ножа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расколойте органоид, обычно на четыре части, в чашке Петри со средой II. Каждый кусочек должен вырасти в неповрежденную оптическую чашку в течение следующих недель.
    3. Сложите все гранулы к центру блюда. Соберите клетки в коническую соколиную трубку объемом 15 мл и обеспечьте естественное оседание. Затем аккуратно удалите супернатант.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Благодаря своим размерам органоиды могут быть агрегированы в центре путем вращения чашки Петри в одном направлении на 90° в горизонтальной плоскости несколько раз.
    4. Суспендировать и диспергировать гранулы в двух чашках Петри по 10 см, с 18 мл среды III на чашку, и осторожно переложить чашки в инкубатор, чтобы избежать агрегации клеток. Продолжайте культивирование в среде III при 37 °C и 5% CO2 и меняйте среду еженедельно. CRX экспрессировался после 45-го дня, и до 120-го дня мы могли обнаружить внешний сегмент фоторецептора.

2. Анализ человеческих RO

  1. Анализ СУИМ
    1. Соберите три органоида CRX-tdTomato и три органоида, полученных из H9 ES, из посуды, используя нарезанные наконечники 1 мл. Органоиды промыть 1 мл предварительно подогретого (комнатной температуры) DPBS.
    2. Готовят буфер пищеварения путем смешивания 0,25% раствора трипсина-ЭДТА с 0,05 мг/мл реагента D.
    3. Диссоциируют органоиды на отдельные клетки, используя подготовленный буфер пищеварения в течение 8 мин при 37 °C. Затем добавляют тот же объем DPBS с 10% FBS и 0,05 мг/мл реагента D для инактивации реакции.
    4. Слегка приостанавливайте и рассеивайте ячейки, а затем фильтруйте с помощью клеточного сетчатого фильтра 100 мкм и используйте систему флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) на лазерной линии возбуждения 561 нм и фильтр 780/60 для анализа положительных сигналов CRX-tdTomato.
      ПРИМЕЧАНИЕ: CRX первоначально экспрессируется на 45-й день и увеличивается с созреванием органоидов. Для каждого теста используется десять тысяч клеток, для каждой точки времени завершается не менее трех повторов.
  2. Количественная оценка интенсивности флуоресценции RO
    1. Подготовьте жизнеспособные органоиды случайным образом к визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Установите параметры и используйте одинаковые фильтры и параметры для всех мониторов интенсивности флуоресценции.
    2. Захватывайте изображения и анализируйте среднюю интенсивность флуоресценции с помощью подходящего программного обеспечения (например, ImageJ).
    3. Импортируйте изображения, а затем преобразуйте их в 8-разрядные с помощью Image | Тип.
    4. Настройка порогового значения с помощью параметров по умолчанию с помощью Image | Отрегулируйте | Порог.
    5. Определите измеренную область, а затем оцените значение серого цвета с помощью анализа | Мера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Средние значения на панели результатов представляют собой среднюю интенсивность флуоресценции измеряемой области.

Результаты

На схематической иллюстрации изображен протокол дифференцировки для улучшения клеток-предшественников с помощью COCO (рисунок 1). От PSC до RO, многочисленные детали могут привести к изменениям результатов. Рекомендуется записывать каждый шаг и даже каталожный номер и номе...

Обсуждение

Дифференцировка органоидов сетчатки является желательным методом для генерации достаточных функциональных клеток сетчатки. RO представляет собой композит различных клеток сетчатки, таких как ганглиозные клетки, биполярные клетки и фоторецепторы, генерируемые плюрипотентными ствол?...

Благодарности

Мы благодарим сотрудников лаборатории 502 за их техническую поддержку и полезные комментарии относительно рукописи. Эта работа была частично поддержана Пекинским муниципальным фондом естественных наук (Z200014) и Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2017YFA0105300).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanolLife Technologies21985-023
COCOR&D Systems3047-CC-050DAN Domain family of BMP antagonists
DMEM/F-12Gibco10565-042
DMSOSigmaD2650
DPBSGibcoC141905005BT
EDTAThermo15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem CellsBiological Industry04-002-1A
GMEMGibco11710-035
KnockOut Serum Replacement-Multi-SpeciesGibcoA3181502
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)sigmaM7145
Pen StrepGibco15140-122
Primesurface 96 V-plateSbioMS9096SZCell aggregation in 1.2.7
PyruvateSigmaS8636
Reagent ABD356231Matrigel in 1.1.1
Reagent BStemCell5990mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2
Reagent CGibco12563-011TrypLE Express in 1.2
Reagent DRoche11284932001DNase I , in 1.2
Retinoic acidSigmaR2625-100MG
SAGEnzo Life ScienceALX-270-426-M001
Supplement 1Life Technologies17502-048N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III
TaurineSigmaT-8691-25G
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200056organoids dissociation in 2.1.3
Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - CalbiochemSigma681669Wnt inhibitor
Y-27632 2HClSelleckS1049

Ссылки

  1. Xie, H., et al. Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids. Science Advances. 6 (6), 5247 (2020).
  2. Lu, Y. F., et al. Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development. Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).
  3. Cowan, C. S., et al. Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  4. Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
  5. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  6. Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366 (2020).
  7. Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
  8. Deng, W. L., et al. Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
  9. Gao, M. L., et al. Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128 (2020).
  10. Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. The road to restore vision with photoreceptor regeneration. Experimental Eye Research. 202, 108283 (2020).
  11. Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).
  12. Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communications. 6, 6286 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

170

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены