使用细胞追踪分析口腔器械再生期间和之后的张力模式

摘要

我们提出了一种方案，用于使用明场显微镜和细胞跟踪来表征数百微米至毫米级细胞群的运动性和行为。该测定表明，在再生丢失的口腔器械时， Stentor coeruleus 通过四个行为上不同的阶段过渡。

摘要

鞘翅目 是一种著名的单细胞再生研究模式生物。单个细胞的转录组学分析揭示了数百个基因 - 许多与口腔器官（OA）无关 - 这些基因在整个再生过程中的各个阶段受到差异调节。据推测，这种系统性重组和细胞资源向新OA生长的动员将导致运动和行为的可观察到的变化，这些变化与差异基因表达的各个阶段相对应。然而， Coeruleus 的形态复杂性使得有必要开发一种测定方法来捕获统计数据和时间尺度。使用自定义脚本在短视频中跟踪细胞，并在大量群体（N ~100）上编译统计数据。在OA丧失后， 科鲁勒斯链球菌 最初失去定向运动的能力;然后从~4小时开始，它表现出速度的显着下降，直到〜8小时。该测定法为筛选运动表型提供了有用的工具，并且可以适用于其他生物体的研究。

引言

Stentor coeruleus （Stentor）是一种众所周知的模式生物，由于其体积大，能够承受多种显微外科技术并且易于在实验室环境中培养，因此已被用于研究单细胞再生^1，2，3。早期的再生研究集中在 Stentor中最大和形态上最独特的特征 - OA - 它在化学休克^4，5，6时完全脱落。从 头 替换丢失的OA始于新膜束带的出现 - 一组纤毛，在八个形态阶段形成功能性OA之前逐渐向细胞前部移动³。无论温度如何，这些阶段都是按顺序观察到的，并为几乎所有研究提供了通用参考点⁵。

Stentor再生的机械分析需要用于测量再生时间的工具，这些工具足够坚固且简单，可以作为化学或分子筛选的一部分应用于多个样品。进行基于细胞的测定的标准方法是成像，在这种情况下，在再生过程中成像新OA的形成。然而，当再生结构包含可用作标记物的不同分子组分时，这种基于成像的测定是最有效的，因此它们很容易在荧光图像中检测到。在Stentor OA的情况下，已知的成分（纤毛，基底体）也存在于细胞表面的其余部分;因此，识别OA的恢复不能仅仅通过寻找组件的存在与否来实现。

相反，需要某种形式的形状识别来检测OA，鉴于 Stentor 细胞经常通过快速收缩过程改变形状，这可能非常具有挑战性。本文提出了一种依赖于身体和OA纤毛的运动活性的再生替代测定方法。随着OA的再生，新形成的纤毛在位置和活性上经历可重复的变化，这反过来又会影响细胞的游动性。通过分析运动性，可以进行"功能再生"的测定，通过量化再生结构的功能来量化再生。先前对再生过程中 Stentor 纤毛功能的分析使用粒子图像测速法，结合添加到外部介质中的示踪剂珠，以观察再生不同阶段流动模式的变化⁷;然而，这种方法需要对单个细胞及其相关的流场进行费力的成像，一次一个。

通过使用细胞本身的运动作为纤毛生成流动的代理，可以使用与高通量筛选平台兼容的低分辨率成像系统并行分析大量细胞。原则上，该测定可用于研究其他游泳生物体在数百微米至毫米大小的规模的发育和功能再生。该协议的第1部分描述了多孔样品载玻片的构造，该载玻片允许在长达一整天的时间内对细胞群进行高通量成像。提供了有关如何调整以用于其他细胞类型的详细信息。该协议的第2部分涵盖了该测定的视频数据的采集，这可以在带有数字单镜头反光相机的解剖显微镜上完成。该协议的第3部分提供了使用MATLAB代码（补充信息）进行细胞跟踪和细胞速度计算的演练。该协议的第4部分解释了如何将数字结果转换为图1C-F和图2C所示的图，以便于解释结果。

研究方案

注意:根据先前发表的JoVE方案⁸培养了大约100个科鲁勒斯链球菌细胞。

1. 样品制备

1. 切割一块250μm厚的硅胶间隔片（材料表），其高度和宽度都比显微镜载玻片略小。使用 5/16" 打孔机，创建圆形孔。注意在相邻的井之间留出足够的空间，以确保良好的密封性。
   注:发现相邻井之间3毫米的空间就足够了。通过练习，可以将十口孔放置在单个样品载玻片上。
2. 通过将细胞在10%蔗糖或2%尿素中孵育2分钟来启动OA的再生（图1A）。然后，用新鲜的培养基洗涤三次⁸.轻轻地将大约十 个Stentor 移入每个孔中。注意尽可能将样品体积与孔体积相匹配。
   注意:对于此处使用的孔尺寸，将12.5μL样品移液到每个孔中。
3. 从一个边缘开始，轻轻地将一块盖玻片（参见 材料表）放在孔上，以关闭孔。使用狭窄且略微柔韧的物体（例如10 μL移液器吸头）向下压在与硅胶片接触的盖玻片上，以确保良好的密封性。

2. 可见光显微镜延时摄影

1. 将样品放在显微镜载物台上，并将放大倍率设置为可用的最低倍率，以便一个孔完全适合框架。
   注意:对于该协议，显微镜上使用1.6倍相机适配器和1倍放大倍率。
2. 开始延时摄影。在每个时间点以每秒30帧的速度采集每个孔的10秒视频。如果使用带有电动X-Y载物台的显微镜设置，请自动执行整个延时摄影。否则，请确保用户在每个时间点都在场，以手动转换样本以记录每个孔。
   注意:避免在未成像时使样品发光，以避免加热和蒸发。样品体积小，蒸发会导致气泡。
3. 将影片另存为动画、移动观看或视频。
   注意:这些是最常见的非专有视频文件类型。根据特定的显微镜软件，视频可能会默认保存为专有文件类型，但随后可以导出为上述文件类型之一。
4. 使用像素到毫米的转换因子进行物理缩放，然后执行校准或使用所用相机中的已知像素大小。要进行校准，请以与视频相同的放大倍率设置获取校准载玻片的清晰图像或清晰的标尺。使用任何图像查看程序，计算已知物理距离的标记之间的像素数。
   注意:例如，如果标尺的图像显示要用 100 像素分隔的 1 mm 标记和 2 mm 标记，则转换因子为每 100 像素 1 mm。或者，要从相机像素大小推导出此因子，只需将相机像素大小乘以放大倍率即可。例如，如果使用的相机具有3.45 μm像素，并且使用的放大倍率为1.6x，则转换为3.45 μm * 1.6 = 5.52 μm/1像素。

3. 细胞追踪

1. 将两个脚本 "跟踪细胞" 和 "清除跟踪"下载到计算机上一个易于记忆的位置。如果此计算机上尚有数据视频，请将其传输到此计算机上。
   注意:数据视频和脚本不需要位于同一文件夹中。
2. 将数据视频组织到文件夹中，每个时间点一个。首先使用脚本 "跟踪细胞"在 数据视频中执行自动细胞跟踪。打开 跟踪细胞并 运行脚本。
3. 如果弹出窗口提示，请选择" 添加到路径 "，这通常仅在首次从给定文件夹运行脚本时发生。出现提示时， 选择一个或多个数据视频以启动跟踪，导航到数据视频（第 2 部分）。通过使用 移位单击、按住 Control 单击或在文件上移动时按住 鼠标左键 以突出显示它们来选择多个视频文件。
4. 对提示窗口底部的" 文件名: "框中的文件列表感到满意后，单击" 打开"。首先对一个视频执行测试运行，以确认所有参数均已正确设置（请参阅下面的讨论）。
   注意:此脚本现在将为所选的每个视频文件创建一个文件夹。然后，它将视频的每一帧作为.jpg文件和名为 position_estimates.mat的文件写入此文件夹，其中包含视频中找到的所有痕迹。根据视频的大小、视频数量和计算机的速度，此脚本可能需要数小时才能运行。

4. 跟踪验证

1. 在继续之前，通过检查没有错误消息，验证是否正确遵循了第 3 节中描述的步骤。使用"清除跟踪".m 脚本手动拒绝异常或错误的跟踪。在 MATLAB 编辑器窗口中通过双击该文件打开"清理跟踪"。
2. 在提示符 下，通过跟踪细胞选择数据文件夹输出。它将具有与视频文件相同的名称，导航到第3节中所述创建的文件夹之一。仅选择一个文件夹。
   注意:此脚本现在将在弹出窗口中逐个显示跟踪。它们以绿色覆盖在跟踪开始的视频帧上，以洋红色表示跟踪结束的视频帧上。因此，有效的跟踪应链接绿色单元格和洋红色单元格。
3. 出现提示时，输入 1 以保留跟踪，输入 0 以拒绝跟踪。按 Enter 键转到下一个跟踪。
   注意:新跟踪将继续显示，直到不再显示跟踪或显示前 60 个跟踪。完成此过程后，脚本将自动创建一个名为 CLEAN TRACES 的文件夹，用于保存输出，并在视频的第一帧顶部显示所有剩余的跟踪（图 1B）。此图像将自动另存为 标记跟踪.png 以供将来参考。用户选择保留的所有跟踪都将保存在文件 clean_traces.mat 中。
4. 在一个时间点完成所有视频的此步骤，然后再继续。
   注:对于本手稿中的数据，在每个时间点为每口井获取了一段视频，每个时间点总共有十个视频。

5. 数据可视化

注意:为了直观地比较不同时间点内整个细胞群的运动，第4节的所有迹线都被翻译为从原点开始，并为每个时间点创建一个径向位移与时间的关系图（图1C-F，参见所有时间点的补充图S1）。

1. 首先下载标题为" 意大利面条情节"的脚本。打开并运行脚本。当弹出一个窗口文件浏览器窗口并提示 选择包含要绘制的油井数据的时间文件夹（clean_traces.mat）时，导航到其中一个时间点的文件夹。请注意，此文件夹中应包含每个分析视频的文件夹。
2. 当提示 校准:每毫米的像素数是多少？，键入步骤 2.4 中找到的校准值，然后按 Enter 键。
   注意:该脚本现在将在此时间点将所有分析视频中的迹线合并到单个图中（图1C-F）。图中淡淡的虚线圆圈表示径向位移为 1、2、3 和 4 mm。
3. 根据需要通过更改脚本的第 55 行来调整绘图的轴，默认情况下，该行设置为 rr = 4 ，以包括最大 4 mm 的半径。保存绘图。

结果

该测定的目的是量化运动模式的逐渐变化和大型（N〜100）再生Stentor群体中细胞运动速度的逐步增加。为了帮助解释结果，该协议中包含的自定义代码生成两种类型的图:一组视频数据中所有细胞运动迹线的叠加（图1C-F和图S1），以及自再生开始以来按小时划分的游泳速度图（图2C）。正常再生的Stentor?...

讨论

目前存在许多粒子和细胞跟踪算法，其中一些是完全免费的。成本和用户友好性通常是需要妥协的权衡。此外，许多现有的细胞跟踪程序被设计为跟踪组织培养细胞的缓慢爬行运动，而不是Stentor的快速游泳运动， Stentor在游泳时旋转并可能经历突然的方向变化。在测试了许多这些选项之后，这里介绍的协议旨在成为一站式解决方案，仅使用低成本设备和单个科学软件包（材料表

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m