تحليل أنماط حركية السدادة أثناء وبعد تجديد الجهاز الفموي باستخدام تتبع الخلايا

Summary

نقدم بروتوكولا لتوصيف حركية وسلوك مجموعة من مائة خلية بحجم ميكرون إلى ملليمتر باستخدام المجهر الساطع وتتبع الخلايا. يكشف هذا الفحص أن Stentor coeruleus ينتقل عبر أربع مراحل متميزة سلوكيا عند تجديد جهاز فموي مفقود.

Abstract

Stentor coeruleus هو كائن حي نموذجي معروف لدراسة التجديد أحادي الخلية. كشف التحليل النسخي للخلايا الفردية عن مئات الجينات - العديد منها غير مرتبط بالجهاز الفموي (OA) - التي يتم تنظيمها بشكل تفاضلي على مراحل طوال عملية التجديد. كان من المفترض أن إعادة التنظيم المنهجي وتعبئة الموارد الخلوية نحو نمو OA جديد سيؤدي إلى تغييرات ملحوظة في الحركة والسلوك المقابلة في الوقت المناسب لمراحل التعبير الجيني التفاضلي. ومع ذلك ، فإن التعقيد المورفولوجي ل S. coeruleus استلزم تطوير فحص لالتقاط الإحصاءات والجدول الزمني. تم استخدام برنامج نصي مخصص لتتبع الخلايا في مقاطع فيديو قصيرة ، وتم تجميع الإحصاءات على عدد كبير من السكان (N ~ 100). عند فقدان OA ، يفقد S. coeruleus في البداية القدرة على الحركة الموجهة ؛ ثم بدءا من ~ 4 ساعات ، فإنه يظهر انخفاضا كبيرا في السرعة حتى ~ 8 ساعات. يوفر هذا الفحص أداة مفيدة لفحص الأنماط الظاهرية الحركية ويمكن تكييفها للتحقيق في الكائنات الحية الأخرى.

Introduction

Stentor coeruleus (Stentor) هو كائن حي نموذجي معروف تم استخدامه لدراسة التجديد أحادي الخلية بسبب حجمه الكبير ، وقدرته على تحمل العديد من تقنيات الجراحة المجهرية ، وسهولة الاستزراع في بيئة مختبرية¹،^2،3. ركزت دراسات التجديد المبكر على أكبر ميزة وأكثرها تميزا من الناحية المورفولوجية في Stentor - OA - التي يتم إلقاؤها بالكامل على الصدمة الكيميائية⁴،^5،6. يبدأ استبدال OA المفقود بظهور نطاق غشائي جديد - مجموعة من الأهداب التي تتحول تدريجيا نحو الجزء الأمامي من الخلية قبل تشكيل OA وظيفي على مدى ثماني مراحل مورفولوجية³. وقد لوحظت هذه المراحل بالتتابع، بغض النظر عن درجة الحرارة، وتوفر نقطة مرجعية عالمية لجميع الدراسات تقريبا⁵.

يتطلب التحليل الميكانيكي لتجديد Stentor أدوات لقياس توقيت التجديد قوية وبسيطة بما يكفي لتطبيقها على عينات متعددة كجزء من شاشة كيميائية أو جزيئية. الطريقة القياسية لإجراء الفحص القائم على الخلايا هي التصوير ، في هذه الحالة ، تصوير تكوين OA جديد أثناء التجديد. ومع ذلك ، فإن هذه الفحوصات القائمة على التصوير تكون أكثر فعالية عندما تحتوي البنية المجددة على مكونات جزيئية متميزة يمكن استخدامها كعلامات ، بحيث يمكن اكتشافها بسهولة في صورة فلورية. في حالة Stentor OA ، توجد المكونات المعروفة (الأهداب ، الأجسام القاعدية) أيضا على بقية سطح الخلية. لذلك ، لا يمكن تحقيق الاعتراف باستعادة النفاذ المفتوح بمجرد البحث عن وجود أو عدم وجود مكون.

بدلا من ذلك ، ستكون هناك حاجة إلى شكل من أشكال التعرف على الشكل للكشف عن OA ، وهذا قد يكون صعبا للغاية بالنظر إلى حقيقة أن خلايا Stentor غالبا ما تغير شكلها عبر عملية انقباض سريعة. تقدم هذه الورقة مقايسة بديلة للتجديد تعتمد على النشاط الحركي للجسم وأهداب الزراعة العضوية المفتوحة. مع تجديد OA ، تخضع الأهداب المشكلة حديثا لتغييرات قابلة للتكرار في الموضع والنشاط ، والتي بدورها تؤثر على حركة السباحة للخلية. من خلال تحليل الحركة ، من الممكن إجراء فحص ل "التجديد الوظيفي" الذي يحدد التجديد كميا عن طريق تحديد وظيفة الهياكل المجددة. استخدم التحليل السابق للدالة الهدبية Stentor أثناء التجديد قياس سرعة صورة الجسيمات ، جنبا إلى جنب مع حبات التتبع المضافة إلى الوسائط الخارجية ، لمراقبة التغيرات في نمط التدفق في مراحل مختلفة من التجديد⁷ ؛ ومع ذلك ، يتطلب هذا النهج تصويرا شاقا للخلايا الفردية وحقول التدفق المرتبطة بها ، واحدة تلو الأخرى.

باستخدام حركة الخلية نفسها كوكيل للتدفق الناتج عن الأهداب ، سيكون من الممكن تحليل أعداد أكبر من الخلايا بالتوازي ، باستخدام أنظمة تصوير منخفضة الدقة متوافقة مع منصات الفحص عالية الإنتاجية. يمكن استخدام هذا الفحص ، من حيث المبدأ ، لدراسة التطور والتجديد الوظيفي في الكائنات الحية الأخرى التي تعمل بمئات الميكرونات إلى الملليمترات على نطاق الحجم. يصف القسم 1 من البروتوكول بناء شريحة عينة متعددة الآبار ، والتي تسمح بتصوير عالي الإنتاجية لمجموعة من الخلايا على مدار يوم كامل. يتم توفير تفاصيل حول كيفية الضبط للاستخدام مع أنواع الخلايا الأخرى. يغطي القسم 2 من البروتوكول الحصول على بيانات الفيديو لهذا الفحص ، والتي يمكن إنجازها على مجهر تشريح باستخدام كاميرا انعكاسية رقمية أحادية العدسة. يوفر القسم 3 من البروتوكول تفصيلا لتتبع الخلايا وحساب سرعة الخلية باستخدام رمز MATLAB (المعلومات التكميلية). يشرح القسم 4 من البروتوكول كيفية تحويل النتائج العددية إلى مخططات كما هو موضح في الشكل 1C-F والشكل 2C لسهولة تفسير النتائج.

Protocol

ملاحظة: تم استزراع مجموعة من حوالي مائة خلية S. coeruleus وفقا لبروتوكول JoVE⁸ المنشور سابقا.

1. إعداد العينات

1. قطع قطعة من ورقة فاصل السيليكون بسماكة 250 ميكرومتر (جدول المواد) أصغر قليلا في كل من الارتفاع والعرض من شريحة المجهر. باستخدام ثقب 5/16 "لكمة ، قم بإنشاء آبار دائرية. ضع في اعتبارك ترك مساحة كافية بين الآبار المجاورة لضمان ختم جيد.
   ملاحظة: وجد أن مساحة 3 مم بين الآبار المجاورة كافية. مع الممارسة ، يمكن وضع عشرة آبار على شريحة عينة واحدة.
2. بدء تجديد OA عن طريق احتضان الخلايا في 10٪ من السكروز أو 2٪ من اليوريا لمدة دقيقتين (الشكل 1A). ثم ، اغسل ثلاث مرات مع الوسط الطازج⁸. ماصة بلطف ما يقرب من عشرة ستينتور في كل بئر. كن حذرا من مطابقة حجم العينة مع حجم البئر قدر الإمكان.
   ملاحظة: بالنسبة لأبعاد البئر المستخدمة هنا ، تم ماصة 12.5 ميكرولتر من العينة في كل بئر.
3. أغلق الآبار عن طريق خفض قطعة من زجاج الغلاف برفق (انظر جدول المواد) فوق الآبار بدءا من حافة واحدة. استخدم جسما ضيقا ومرنا قليلا ، مثل طرف ماصة 10 ميكرولتر ، للضغط لأسفل على غطاء الزجاج حيث يلامس ورقة السيليكون ، لضمان ختم جيد.

2. المجهر الضوء المرئي الفاصل الزمني

1. ضع العينة على مرحلة المجهر ، واضبط التكبير على أدنى مستوى متاح بحيث يتناسب المرء بشكل جيد مع الإطار بالكامل.
   ملاحظة: تم استخدام محول كاميرا 1.6x وتكبير 1x على الهدف على المجهر لهذا البروتوكول.
2. ابدأ الفاصل الزمني. احصل على فيديو 10 ثوان بمعدل 30 إطارا في الثانية من كل بئر في كل نقطة زمنية. إذا كنت تستخدم إعداد مجهر مع مرحلة X-Y مزودة بمحرك ، فقم بأتمتة الفاصل الزمني بأكمله. خلاف ذلك ، تأكد من وجود المستخدم في كل نقطة زمنية لترجمة العينة يدويا لتسجيل كل بئر.
   ملاحظة: تجنب ترك العينة مضاءة عند عدم التصوير لتجنب التسخين والتبخر. أحجام العينة صغيرة ، وسوف يؤدي التبخر إلى فقاعات الهواء.
3. احفظ الأفلام بتنسيق TIFF أو MOV أو AVI.
   ملاحظة: هذه هي أنواع ملفات الفيديو غير المملوكة الأكثر شيوعا. اعتمادا على برنامج المجهر المحدد ، قد يتم حفظ مقاطع الفيديو افتراضيا إلى نوع ملف خاص ، ولكن يمكن تصديرها بعد ذلك إلى أحد أنواع الملفات المذكورة أعلاه.
4. استخدم عامل تحويل بكسل إلى ملليمتر للمقياس المادي، وقم بإجراء معايرة أو استخدم حجم البكسل المعروف من الكاميرا المستخدمة. للمعايرة، احصل على صورة واضحة لشريحة معايرة أو مسطرة واضحة في نفس إعدادات التكبير مثل مقاطع الفيديو. باستخدام أي برنامج لعرض الصور ، قم بحساب عدد وحدات البكسل بين علامات المسافة المادية المعروفة.
   ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كانت صورة المسطرة تظهر علامة 1 مم وعلامة 2 مم المراد فصلهما بمقدار 100 بكسل، فإن عامل التحويل يكون 1 مم لكل 100 بكسل. بدلا من ذلك ، لاشتقاق هذا العامل من حجم بكسل الكاميرا ، ما عليك سوى ضرب حجم بكسل الكاميرا في التكبير. على سبيل المثال ، إذا كانت الكاميرا المستخدمة تحتوي على 3.45 ميكرومتر بكسل ، وكان التكبير المستخدم 1.6x ، فإن التحويل هو 3.45 ميكرومتر * 1.6 = 5.52 ميكرومتر لكل 1 بكسل.

3. تتبع الخلايا

1. قم بتنزيل البرنامجين النصيين ، TrackCells.m و CleanTraces.m ، إلى موقع سهل التذكر على الكمبيوتر. إذا لم تكن مقاطع فيديو البيانات موجودة بالفعل على هذا الكمبيوتر ، فقم بنقلها إلى هذا الكمبيوتر.
   ملاحظة: لا يلزم أن تكون مقاطع فيديو البيانات والبرامج النصية في نفس المجلد.
2. تنظيم مقاطع فيديو البيانات في مجلدات، واحدة لكل نقطة زمنية. استخدم البرنامج النصي TrackCells.m أولا لإجراء تتبع تلقائي للخلايا في مقاطع فيديو البيانات. افتح TrackCells.m وقم بتشغيل البرنامج النصي.
3. اختر إضافة إلى المسار إذا طلب منك ذلك نافذة منبثقة.، وهو ما لن يحدث عادة إلا عند تشغيل البرنامج النصي لأول مرة من مجلد معين. عند المطالبة، حدد فيديو بيانات واحد أو أكثر لبدء التتبع، وانتقل إلى مقاطع فيديو البيانات (القسم 2). حدد ملفات فيديو متعددة باستخدام النقر مع الضغط على مفتاح العالي أو النقر مع الضغط باستمرار على زر الماوس الأيسر أثناء التنقل فوق الملفات لتمييزها.
4. بمجرد الرضا عن قائمة الملفات في المربع اسم الملف: في أسفل نافذة المطالبة ، انقر فوق فتح. قم بإجراء تشغيل تجريبي على فيديو واحد أولا للتأكد من تعيين جميع المعلمات بشكل صحيح (انظر المناقشة أدناه).
   ملاحظة: سيقوم هذا البرنامج النصي الآن بإنشاء مجلد لكل ملف فيديو تم اختياره. ثم سيكتب في هذا المجلد كل إطار من الفيديو كملف .jpg وملف باسم position_estimates.mat ، والذي يحتوي على جميع الآثار الموجودة في الفيديو. اعتمادا على حجم مقاطع الفيديو وعدد مقاطع الفيديو وسرعة الكمبيوتر ، قد يستغرق تشغيل هذا البرنامج النصي ساعات.

4. التحقق من التتبع

1. تحقق من اتباع الخطوات الموضحة في القسم 3 بشكل صحيح عن طريق التحقق من عدم وجود رسائل خطأ قبل المتابعة. استخدم البرنامج النصي CleanTraces.m لرفض الآثار الشاذة أو الخاطئة يدويا. افتح CleanTraces.m في نافذة محرر MATLAB بالنقر المزدوج على الملف.
2. في المطالبة حدد إخراج مجلد البيانات بواسطة TrackCells.m. سيكون له نفس اسم ملف الفيديو ، وانتقل إلى أحد المجلدات التي تم إنشاؤها كما هو موضح في القسم 3. اختر مجلدا واحدا فقط.
   ملاحظة: سيعرض هذا البرنامج النصي الآن الآثار واحدة تلو الأخرى في نافذة منبثقة. يتم تراكبها على إطار الفيديو حيث يبدأ التتبع ، باللون الأخضر ، وإطار الفيديو حيث ينتهي التتبع ، باللون الأرجواني. لذلك ، يجب أن يربط التتبع الصحيح خلية خضراء وخلية أرجوانية.
3. عند المطالبة، أدخل 1 للاحتفاظ بالتتبع و0 لرفض التتبع. اضغط على Enter للانتقال إلى التتبع التالي.
   ملاحظة: سيستمر عرض الآثار الجديدة حتى لا يكون هناك المزيد من التتبعات، أو يتم عرض الستين الأولى. عند اكتمال هذه العملية ، سيقوم البرنامج النصي تلقائيا بإنشاء مجلد باسم CLEAN TRACES لحفظ المخرجات وعرض جميع الآثار المتبقية أعلى الإطار الأول من الفيديو (الشكل 1B). يتم حفظ هذه الصورة تلقائيا باسم LabeledTraces.png للرجوع إليها في المستقبل. سيتم حفظ جميع الآثار التي اختار المستخدم الاحتفاظ بها في الملف clean_traces.mat.
4. أكمل هذه الخطوة لجميع مقاطع الفيديو في نقطة زمنية واحدة قبل المتابعة.
   ملاحظة: بالنسبة للبيانات الواردة في هذه المخطوطة، تم الحصول على فيديو واحد لكل بئر في كل نقطة زمنية، ليصبح المجموع عشرة مقاطع فيديو لكل نقطة زمنية.

5. تصور البيانات

ملاحظة: لمقارنة حركة مجموعة الخلايا بأكملها بصريا عبر نقاط زمنية مختلفة، تمت ترجمة جميع الآثار من القسم 4 لتبدأ من الأصل وتنشئ إزاحة شعاعية واحدة مقابل مخطط زمني لكل نقطة زمنية (الشكل 1C-F، انظر الشكل التكميلي S1 لجميع النقاط الزمنية).

1. ابدأ بتنزيل البرنامج النصي بعنوان SpaghettiPlots.m. افتح البرنامج النصي وقم بتشغيله. عندما تنبثق نافذة متصفح ملف النافذة مع المطالبة تحديد مجلد الوقت الذي يحتوي على بيانات جيدة (clean_traces.mat) للرسم البياني، انتقل إلى مجلد إحدى النقاط الزمنية. لاحظ أن هذا المجلد يجب أن يحتوي بداخله على مجلد لكل من مقاطع الفيديو التي تم تحليلها.
2. عند مطالبتك بالمعايرة: ما هو عدد وحدات البكسل لكل ملليمتر؟، اكتب قيمة المعايرة الموجودة في الخطوة 2.4، ثم اضغط على مفتاح الإدخال Enter.
   ملاحظة: سيقوم البرنامج النصي الآن بدمج الآثار من جميع مقاطع الفيديو التي تم تحليلها في هذه النقطة الزمنية في مؤامرة واحدة (الشكل 1C-F). تشير الدوائر المنقطة الباهتة في المؤامرة إلى إزاحات شعاعية تبلغ 1 و 2 و 3 و 4 مم.
3. اضبط محاور المؤامرة حسب الضرورة عن طريق تغيير السطر 55 من البرنامج النصي ، والذي يتم تعيينه افتراضيا إلى rr = 4 لتضمين نصف قطر يصل إلى 4 مم. حفظ المؤامرة.

النتائج

الهدف من هذا الفحص هو تحديد التغير التدريجي لأنماط الحركة والزيادة التدريجية في سرعة الحركة من الخلايا داخل مجموعة كبيرة (N ~ 100) من Stentor المجددة. للمساعدة في تفسير النتائج ، يولد الرمز المخصص المضمن في هذا البروتوكول نوعين من المؤامرات: تراكب لجميع آثار حركة الخلية في مجموعة من بيانات ?...

Discussion

توجد حاليا العديد من خوارزميات تتبع الجسيمات والخلايا ، بعضها مجاني تماما. غالبا ما تكون التكلفة وسهولة الاستخدام مقايضات تتطلب حلا وسطا. بالإضافة إلى ذلك ، تم تصميم العديد من برامج تتبع الخلايا الحالية لتتبع حركة الزحف البطيئة لخلايا زراعة الأنسجة ، بدلا من حركة السباحة السريعة ل Stentor<...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m