Analyse von Motilitätsmustern von Stentor während und nach der oralen Apparateregeneration mittels Zellverfolgung

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll zur Charakterisierung der Motilität und des Verhaltens einer Population von hundert Mikro- bis Millimeterzellen mittels Hellfeldmikroskopie und Zellverfolgung vor. Dieser Assay zeigt, dass Stentor coeruleus bei der Regeneration eines verlorenen oralen Apparates vier verhaltensunterschiedene Phasen durchläuft.

Zusammenfassung

Stentor coeruleus ist ein bekannter Modellorganismus zur Erforschung der einzelligen Regeneration. Die transkriptomische Analyse einzelner Zellen ergab Hunderte von Genen - von denen viele nicht mit dem oralen Apparat (OA) assoziiert sind -, die während des gesamten Regenerationsprozesses in Phasen unterschiedlich reguliert werden. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass diese systemische Reorganisation und Mobilisierung zellulärer Ressourcen für das Wachstum einer neuen OA zu beobachtbaren Veränderungen in Bewegung und Verhalten führen wird, die im Laufe der Zeit den Phasen der differentiellen Genexpression entsprechen. Die morphologische Komplexität von S. coeruleus erforderte jedoch die Entwicklung eines Assays zur Erfassung der Statistiken und der Zeitskala. Ein benutzerdefiniertes Skript wurde verwendet, um Zellen in kurzen Videos zu verfolgen, und Statistiken wurden über eine große Population (N ~ 100) zusammengestellt. Mit dem Verlust der OA verliert S. coeruleus zunächst die Fähigkeit zur gerichteten Bewegung; Dann, beginnend bei ~ 4 h, zeigt es einen signifikanten Rückgang der Geschwindigkeit bis ~ 8 h. Dieser Assay bietet ein nützliches Werkzeug für das Screening von Motilitätsphänotypen und kann für die Untersuchung anderer Organismen angepasst werden.

Einleitung

Stentor coeruleus (Stentor) ist ein bekannter Modellorganismus, der aufgrund seiner Größe, seiner Fähigkeit, mehreren mikrochirurgischen Techniken standzuhalten, und der einfachen Kultivierung in einem Labor zur Untersuchung der einzelligen Regeneration^{verwendet wurde 1,2,3}. Frühe Regenerationsstudien konzentrierten sich auf das größte und morphologisch deutlichste Merkmal in Stentor - die OA -, die vollständig nach ^{chemischem Schock 4,5,6} ausgeschieden wird. Der De-novo-Ersatz einer verlorenen OA beginnt mit der Entstehung eines neuen membranellaren Bandes - einer Reihe von Zilien, die sich allmählich in Richtung der Vorderseite der Zelle verschieben, bevor sie eine funktionelle OA über acht morphologische Stadien^{bilden 3}. Diese Stadien wurden unabhängig von der Temperatur sequenziell beobachtet und bieten einen universellen Bezugspunkt für fast alle Studien⁵.

Die mechanistische Analyse der Stentor-Regeneration erfordert Werkzeuge zur Messung des Zeitpunkts der Regeneration, die robust und einfach genug sind, um als Teil eines chemischen oder molekularen Screens auf mehrere Proben angewendet zu werden. Die Standardmethode zur Durchführung eines zellbasierten Assays ist die Bildgebung, in diesem Fall die Abbildung der Bildung neuer OA während der Regeneration. Solche bildgebenden Assays sind jedoch am effektivsten, wenn die regenerierende Struktur verschiedene molekulare Komponenten enthält, die als Marker verwendet werden können, so dass sie in einem Fluoreszenzbild leicht nachgewiesen werden können. Im Falle des Stentor OA sind die bekannten Komponenten (Zilien, Basalkörper) auch auf dem Rest der Zelloberfläche vorhanden; Daher kann das Erkennen der Wiederherstellung der OA nicht einfach dadurch erreicht werden, dass nach dem Vorhandensein oder Fehlen einer Komponente gesucht wird.

Vielmehr wäre eine Form der Formerkennung erforderlich, um eine OA zu erkennen, und dies ist möglicherweise sehr herausfordernd, da Stentor-Zellen ihre Form oft über einen schnellen kontraktilen Prozess ändern. Dieses Papier stellt einen alternativen Assay für die Regeneration vor, der auf der beweglichen Aktivität des Körpers und der OA-Zilien beruht. Wenn sich die OA regeneriert, erfahren die neu gebildeten Zilien reproduzierbare Veränderungen in Position und Aktivität, was wiederum die Schwimmmotilität der Zelle beeinflusst. Durch die Analyse der Motilität ist es möglich, einen Assay für die "funktionelle Regeneration" durchzuführen, der die Regeneration quantifiziert, indem die Funktion der regenerierten Strukturen quantifiziert wird. Frühere Analysen der Stentor ciliary Funktion während der Regeneration verwendeten Partikelbild-Velocimetrie, kombiniert mit Tracer-Perlen, die dem externen Medium hinzugefügt wurden, um Veränderungen des Strömungsmusters in verschiedenen Stadien der Regeneration^{zu beobachten 7}; Dieser Ansatz erfordert jedoch eine aufwändige Bildgebung einzelner Zellen und der damit verbundenen Strömungsfelder, nacheinander.

Durch die Verwendung der Bewegung der Zelle selbst als Proxy für den von Zilien erzeugten Fluss wäre es möglich, eine größere Anzahl von Zellen parallel zu analysieren, wobei niedrig aufgelöste Bildgebungssysteme verwendet werden, die mit Hochdurchsatz-Screening-Plattformen kompatibel sind. Dieser Assay kann im Prinzip verwendet werden, um die Entwicklung und funktionelle Regeneration in anderen schwimmenden Organismen im Größenbereich von Hunderten von Mikrometern bis Millimetern zu untersuchen. Abschnitt 1 des Protokolls beschreibt den Aufbau eines Multiwell-Probenobjektträgers, der eine Hochdurchsatz-Bildgebung einer Zellpopulation über einen ganzen Tag ermöglicht. Es werden Details zum Anpassen an die Verwendung mit anderen Zelltypen bereitgestellt. Abschnitt 2 des Protokolls umfasst die Erfassung von Videodaten für diesen Assay, die auf einem Dissektionsmikroskop mit einer digitalen Spiegelreflexkamera durchgeführt werden kann. Abschnitt 3 des Protokolls bietet eine Begehung der Zellverfolgung und der Berechnung der Zellgeschwindigkeit unter Verwendung des MATLAB-Codes (Ergänzende Informationen). In Abschnitt 4 des Protokolls wird erläutert, wie die numerischen Ergebnisse in Diagramme umgewandelt werden, wie in Abbildung 1C-F und Abbildung 2C gezeigt, um die Interpretation der Ergebnisse zu erleichtern.

Protokoll

HINWEIS: Eine Population von etwa hundert S. coeruleus-Zellen wurde gemäß einem zuvor veröffentlichten JoVE-Protokoll⁸ kultiviert.

1. Probenvorbereitung

1. Schneiden Sie ein Stück 250 μm dickes Silikon-Abstandshalterblatt (Table of Materials) etwas kleiner in Höhe und Breite als ein Objektträger. Erstellen Sie mit einem 5/16 "Locher kreisförmige Vertiefungen. Achten Sie darauf, genügend Platz zwischen benachbarten Brunnen zu lassen, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten.
   HINWEIS: Ein Abstand von 3 mm zwischen benachbarten Brunnen wurde als ausreichend befunden. Mit etwas Übung können zehn Vertiefungen auf einem einzigen Probenobjektträger platziert werden.
2. Initiieren Sie die Regeneration von OA, indem Sie die Zellen in 10% Saccharose oder 2% Harnstoff für 2 min inkubieren (Abbildung 1A). Dann dreimal mit frischem Medium⁸ waschen. Pipettieren Sie vorsichtig etwa zehn Stentor in jedes Bohrloch. Achten Sie darauf, das Probenvolumen so genau wie möglich an das Bohrlochvolumen anzupassen.
   HINWEIS: Für die hier verwendeten Bohrlochabmessungen wurden 12,5 μL Probe in jede Vertiefung pipettiert.
3. Schließen Sie die Vertiefungen, indem Sie ein Stück Deckglas (siehe Materialtabelle) von einer Kante ausgehend sanft über die Vertiefungen senken. Verwenden Sie ein schmales und leicht flexibles Objekt, z. B. eine 10-μL-Pipettenspitze, um auf das Deckglas zu drücken, wo es die Silikonplatte berührt, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten.

2. Mikroskopie des sichtbaren Lichts Zeitraffer

1. Legen Sie die Probe auf den Mikroskoptisch und stellen Sie die Vergrößerung auf den niedrigsten verfügbaren Wert ein, so dass eine gut in den Rahmen in seiner Gesamtheit passt.
   HINWEIS: Für dieses Protokoll wurden am Mikroskop ein 1,6-facher Kameraadapter und eine 1-fache Vergrößerung am Objektiv verwendet.
2. Beginnen Sie mit dem Zeitraffer. Erfassen Sie ein 10-Sekunden-Video mit 30 Bildern pro Sekunde jedes Wells zu jedem Zeitpunkt. Wenn Sie ein Mikroskop-Setup mit einer motorisierten X-Y-Stufe verwenden, automatisieren Sie den gesamten Zeitraffer. Stellen Sie andernfalls sicher, dass zu jedem Zeitpunkt ein Benutzer anwesend ist, um das Beispiel manuell zu übersetzen, um jedes Vertiefungsgut aufzuzeichnen.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Probe beleuchtet zu lassen, wenn Sie keine Bildgebung machen, um eine Erwärmung und Verdunstung zu vermeiden. Die Probenvolumina sind klein und die Verdunstung führt zu Luftblasen.
3. Speichern Sie Filme als TIFF, MOV oder AVI.
   HINWEIS: Dies sind die gebräuchlichsten nicht-proprietären Videodateitypen. Abhängig von der spezifischen Mikroskopsoftware können die Videos standardmäßig in einem proprietären Dateityp gespeichert werden, können dann aber in einen der oben genannten Dateitypen exportiert werden.
4. Verwenden Sie einen Pixel-zu-Millimeter-Umrechnungsfaktor für die physikalische Skalierung und führen Sie eine Kalibrierung durch oder verwenden Sie die bekannte Pixelgröße der verwendeten Kamera. Erfassen Sie zur Kalibrierung ein klares Bild eines Kalibrierungsobjektträgers oder eines klaren Lineals mit den gleichen Vergrößerungseinstellungen wie die Videos. Zählen Sie mit einem beliebigen Bildbetrachtungsprogramm die Anzahl der Pixel zwischen Markierungen einer bekannten physikalischen Entfernung.
   HINWEIS: Wenn das Bild eines Lineals beispielsweise die 1-mm-Markierung und die 2-mm-Markierung zeigt, die durch 100 Pixel getrennt werden sollen, beträgt der Umrechnungsfaktor 1 mm pro 100 Pixel. Alternativ, um diesen Faktor aus der Kamerapixelgröße abzuleiten, multiplizieren Sie einfach die Kamerapixelgröße mit der Vergrößerung. Wenn die verwendete Kamera beispielsweise 3,45 μm-Pixel hat und die verwendete Vergrößerung 1,6x betrug, beträgt die Konvertierung 3,45 μm * 1,6 = 5,52 μm pro 1 Pixel.

3. Zell-Tracking

1. Laden Sie die beiden Skripts TrackCells.m und CleanTraces.m an einen leicht zu merkenden Speicherort auf dem Computer herunter. Wenn sich die Datenvideos noch nicht auf diesem Computer befinden, übertragen Sie sie auf diesen Computer.
   HINWEIS: Die Datenvideos und die Skripte müssen sich nicht im selben Ordner befinden.
2. Organisieren Sie Datenvideos in Ordnern, einen für jeden Zeitpunkt. Verwenden Sie zuerst das Skript TrackCells.m , um ein automatisiertes Zelltracking in den Datenvideos durchzuführen. Öffnen Sie TrackCells.m , und führen Sie das Skript aus.
3. Wählen Sie "Zu Pfad hinzufügen ", wenn Sie in einem Popup-Fenster dazu aufgefordert werden, was normalerweise nur geschieht, wenn das Skript zum ersten Mal von einem bestimmten Ordner aus ausgeführt wird. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, wählen Sie ein oder mehrere Datenvideos aus, um das Tracking zu initiieren, navigieren Sie zu den Datenvideos (Abschnitt 2). Wählen Sie mehrere Videodateien aus, indem Sie bei gedrückter Umschalttaste, bei gedrückter Strg-Taste oder bei gedrückter linker Maustaste über die Dateien klicken, um sie zu markieren.
4. Sobald Sie mit der Liste der Dateien im Feld Dateiname: am unteren Rand des Eingabeaufforderungsfensters zufrieden sind, klicken Sie auf Öffnen. Führen Sie zuerst einen Testlauf für ein Video durch, um zu bestätigen, dass alle Parameter korrekt eingestellt sind (siehe Diskussion unten).
   HINWEIS: Dieses Skript erstellt nun einen Ordner für jede ausgewählte Videodatei. Es schreibt dann jedes Bild des Videos als .jpg Datei und eine Datei mit dem Namen position_estimates.mat in diesen Ordner, die alle im Video gefundenen Spuren enthält. Abhängig von der Größe der Videos, der Anzahl der Videos und der Geschwindigkeit des Computers kann die Ausführung dieses Skripts Stunden dauern.

4. Trace-Verifizierung

1. Stellen Sie sicher, dass die in Abschnitt 3 beschriebenen Schritte korrekt ausgeführt wurden, indem Sie überprüfen, ob keine Fehlermeldungen vorliegen, bevor Sie fortfahren. Verwenden Sie das Skript CleanTraces.m , um anomale oder falsche Ablaufverfolgungen manuell abzulehnen. Öffnen Sie CleanTraces.m im MATLAB-Editorfenster , indem Sie auf die Datei doppelklicken.
2. An der Eingabeaufforderung Select data folder ausgabe by TrackCells.m. Es hat den gleichen Namen wie die Videodatei, navigieren Sie zu einem der Ordner, die wie in Abschnitt 3 beschrieben erstellt wurden. Wählen Sie nur einen Ordner aus.
   HINWEIS: Dieses Skript zeigt die Spuren jetzt nacheinander in einem Popup-Fenster an. Sie werden auf dem Frame des Videos, wo die Spur beginnt, in Grün und dem Frame des Videos, wo die Spur endet, in Magenta überlagert. Daher sollte eine gültige Spur eine grüne Zelle und eine Magenta-Zelle verknüpfen.
3. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, geben Sie 1 ein, um die Ablaufverfolgung beizubehalten, und 0, um die Ablaufverfolgung abzulehnen. Drücken Sie die EINGABETASTE , um mit der nächsten Ablaufverfolgung fortzufahren.
   HINWEIS: Neue Spuren werden so lange angezeigt, bis entweder keine Spuren mehr vorhanden sind oder die ersten sechzig angezeigt wurden. Wenn dieser Vorgang abgeschlossen ist, erstellt das Skript automatisch einen Ordner mit dem Namen CLEAN TRACES, um die Ausgaben zu speichern und alle verbleibenden Ablaufverfolgungen über dem ersten Frame des Videos anzuzeigen (Abbildung 1B). Dieses Bild wird automatisch als LabeledTraces.png zur späteren Bezugnahme gespeichert. Alle Traces, die der Benutzer behalten wollte, werden in der Datei clean_traces.mat gespeichert.
4. Führen Sie diesen Schritt für alle Videos zu einem bestimmten Zeitpunkt aus, bevor Sie fortfahren.
   HINWEIS: Für die Daten in diesem Manuskript wurde für jedes Bohrloch zu jedem Zeitpunkt ein Video erfasst, insgesamt zehn Videos pro Zeitpunkt.

5. Datenvisualisierung

HINWEIS: Um die Motilität der gesamten Zellpopulation über verschiedene Zeitpunkte visuell zu vergleichen, wurden alle Spuren aus Abschnitt 4 so übersetzt, dass sie am Ursprung beginnen und für jeden Zeitpunkt ein radiales Verschiebungs- versus Zeitdiagramm erstellen (Abbildung 1C-F, siehe Ergänzende Abbildung S1 für alle Zeitpunkte).

1. Beginnen Sie mit dem Download des Skripts SpaghettiPlots.m. Öffnen Sie das Skript, und führen Sie es aus. Wenn ein Fensterdatei-Browserfenster mit der Eingabeaufforderung Select time folder containing well data (clean_traces.mat) zum Diagramm angezeigt wird, navigieren Sie zum Ordner eines der Zeitpunkte. Beachten Sie, dass dieser Ordner einen Ordner für jedes der analysierten Videos enthalten sollte.
2. Wenn Sie zur Kalibrierung aufgefordert werden: Wie hoch ist die Anzahl der Pixel pro Millimeter?, geben Sie den Kalibrierungswert in Schritt 2.4 ein und drücken Sie die Eingabetaste.
   HINWEIS: Das Skript kombiniert nun die Spuren aus allen analysierten Videos zu diesem Zeitpunkt in einem einzigen Diagramm (Abbildung 1C-F). Schwach gepunktete Kreise im Diagramm weisen auf radiale Verschiebungen von 1, 2, 3 und 4 mm hin.
3. Passen Sie die Achsen des Plots nach Bedarf an, indem Sie Zeile 55 des Skripts ändern, die standardmäßig auf rr = 4 gesetzt ist, um einen Radius von bis zu 4 mm einzuschließen. Speichern Sie die Handlung.

Ergebnisse

Das Ziel dieses Assays ist es, die allmähliche Veränderung von Bewegungsmustern und die schrittweise Erhöhung der Bewegungsgeschwindigkeit von Zellen innerhalb einer großen (N ~ 100) regenerierenden Stentor-Population zu quantifizieren. Um die Interpretation der Ergebnisse zu erleichtern, generiert der in diesem Protokoll enthaltene benutzerdefinierte Code zwei Arten von Diagrammen: eine Überlagerung aller Zellbewegungsspuren in einem Satz von Videodaten (Abbildung 1C-F und Abbildung

Diskussion

Derzeit gibt es viele Partikel- und Zellverfolgungsalgorithmen, von denen einige völlig kostenlos sind. Kosten und Benutzerfreundlichkeit sind oft Kompromisse, die Kompromisse erfordern. Darüber hinaus sind viele der bestehenden Zellverfolgungsprogramme so konzipiert, dass sie die langsame Kriechbewegung von Gewebekulturzellen verfolgen, anstatt die schnelle Schwimmbewegung von Stentor, die sich während des Schwimmens dreht und plötzliche Richtungsänderungen erfahren kann. Nach dem Testen vieler dieser Opti...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m