Análisis de los patrones de motilidad del estentor durante y después de la regeneración del aparato oral mediante el seguimiento celular

Resumen

Presentamos un protocolo para la caracterización de la motilidad y el comportamiento de una población de células de cien micras a milímetros utilizando microscopía de campo brillante y seguimiento celular. Este ensayo revela que Stentor coeruleus pasa por cuatro fases conductualmente distintas al regenerar un aparato oral perdido.

Resumen

Stentor coeruleus es un organismo modelo bien conocido para el estudio de la regeneración unicelular. El análisis transcriptómico de células individuales reveló cientos de genes, muchos no asociados con el aparato oral (OA), que están regulados diferencialmente en fases a lo largo del proceso de regeneración. Se planteó la hipótesis de que esta reorganización sistémica y movilización de recursos celulares hacia el crecimiento de una nueva OA conducirá a cambios observables en el movimiento y el comportamiento correspondientes en el tiempo a las fases de expresión génica diferencial. Sin embargo, la complejidad morfológica de S. coeruleus requirió el desarrollo de un ensayo para capturar las estadísticas y la escala de tiempo. Se utilizó un script personalizado para rastrear celdas en videos cortos, y se compilaron estadísticas sobre una gran población (N ~ 100). Tras la pérdida de la OA, S. coeruleus inicialmente pierde la capacidad de movimiento dirigido; luego, a partir de ~ 4 h, exhibe una caída significativa en la velocidad hasta ~ 8 h. Este ensayo proporciona una herramienta útil para el cribado de fenotipos de motilidad y puede ser adaptado para la investigación de otros organismos.

Introducción

Stentor coeruleus (Stentor) es un organismo modelo bien conocido que se ha utilizado para estudiar la regeneración unicelular debido a su gran tamaño, capacidad para soportar varias técnicas microquirúrgicas y facilidad de cultivo en un entorno de laboratorio ^1,2,3. Los primeros estudios de regeneración se centraron en la característica más grande y morfológicamente distinta de Stentor, la OA, que se elimina por completo tras el choque químico ^4,5,6. El reemplazo de novo de una OA perdida comienza con la aparición de una nueva banda de membranalar, una serie de cilios que se desplazan gradualmente hacia la parte anterior de la célula antes de formar una OA funcional durante ocho etapas morfológicas³. Estas etapas se han observado secuencialmente, independientemente de la temperatura, y proporcionan un punto de referencia universal para casi todos los estudios⁵.

El análisis mecanicista de la regeneración del stentor requiere herramientas para medir el momento de la regeneración que sean lo suficientemente robustas y simples como para aplicarse a múltiples muestras como parte de una pantalla química o molecular. El método estándar para realizar un ensayo basado en células es la obtención de imágenes, en este caso, la obtención de imágenes de la formación de nueva OA durante la regeneración. Sin embargo, tales ensayos basados en imágenes son más efectivos cuando la estructura regeneradora contiene distintos componentes moleculares que se pueden usar como marcadores, de modo que se detecten fácilmente en una imagen de fluorescencia. En el caso del Stentor OA, los componentes conocidos (cilios, cuerpos basales) también están presentes en el resto de la superficie celular; por lo tanto, reconocer la restauración de la OA no puede lograrse simplemente buscando la presencia o ausencia de un componente.

Más bien, se requeriría alguna forma de reconocimiento de forma para detectar una OA, y esto es potencialmente muy desafiante dado el hecho de que las células stentor a menudo cambian de forma a través de un proceso contráctil rápido. Este artículo presenta un ensayo alternativo para la regeneración que se basa en la actividad móvil del cuerpo y los cilios de OA. A medida que la OA se regenera, los cilios recién formados experimentan cambios reproducibles en la posición y la actividad, lo que a su vez, afecta la motilidad de natación de la célula. Mediante el análisis de la motilidad, es posible realizar un ensayo de "regeneración funcional" que cuantifica la regeneración cuantificando la función de las estructuras regeneradas. El análisis previo de la función ciliar del stentor durante la regeneración utilizó la velocimetría de imagen de partículas, combinada con perlas trazadoras agregadas a los medios externos, para observar cambios en el patrón de flujo en diferentes etapas de la regeneración⁷; sin embargo, este enfoque requiere imágenes laboriosas de células individuales y sus campos de flujo asociados, uno a la vez.

Al utilizar el movimiento de la propia célula como un proxy para el flujo generado por los cilios, sería posible analizar un mayor número de células en paralelo, utilizando sistemas de imágenes de baja resolución compatibles con plataformas de detección de alto rendimiento. Este ensayo puede, en principio, ser utilizado para estudiar el desarrollo y la regeneración funcional en otros organismos nadadores en la escala de tamaño de cientos de micras a milímetros. La sección 1 del protocolo describe la construcción de un portaobjetos de muestra de múltiples pozos, que permite obtener imágenes de alto rendimiento de una población de células durante un día entero. Se proporcionan detalles sobre cómo ajustar para su uso con otros tipos de células. La sección 2 del protocolo cubre la adquisición de datos de video para este ensayo, que se puede lograr en un microscopio de disección con una cámara réflex digital de lente única. La sección 3 del protocolo proporciona un recorrido por el seguimiento de celdas y el cálculo de la velocidad de las celdas utilizando el código MATLAB (Información complementaria). La Sección 4 del protocolo explica cómo convertir los resultados numéricos en gráficos como se muestra en la Figura 1C-F y la Figura 2C para facilitar la interpretación de los resultados.

Protocolo

NOTA: Se cultivó una población de aproximadamente cien células de S. coeruleus de acuerdo con un protocolo JoVE⁸ publicado anteriormente.

1. Preparación de la muestra

1. Corte un trozo de lámina espaciadora de silicona de 250 μm de espesor (Tabla de materiales) ligeramente más pequeña en altura y anchura que un portaobjetos de microscopio. Usando un taladro de 5/16", cree pozos circulares. Tenga en cuenta dejar suficiente espacio entre los pozos vecinos para garantizar un buen sellado.
   NOTA: Se encontró que un espacio de 3 mm entre los pozos vecinos era suficiente. Con la práctica, se pueden colocar diez pozos en un solo tobogán de muestra.
2. Iniciar la regeneración de la OA incubando las células en sacarosa al 10% o 2% de urea durante 2 min (Figura 1A). Luego, lavar tres veces con medio fresco⁸. Pipetee suavemente aproximadamente diez Stentor en cada pozo. Tenga cuidado de hacer coincidir el volumen de la muestra con el volumen del pozo lo más cerca posible.
   NOTA: Para las dimensiones del pozo utilizadas aquí, se canalizaron 12,5 μL de muestra en cada pozo.
3. Cierre los pozos bajando suavemente un trozo de vidrio de cubierta (consulte la Tabla de materiales) sobre los pozos a partir de un borde. Use un objeto estrecho y ligeramente flexible, como una punta de pipeta de 10 μL, para presionar hacia abajo sobre el vidrio de la cubierta donde entra en contacto con la lámina de silicona, para garantizar un buen sellado.

2. Microscopía de luz visible time-lapse

1. Coloque la muestra en el escenario del microscopio y ajuste el aumento al más bajo disponible, de modo que uno quepa bien en el marco en su totalidad.
   NOTA: Un adaptador de cámara de 1.6x y un aumento de 1x en el objetivo se utilizaron en el microscopio para este protocolo.
2. Comience el lapso de tiempo. Adquiere un video de 10 s a 30 cuadros por segundo de cada pozo en cada punto de tiempo. Si utiliza una configuración de microscopio con una etapa X-Y motorizada, automatice todo el lapso de tiempo. De lo contrario, asegúrese de que un usuario esté presente en cada punto de tiempo para traducir manualmente la muestra para registrar cada pozo.
   NOTA: Evite dejar la muestra iluminada cuando no esté tomando imágenes para evitar el calentamiento y la evaporación. Los volúmenes de muestra son pequeños y la evaporación dará lugar a burbujas de aire.
3. Guarde películas como TIFF, MOV o AVI.
   NOTA: Estos son los tipos de archivos de video no propietarios más comunes. Dependiendo del software de microscopio específico, los videos pueden guardarse de forma predeterminada en un tipo de archivo propietario, pero luego se pueden exportar a uno de los tipos de archivo mencionados anteriormente.
4. Utilice un factor de conversión de píxel a milímetro para la escala física y realice una calibración o utilice el tamaño de píxel conocido de la cámara utilizada. Para calibrar, adquiera una imagen clara de una diapositiva de calibración o una regla clara con la misma configuración de ampliación que los vídeos. Usando cualquier programa de visualización de imágenes, cuente el número de píxeles entre marcas de una distancia física conocida.
   NOTA: Por ejemplo, si la imagen de una regla muestra la marca de 1 mm y la marca de 2 mm separadas por 100 píxeles, el factor de conversión es de 1 mm por cada 100 píxeles. Alternativamente, para derivar este factor del tamaño del píxel de la cámara, simplemente multiplique el tamaño del píxel de la cámara por el aumento. Por ejemplo, si la cámara utilizada tiene píxeles de 3,45 μm y la ampliación utilizada fue de 1,6x, entonces la conversión es de 3,45 μm * 1,6 = 5,52 μm por 1 píxel.

3. Seguimiento celular

1. Descargue los dos scripts, TrackCells.m y CleanTraces.m, en una ubicación fácil de recordar en el equipo. Si los videos de datos aún no están en esta computadora, transfiéralos a esta computadora.
   NOTA: Los vídeos de datos y los scripts no necesitan estar en la misma carpeta.
2. Organice los videos de datos en carpetas, una para cada punto de tiempo. Utilice primero el script TrackCells.m para realizar el seguimiento automatizado de celdas en los vídeos de datos. Abra TrackCells.m y ejecute el script.
3. Elija Agregar a la ruta de acceso si se lo solicita una ventana emergente, lo que normalmente solo ocurrirá cuando el script se ejecute por primera vez desde una carpeta determinada. Cuando se le solicite, seleccione uno o más videos de datos para iniciar el seguimiento, navegue hasta los videos de datos (sección 2). Seleccione varios archivos de vídeo pulsando mayús y clic, control y clic, o manteniendo pulsado el botón izquierdo del ratón mientras se mueve sobre los archivos para resaltarlos.
4. Una vez satisfecho con la lista de archivos en el cuadro Nombre de archivo: en la parte inferior de la ventana de solicitud, haga clic en Abrir. Realice una prueba en un video primero para confirmar que todos los parámetros están configurados correctamente (consulte la discusión a continuación).
   NOTA: Este script ahora creará una carpeta para cada archivo de video elegido. Luego escribirá en esta carpeta cada fotograma del video como un archivo .jpg y un archivo llamado position_estimates.mat, que contiene todos los rastros encontrados en el video. Dependiendo del tamaño de los videos, la cantidad de videos y la velocidad de la computadora, este script puede tardar horas en ejecutarse.

4. Verificación de trazas

1. Compruebe que los pasos descritos en la sección 3 se siguieron correctamente comprobando que no hay mensajes de error antes de continuar. Utilice el script CleanTraces.m para rechazar manualmente los rastros anómalos o falsos. Abra CleanTraces.m en la ventana del editor de MATLAB haciendo doble clic en el archivo.
2. En el símbolo del sistema Seleccione la salida de la carpeta de datos mediante TrackCells.m. Tendrá el mismo nombre que el archivo de vídeo, navegue hasta una de las carpetas creadas como se describe en la sección 3. Elija solo una carpeta.
   NOTA: Este script ahora mostrará los seguimientos uno por uno en una ventana emergente. Se superponen en el fotograma del vídeo donde comienza la traza, en verde, y en el fotograma del vídeo donde termina la traza, en magenta. Por lo tanto, un rastro válido debe vincular una célula verde y una célula magenta.
3. Cuando se le solicite, escriba 1 para mantener el seguimiento y 0 para rechazar el seguimiento. Pulse Intro para pasar al siguiente seguimiento.
   NOTA: Los nuevos rastros continuarán mostrándose hasta que no haya más rastros o se hayan mostrado los primeros sesenta. Cuando se complete este proceso, el script creará automáticamente una carpeta llamada CLEAN TRACES para guardar los resultados y mostrar todos los rastros restantes en la parte superior del primer fotograma del video (Figura 1B). Esta imagen se guarda automáticamente como LabeledTraces.png para futuras referencias. Todos los rastros que el usuario había elegido conservar se guardarán en el archivo clean_traces.mat.
4. Complete este paso para todos los videos en un punto de tiempo antes de continuar.
   NOTA: Para los datos de este manuscrito, se adquirió un video por cada pozo en cada punto de tiempo, para un total de diez videos por punto de tiempo.

5. Visualización de datos

NOTA: Para comparar visualmente la motilidad de toda la población celular a través de diferentes puntos de tiempo, todos los rastros de la sección 4 se tradujeron para comenzar en el origen y crear un desplazamiento radial versus un diagrama de tiempo para cada punto de tiempo (Figura 1C-F, ver Figura suplementaria S1 para todos los puntos de tiempo).

1. Comience descargando el script titulado SpaghettiPlots.m. Abra y ejecute el script. Cuando aparezca una ventana del explorador de archivos de ventana con el mensaje Seleccione la carpeta de tiempo que contiene datos de pozo (clean_traces.mat) para graficar, navegue a la carpeta de uno de los puntos de tiempo. Tenga en cuenta que esta carpeta debe contener dentro de ella una carpeta para cada uno de los videos analizados.
2. Cuando se le solicite Calibración: ¿Cuál es el número de píxeles por milímetro?, escriba el valor de calibración que se encuentra en el paso 2.4 y presione Entrar.
   NOTA: El script ahora combinará los rastros de todos los videos analizados en este punto de tiempo en una sola gráfica (Figura 1C-F). Los círculos punteados débiles en la gráfica indican desplazamientos radiales de 1, 2, 3 y 4 mm.
3. Ajuste los ejes de la gráfica según sea necesario cambiando la línea 55 del script, que de forma predeterminada se establece en rr = 4 para incluir un radio de hasta 4 mm. Guarda la parcela.

Resultados

El objetivo de este ensayo es cuantificar el cambio gradual de los patrones de movimiento y el aumento gradual de la velocidad de movimiento de las células dentro de una gran población de stentores regeneradores (N ~ 100). Para facilitar la interpretación de los resultados, el código personalizado incluido en este protocolo genera dos tipos de gráficos: una superposición de todos los rastros de movimiento celular en un conjunto de datos de video (Figura 1C-F

Discusión

Actualmente existen muchos algoritmos de seguimiento de partículas y células, algunos completamente gratuitos. El costo y la facilidad de uso a menudo son compensaciones que requieren compromiso. Además, muchos de los programas de seguimiento celular existentes están diseñados para rastrear el movimiento lento de rastreo de las células de cultivo de tejidos, en lugar del movimiento de natación rápida de Stentor, que gira mientras nada y puede sufrir cambios repentinos de dirección. Después de probar mu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m