ניתוח דפוסי תנועתיות של סטנטור במהלך ואחרי התחדשות מנגנון הפה באמצעות מעקב אחר תאים

Summary

אנו מציגים פרוטוקול לאפיון תנועתיות והתנהגות של אוכלוסייה של תאים בגודל של מאה מיקרון עד מילימטר באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר ומעקב אחר תאים. בדיקה זו מגלה כי Stentor coeruleus עובר דרך ארבעה שלבים שונים מבחינה התנהגותית כאשר הוא מחדש מנגנון אוראלי אבוד.

Abstract

Stentor coeruleus הוא אורגניזם מודל ידוע לחקר ההתחדשות החד-תאית. ניתוח תעתיק של תאים בודדים גילה מאות גנים – רבים מהם אינם קשורים למנגנון הפה (OA) – המווסתים באופן דיפרנציאלי בשלבים לאורך תהליך ההתחדשות. ההשערה הייתה כי ארגון מחדש מערכתי זה וגיוס משאבים תאיים לקראת צמיחה של OA חדש יובילו לשינויים נצפים בתנועה ובהתנהגות המתאימים בזמן לשלבים של ביטוי גנים דיפרנציאליים. עם זאת, המורכבות המורפולוגית של S. coeruleus חייבה פיתוח של מבחן כדי ללכוד את הסטטיסטיקה ואת ציר הזמן. סקריפט מותאם אישית שימש למעקב אחר תאים בסרטונים קצרים, וסטטיסטיקות נאספו על פני אוכלוסייה גדולה (N ~ 100). עם אובדן ה- OA, S. coeruleus מאבד בתחילה את היכולת לתנועה מכוונת; ואז מתחיל ב~ 4 שעות, הוא מציג ירידה משמעותית במהירות עד ~ 8 שעות. בדיקה זו מספקת כלי שימושי לסינון של פנוטיפים של תנועתיות וניתן להתאים אותה לחקירת אורגניזמים אחרים.

Introduction

Stentor coeruleus (Stentor) הוא אורגניזם מודל ידוע ששימש לחקר התחדשות חד-תאית בשל גודלו הגדול, יכולתו לעמוד במספר טכניקות מיקרו-כירורגיות וקלות התרבות בסביבת מעבדה^{של 1,2,3}. מחקרי התחדשות מוקדמים התמקדו בתכונה הגדולה והמורפולוגית המורפולוגית הגדולה ביותר בסטנטור – ה-OA – אשר נשפכת לחלוטין על הלם כימי ^4,5,6. החלפת דה נובו של OA אבוד מתחילה עם הופעתה של רצועת ממברנה חדשה – מערך של ריסונים הנעים בהדרגה לכיוון החלק הקדמי של התא לפני שהם יוצרים OA פונקציונלי על פני שמונה שלבים מורפולוגיים³. שלבים אלה נצפו ברצף, ללא קשר לטמפרטורה, ומספקים נקודת ייחוס אוניברסלית כמעט לכל המחקרים⁵.

ניתוח מכניסטי של התחדשות סטנטור דורש כלים למדידת תזמון ההתחדשות שהם חזקים ופשוטים מספיק כדי להיות מיושמים על דגימות מרובות כחלק ממסך כימי או מולקולרי. השיטה הסטנדרטית לביצוע בדיקה מבוססת תאים היא הדמיה, במקרה זה, הדמיה של היווצרות OA חדש במהלך התחדשות. עם זאת, מבחנים מבוססי הדמיה כאלה יעילים ביותר כאשר המבנה המתחדש מכיל רכיבים מולקולריים מובחנים שיכולים לשמש כסמנים, כך שהם יזוהו בקלות בתמונה פלואורסצנטית. במקרה של Stentor OA, הרכיבים הידועים (ריסונים, גופים בסיסיים) נמצאים גם על שאר פני השטח של התא; לכן, הכרה בשיקום של OA לא יכולה להיות מושגת פשוט על ידי חיפוש נוכחות או היעדר של רכיב.

במקום זאת, תידרש צורה כלשהי של זיהוי צורה כדי לזהות OA, וזה עלול להיות מאתגר מאוד בהתחשב בעובדה שתאי סטנטור לעתים קרובות משנים צורה באמצעות תהליך כיווץ מהיר. מאמר זה מציג בדיקה חלופית להתחדשות המסתמכת על פעילות תנועתית של הגוף וריסוני OA. כאשר ה- OA מתחדש, הריסונים החדשים שנוצרו עוברים שינויים הניתנים לשחזור במיקום ובפעילות, אשר בתורם משפיעים על תנועתיות השחייה של התא. על ידי ניתוח תנועתיות, ניתן לבצע בדיקה עבור "התחדשות פונקציונלית" המכמתת התחדשות על ידי כימות הפונקציה של המבנים המתחדשים. ניתוח קודם של תפקוד Stentor ciliary במהלך התחדשות השתמש בוולוצימטריה של תמונת חלקיקים, בשילוב עם חרוזי עקיבה שנוספו למדיה החיצונית, כדי לבחון שינויים בתבנית הזרימה בשלבים שונים של התחדשות⁷; עם זאת, גישה זו דורשת הדמיה מייגעת של תאים בודדים ושדות הזרימה הקשורים אליהם, בזה אחר זה.

על ידי שימוש בתנועת התא עצמו כפרוקסי לזרימה שנוצרה על ידי ריסונים, ניתן יהיה לנתח מספר גדול יותר של תאים במקביל, באמצעות מערכות הדמיה ברזולוציה נמוכה התואמות לפלטפורמות סינון בתפוקה גבוהה. בדיקה זו יכולה, באופן עקרוני, לשמש לחקר התפתחות והתחדשות תפקודית באורגניזמים שוחים אחרים בקנה מידה של מאות מיקרונים עד מילימטרים. סעיף 1 של הפרוטוקול מתאר את בנייתה של שקופית דגימה רב-תחומית, המאפשרת הדמיה בתפוקה גבוהה של אוכלוסיית תאים במשך עד יום שלם. מפורטים כיצד להתאים את עצמם לשימוש עם סוגי תאים אחרים. חלק 2 של הפרוטוקול מכסה את רכישת נתוני הווידאו עבור בדיקה זו, אשר ניתן לבצע על מיקרוסקופ דיסקציה עם מצלמת רפלקס דיגיטלית עם עדשה אחת. סעיף 3 של הפרוטוקול מספק מעבר של מעקב אחר תאים וחישוב מהירות התא באמצעות קוד MATLAB (מידע משלים). סעיף 4 של הפרוטוקול מסביר כיצד להפוך את התוצאות המספריות לחלקות כפי שמוצג באיור 1C-F ובאיור 2C לפענוח קל של התוצאות.

Protocol

הערה: אוכלוסייה של כמאה תאי S. coeruleus עברו תרבית בהתאם לפרוטוקול JoVE⁸ שפורסם בעבר.

1. הכנה לדוגמה

1. חותכים חתיכה של יריעת ספייסר סיליקון בעובי 250 מיקרומטר (טבלת חומרים) מעט קטנה יותר הן בגובה והן ברוחב מאשר מגלשת מיקרוסקופ. באמצעות ניקוב חור בגודל 5/16 אינץ', צרו בארות עגולות. שימו לב להשארת מרווח מספיק בין בארות שכנות כדי להבטיח אטימה טובה.
   הערה: רווח של 3 מ"מ בין בארות שכנות נמצא מספיק. עם התרגול, ניתן למקם עשר בארות על שקופית לדוגמה אחת.
2. יזום התחדשות של OA על ידי דגירה של התאים ב-10% סוכרוז או 2% אוריאה למשך 2 דקות (איור 1A). לאחר מכן, יש לשטוף שלוש פעמים עם בינוני טרי⁸. פיפטה בעדינות כעשרה סטנטורים לתוך כל באר. היזהר מהתאמת נפח הדגימה לנפח הבאר בצורה הדוקה ככל האפשר.
   הערה: עבור מידות הבאר המשמשות כאן, 12.5 μL של דגימה הוכנסו לכל באר.
3. סגרו את הבארות על ידי הנמכה עדינה של פיסת כיסוי (ראו טבלת חומרים) מעל הבארות החל מקצה אחד. השתמש באובייקט צר ומעט גמיש, כגון קצה פיפטה של 10 μL, כדי ללחוץ על הכיסוי שבו הוא יוצר קשר עם יריעת הסיליקון, כדי להבטיח אטימה טובה.

2. מיקרוסקופיית אור נראה בהילוך מהיר

1. הניחו את הדגימה על במת המיקרוסקופ, והגדירו את ההגדלה לרמה הנמוכה ביותר הזמינה כך שאחת מהן תתאים היטב למסגרת בשלמותה.
   הערה: מתאם מצלמה 1.6x והגדלה של 1x על המטרה שימשו במיקרוסקופ עבור פרוטוקול זה.
2. התחילו בהילוך מהיר. רכשו סרטון של 10 שניות ב-30 פריימים לשנייה מכל באר בכל נקודת זמן. אם אתם משתמשים בהתקנת מיקרוסקופ עם שלב X-Y ממונע, בצעו אוטומציה של כל קיטועי הזמן. אחרת, ודא שהמשתמש נוכח בכל נקודת זמן כדי לתרגם את הדגימה באופן ידני כדי להקליט כל באר.
   הערה: הימנע מלהשאיר את הדגימה מוארת בעת אי הדמיה כדי למנוע חימום והתאדות. נפחי הדגימה קטנים, וההתאדות תוביל לבועות אוויר.
3. שמור סרטים כ- TIFF, MOV או AVI.
   הערה: אלה הם סוגי קבצי הווידאו הנפוצים ביותר שאינם קנייניים. בהתאם לתוכנת המיקרוסקופ הספציפית, הסרטונים עשויים לשמור כברירת מחדל לסוג קובץ קנייני, אך לאחר מכן ניתן לייצא לאחד מסוגי הקבצים הנ"ל.
4. השתמש בגורם המרה בין פיקסל למילימטר עבור קנה מידה פיזי, ובצע כיול או השתמש בגודל פיקסל ידוע מהמצלמה שבה נעשה שימוש. כדי לכייל, קבל תמונה ברורה של שקופית כיול או סרגל ברור באותן הגדרות הגדלה כמו הסרטונים. באמצעות כל תוכנית צפייה בתמונות, ספרו את מספר הפיקסלים בין סימנים של מרחק פיזי ידוע.
   הערה: לדוגמה, אם התמונה של סרגל מציגה את סימן 1 מ"מ ואת סימן 2 מ"מ שיופרדו ב- 100 פיקסלים, גורם ההמרה הוא 1 מ"מ לכל 100 פיקסלים. לחלופין, כדי להפיק גורם זה מגודל הפיקסל של המצלמה, פשוט הכפל את גודל הפיקסל של המצלמה בהגדלה. לדוגמה, אם למצלמה שבה נעשה שימוש יש 3.45 μm פיקסלים, וההגדלה שבה נעשה שימוש הייתה 1.6x, אז ההמרה היא 3.45 μm * 1.6 = 5.52 μm לכל פיקסל אחד.

3. מעקב אחר תאים

1. הורד את שני הסקריפטים, TrackCells.m ו- CleanTraces.m, למיקום קל לזכירה במחשב. אם סרטוני הנתונים אינם נמצאים כבר במחשב זה, העבר אותם למחשב זה.
   הערה: סרטוני הנתונים והסקריפטים אינם צריכים להיות באותה תיקיה.
2. ארגן סרטוני נתונים בתיקיות, אחת לכל נקודת זמן. השתמש תחילה בסקריפט TrackCells.m כדי לבצע מעקב אוטומטי אחר תאים בסרטוני הנתונים. פתח את TrackCells.m והפעל את הסקריפט.
3. בחר הוסף לנתיב אם תתבקש על-ידי חלון קופץ., מה שבדרך כלל יקרה רק כאשר קובץ ה- Script מופעל בפעם הראשונה מתיקיה נתונה. כשתתבקש, בחר סרטון נתונים אחד או יותר כדי ליזום מעקב, נווט אל סרטוני הנתונים (סעיף 2). בחר קבצי וידאו מרובים באמצעות לחיצת shift, לחיצה על שליטה או על-ידי לחיצה ממושכת על לחצן העכבר השמאלי בעת מעבר על הקבצים כדי לסמן אותם.
4. לאחר שתסתפק ברשימת הקבצים בשם הקובץ: בתיבה בתחתית חלון הבקשה, לחץ על פתח. בצע תחילה הרצת בדיקה בסרטון אחד כדי לוודא שכל הפרמטרים מוגדרים כהלכה (ראה דיון בהמשך).
   הערה: סקריפט זה ייצור כעת תיקיה עבור כל קובץ וידאו שנבחר. לאחר מכן הוא יכתוב בתיקייה זו כל פריים של הסרטון כקובץ .jpg וקובץ בשם position_estimates.mat, המכיל את כל העקבות שנמצאו בסרטון. בהתאם לגודל הסרטונים, מספר הסרטונים ומהירות המחשב, סקריפט זה יכול להימשך שעות.

4. אימות עקבות

1. ודא שהשלבים המתוארים בסעיף 3 בוצעו כהלכה על-ידי בדיקה שאין הודעות שגיאה לפני שתמשיך. השתמש בסקריפט CleanTraces.m כדי לדחות באופן ידני עקבות חריגים או כוזבים. פתח את CleanTraces.m בחלון העורך של MATLAB על ידי לחיצה כפולה על הקובץ.
2. בהודעה בחר פלט תיקיית נתונים על-ידי TrackCells.m. יהיה לו שם זהה לזה של קובץ הווידאו, נווט לאחת התיקיות שנוצרו כמתואר בסעיף 3. בחר תיקיה אחת בלבד.
   הערה: קובץ Script זה יציג כעת את המעקבים בזה אחר זה בחלון קופץ. הם מכוסים על מסגרת הסרטון שבה מתחיל העקבה, בירוק, ועל מסגרת הסרטון שבה מסתיים העקבה, במג'נטה. לכן, עקבות תקפים צריכים לקשר בין תא ירוק לתא מג'נטה.
3. כשתתבקש, הזן 1 כדי לשמור על המעקב ו - 0 כדי לדחות את המעקב. הקש Enter כדי לעבור למעקב הבא.
   הערה: עקבות חדשים ימשיכו להופיע עד שלא יהיו עקבות נוספים, או שישים הראשונים יוצגו. כאשר תהליך זה יושלם, הסקריפט ייצור באופן אוטומטי תיקיה בשם CLEAN TRACES לשמירת הפלטים ויציג את כל העקבות הנותרים על גבי המסגרת הראשונה של הסרטון (איור 1B). תמונה זו נשמרת באופן אוטומטי כ-LabeledTraces.png לעיון עתידי. כל העקבות שהמשתמש בחר לשמור יישמרו בקובץ clean_traces.mat.
4. השלם שלב זה עבור כל הסרטונים בנקודת זמן אחת לפני שתמשיך.
   הערה: עבור הנתונים בכתב יד זה, נרכש סרטון אחד עבור כל באר בכל נקודת זמן, עבור סך של עשרה סרטונים בכל נקודת זמן.

5. תצוגה חזותית של נתונים

הערה: כדי להשוות באופן חזותי את התנועתיות של אוכלוסיית התאים כולה על פני נקודות זמן שונות, כל העקבות מסעיף 4 תורגמו כדי להתחיל במקור וליצור תרשים תזוזה רדיאלי אחד לעומת תרשים זמן עבור כל נקודת זמן (איור 1C-F, ראו איור משלים S1 עבור כל נקודות הזמן).

1. התחילו בהורדת התסריט שכותרתו ספגטיPlots.m. פתח והפעל את הסקריפט. כאשר חלון דפדפן של קובץ חלון קופץ עם תיקיית הזמן 'בחר' בקשה המכילה נתונים טובים (clean_traces.mat) לגרף, נווט אל התיקיה של אחת מנקודות הזמן. שים לב שתיקיה זו צריכה להכיל בתוכה תיקיה עבור כל אחד מסרטוני הווידאו שנותחו.
2. כשתתבקש כיול: מהו מספר הפיקסלים למילימטר?, הקלד את ערך הכיול שנמצא בשלב 2.4 והקש Enter.
   הערה: התסריט ישלב כעת את העקבות מכל הסרטונים שנותחו בנקודת זמן זו לעלילה אחת (איור 1C-F). עיגולים מנוקדים קלושים בחלקה מצביעים על תזוזות רדיאליות של 1, 2, 3 ו-4 מ"מ.
3. התאם צירים של העלילה לפי הצורך על ידי שינוי שורה 55 של הסקריפט, אשר כברירת מחדל, מוגדר rr = 4 עבור כולל רדיוס של עד 4 מ"מ. שמור את העלילה.

תוצאות

מטרתו של מבחן זה היא לכמת את השינוי ההדרגתי של דפוסי התנועה ואת העלייה המדורגת במהירות התנועה מתאים בתוך אוכלוסיית סטנטור גדולה (N ~ 100) המתחדשת. כדי לסייע בפרשנות התוצאות, הקוד המותאם אישית הכלול בפרוטוקול זה יוצר שני סוגים של חלקות: שכבה של כל עקבות תנועת התאים בסדרת נתוני וידאו (

Discussion

קיימים כיום אלגוריתמים רבים למעקב אחר חלקיקים ותאים, חלקם חופשיים לחלוטין. עלות וידידותיות למשתמש הן לעתים קרובות פשרות הדורשות פשרה. בנוסף, רבות מתוכניות המעקב הקיימות אחר תאים נועדו לעקוב אחר תנועת זחילה איטית של תאי תרבית רקמה, במקום תנועת השחייה המהירה של סטנטור, שמסתובבת תוך כדי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m
MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m
Microscope with camera port			We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E
Pasteurized Spring Water	Carolina	132458
TAP Growth Media	ThermoFisher Scientific	A1379801	Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center