Analisi dei modelli di motilità dello stentor durante e dopo la rigenerazione dell'apparato orale utilizzando il monitoraggio cellulare

Riepilogo

Presentiamo un protocollo per la caratterizzazione della motilità e del comportamento di una popolazione di cellule da cento micron a millimetri utilizzando la microscopia a campo luminoso e il tracciamento cellulare. Questo test rivela che Stentor coeruleus passa attraverso quattro fasi comportamentalmente distinte quando si rigenera un apparato orale perso.

Abstract

Stentor coeruleus è un noto organismo modello per lo studio della rigenerazione unicellulare. L'analisi trascrittomica delle singole cellule ha rivelato centinaia di geni, molti dei quali non associati all'apparato orale (OA), che sono regolati in modo differenziale in fasi durante tutto il processo di rigenerazione. È stato ipotizzato che questa riorganizzazione sistemica e mobilizzazione delle risorse cellulari verso la crescita di una nuova OA porterà a cambiamenti osservabili nel movimento e nel comportamento corrispondenti nel tempo alle fasi di espressione genica differenziale. Tuttavia, la complessità morfologica di S. coeruleus ha reso necessario lo sviluppo di un test per catturare le statistiche e la scala temporale. Uno script personalizzato è stato utilizzato per tracciare le celle in brevi video e le statistiche sono state compilate su una vasta popolazione (N ~ 100). Dopo la perdita dell'OA, S. coeruleus inizialmente perde la capacità di movimento diretto; quindi a partire da ~ 4 h, mostra un calo significativo della velocità fino a ~ 8 h. Questo saggio fornisce uno strumento utile per lo screening dei fenotipi di motilità e può essere adattato per lo studio di altri organismi.

Introduzione

Stentor coeruleus (Stentor) è un noto organismo modello che è stato utilizzato per studiare la rigenerazione unicellulare grazie alle sue grandi dimensioni, alla capacità di resistere a diverse tecniche microchirurgiche e alla facilità di coltura in un ambiente di laboratorio ^1,2,3. I primi studi di rigenerazione si sono concentrati sulla caratteristica più grande e morfologicamente distinta di Stentor, l'OA, che viene completamente eliminata dallo shock chimico ^4,5,6. La sostituzione de novo di un OA perso inizia con l'emergere di una nuova banda membranare, una serie di ciglia che si spostano gradualmente verso la parte anteriore della cellula prima di formare un OA funzionale su otto stadi morfologici³. Questi stadi sono stati osservati in sequenza, indipendentemente dalla temperatura, e forniscono un punto di riferimento universale per quasi tutti gli studi⁵.

L'analisi meccanicistica della rigenerazione dello stentor richiede strumenti per misurare i tempi di rigenerazione che siano robusti e abbastanza semplici da essere applicati a più campioni come parte di uno schermo chimico o molecolare. Il metodo standard per eseguire un test basato su cellule è l'imaging, in questo caso, l'imaging della formazione di nuova OA durante la rigenerazione. Tuttavia, tali saggi basati sull'imaging sono più efficaci quando la struttura rigenerante contiene componenti molecolari distinti che possono essere utilizzati come marcatori, in modo che siano facilmente rilevati in un'immagine di fluorescenza. Nel caso dello Stentor OA, i componenti noti (ciglia, corpi basali) sono presenti anche sul resto della superficie cellulare; pertanto, riconoscere il ripristino dell'OA non può essere raggiunto semplicemente cercando la presenza o l'assenza di un componente.

Piuttosto, sarebbe necessaria una qualche forma di riconoscimento della forma per rilevare un OA, e questo è potenzialmente molto impegnativo dato il fatto che le cellule Stentor spesso cambiano forma attraverso un rapido processo contrattile. Questo documento presenta un test alternativo per la rigenerazione che si basa sull'attività mobile del corpo e sulle ciglia OA. Mentre l'OA si rigenera, le ciglia appena formate subiscono cambiamenti riproducibili nella posizione e nell'attività, che a loro volta influenzano la motilità di nuoto della cellula. Analizzando la motilità, è possibile eseguire un test per la "rigenerazione funzionale" che quantifica la rigenerazione quantificando la funzione delle strutture rigenerate. La precedente analisi della funzione ciliare di Stentor durante la rigenerazione ha utilizzato la velocimetria dell'immagine delle particelle, combinata con perline traccianti aggiunte al mezzo esterno, per osservare i cambiamenti nel modello di flusso in diversi stadi di rigenerazione⁷; tuttavia, questo approccio richiede l'imaging laborioso delle singole cellule e dei loro campi di flusso associati, uno alla volta.

Utilizzando il movimento della cella stessa come proxy per il flusso generato dalle ciglia, sarebbe possibile analizzare un numero maggiore di celle in parallelo, utilizzando sistemi di imaging a bassa risoluzione compatibili con piattaforme di screening ad alto rendimento. Questo test può, in linea di principio, essere utilizzato per studiare lo sviluppo e la rigenerazione funzionale in altri organismi nuotatori nella scala da centinaia di micron a millimetri. La sezione 1 del protocollo descrive la costruzione di un vetrino campione multiwell, che consente l'imaging ad alto rendimento di una popolazione di cellule per un massimo di un giorno intero. Vengono forniti dettagli su come regolare l'uso con altri tipi di celle. La sezione 2 del protocollo copre l'acquisizione di dati video per questo test, che può essere eseguita su un microscopio a dissezione con una fotocamera reflex digitale a obiettivo singolo. La sezione 3 del protocollo fornisce una procedura dettagliata del tracciamento delle celle e del calcolo della velocità delle celle utilizzando il codice MATLAB (Informazioni supplementari). La sezione 4 del protocollo spiega come trasformare i risultati numerici in grafici come mostrato nella Figura 1C-F e nella Figura 2C per una facile interpretazione dei risultati.

Protocollo

NOTA: Una popolazione di circa cento cellule di S. coeruleus è stata coltivata in conformità con un protocollo JoVE⁸ precedentemente pubblicato.

1. Preparazione del campione

1. Tagliare un pezzo di foglio distanziatore in silicone spesso 250 μm (Table of Materials) leggermente più piccolo sia in altezza che in larghezza rispetto a un vetrino per microscopio. Utilizzando un foro da 5/16", creare pozzetti circolari. Fai attenzione a non lasciare spazio sufficiente tra i pozzi vicini per garantire una buona tenuta.
   NOTA: Uno spazio di 3 mm tra i pozzi vicini è risultato sufficiente. Con la pratica, dieci pozzetti possono essere posizionati su una singola diapositiva campione.
2. Avviare la rigenerazione dell'OA incubando le cellule in 10% di saccarosio o 2% di urea per 2 minuti (Figura 1A). Quindi, lavare tre volte con⁸ medio fresco. Pipettare delicatamente circa dieci Stentor in ciascun pozzetto. Fare attenzione ad abbinare il volume del campione al volume del pozzo il più vicino possibile.
   NOTA: per le dimensioni del pozzo utilizzate qui, 12,5 μL di campione sono stati pipettati in ciascun pozzetto.
3. Chiudere i pozzetti abbassando delicatamente un pezzo di vetro di copertura (vedi Tabella dei materiali) sui pozzetti partendo da un bordo. Utilizzare un oggetto stretto e leggermente flessibile, come una punta della pipetta da 10 μL, per premere verso il basso sul vetro di copertura dove entra in contatto con il foglio di silicone, per garantire una buona tenuta.

2. Time-lapse della microscopia a luce visibile

1. Posizionare il campione sul palco del microscopio e impostare l'ingrandimento al più basso disponibile in modo tale che uno si adatti bene al fotogramma nella sua interezza.
   NOTA: un adattatore per fotocamera 1,6x e un ingrandimento 1x sull'obiettivo sono stati utilizzati sul microscopio per questo protocollo.
2. Inizia time-lapse. Acquisisci un video da 10 s a 30 fotogrammi al secondo di ogni pozzo in ogni punto temporale. Se si utilizza una configurazione del microscopio con uno stadio X-Y motorizzato, automatizzare l'intero time-lapse. In caso contrario, assicurarsi che un utente sia presente in ogni punto temporale per tradurre manualmente il campione per registrare ogni pozzo.
   NOTA: evitare di lasciare il campione illuminato quando non si esegue l'imaging per evitare il riscaldamento e l'evaporazione. I volumi del campione sono piccoli e l'evaporazione porterà a bolle d'aria.
3. Salva filmati come TIFF, MOV o AVI.
   NOTA: questi sono i tipi di file video non proprietari più comuni. A seconda del software specifico del microscopio, i video possono essere salvati per impostazione predefinita in un tipo di file proprietario, ma possono essere esportati in uno dei tipi di file di cui sopra.
4. Utilizzare un fattore di conversione da pixel a millimetro per la scala fisica ed eseguire una calibrazione o utilizzare le dimensioni dei pixel note dalla fotocamera utilizzata. Per calibrare, acquisisci un'immagine chiara di una diapositiva di calibrazione o di un righello chiaro con le stesse impostazioni di ingrandimento dei video. Utilizzando qualsiasi programma di visualizzazione delle immagini, contare il numero di pixel tra i segni di una distanza fisica nota.
   NOTA: ad esempio, se l'immagine di un righello mostra il segno di 1 mm e il segno di 2 mm separati da 100 pixel, il fattore di conversione è 1 mm per 100 pixel. In alternativa, per derivare questo fattore dalle dimensioni dei pixel della fotocamera, è sufficiente moltiplicare la dimensione dei pixel della fotocamera per l'ingrandimento. Ad esempio, se la fotocamera utilizzata ha pixel da 3,45 μm e l'ingrandimento utilizzato è stato di 1,6x, la conversione è 3,45 μm * 1,6 = 5,52 μm per 1 pixel.

3. Tracciamento delle cellule

1. Scaricare i due script, TrackCells.m e CleanTraces.m, in una posizione facile da ricordare sul computer. Se i video dei dati non sono già su questo computer, trasferiscili su questo computer.
   NOTA: non è necessario che i video dei dati e gli script si trovino nella stessa cartella.
2. Organizza i video dei dati in cartelle, una per ogni timepoint. Utilizzare prima lo script TrackCells.m per eseguire il tracciamento automatico delle celle nei video dei dati. Aprire TrackCells.m ed eseguire lo script.
3. Scegliere Aggiungi al percorso se richiesto da una finestra popup., che in genere si verifica solo quando lo script viene eseguito per la prima volta da una determinata cartella. Quando richiesto, selezionare uno o più video di dati per avviare il monitoraggio, passare ai video di dati (sezione 2). Selezionare più file video utilizzando maiusc-clic, ctrl-clic o tenendo premuto il pulsante sinistro del mouse mentre si sposta sui file per evidenziarli.
4. Una volta soddisfatto dell'elenco dei file nella casella Nome file: nella parte inferiore della finestra del prompt, fare clic su Apri. Esegui prima un test su un video per confermare che tutti i parametri siano impostati correttamente (vedi discussione di seguito).
   NOTA: questo script creerà ora una cartella per ogni file video scelto. Scriverà quindi in questa cartella ogni fotogramma del video come un file .jpg e un file chiamato position_estimates.mat, che contiene tutte le tracce trovate nel video. A seconda delle dimensioni dei video, del numero di video e della velocità del computer, l'esecuzione di questo script può richiedere ore.

4. Verifica delle tracce

1. Verificare che i passaggi descritti nella sezione 3 siano stati seguiti correttamente verificando che non vi siano messaggi di errore prima di procedere. Utilizzare lo script CleanTraces.m per rifiutare manualmente tracce anomale o false. Apri CleanTraces.m nella finestra dell'editor MATLAB facendo doppio clic sul file.
2. Al prompt Selezionare l'output della cartella dati da TrackCells.m. Avrà lo stesso nome del file video, passare a una delle cartelle create come descritto nella sezione 3. Scegli una sola cartella.
   NOTA: questo script visualizzerà ora le tracce una per una in una finestra pop-up. Sono sovrapposti sul fotogramma del video dove inizia la traccia, in verde, e sul fotogramma del video dove termina la traccia, in magenta. Pertanto, una traccia valida dovrebbe collegare una cella verde e una cella magenta.
3. Quando richiesto, immettere 1 per mantenere la traccia e 0 per rifiutare la traccia. Premere INVIO per passare alla traccia successiva.
   NOTA: le nuove tracce continueranno a essere visualizzate fino a quando non ci saranno più tracce o non saranno state mostrate le prime sessanta. Al termine di questo processo, lo script creerà automaticamente una cartella denominata CLEAN TRACES per salvare gli output e visualizzerà tutte le tracce rimanenti sopra il primo fotogramma del video (Figura 1B). Questa immagine viene salvata automaticamente come LabeledTraces.png per riferimento futuro. Tutte le tracce che l'utente ha scelto di conservare verranno salvate nel file clean_traces.mat.
4. Completa questo passaggio per tutti i video in un punto temporale prima di continuare.
   NOTA: Per i dati in questo manoscritto, è stato acquisito un video per ogni pozzo in ogni punto temporale, per un totale di dieci video per timepoint.

5. Visualizzazione dei dati

NOTA: Per confrontare visivamente la motilità dell'intera popolazione cellulare in diversi punti temporali, tutte le tracce della sezione 4 sono state tradotte per iniziare dall'origine e creare uno spostamento radiale rispetto al grafico temporale per ogni punto temporale (Figura 1C-F, vedere Figura supplementare S1 per tutti i punti temporali).

1. Inizia scaricando lo script intitolato SpaghettiPlots.m. Aprire ed eseguire lo script. Quando viene visualizzata una finestra del browser di file di finestra con il prompt Seleziona cartella temporale contenente dati di pozzo (clean_traces.mat) per il grafico, passare alla cartella di uno dei punti temporali. Si noti che questa cartella dovrebbe contenere al suo interno una cartella per ciascuno dei video analizzati.
2. Quando viene richiesto Calibrazione: qual è il numero di pixel per millimetro?, digitare il valore di calibrazione trovato nel passaggio 2.4 e premere INVIO.
   NOTA: lo script ora combinerà le tracce di tutti i video analizzati in questo momento in un unico plottaggio (Figura 1C-F). Deboli cerchi punteggiati nella trama indicano spostamenti radiali di 1, 2, 3 e 4 mm.
3. Regolate gli assi del plottaggio in base alle esigenze modificando la riga 55 dello script, che per impostazione predefinita è impostata su rr = 4 per includere un raggio fino a 4 mm. Salva la trama.

Risultati

L'obiettivo di questo test è quantificare il graduale cambiamento dei modelli di movimento e l'aumento graduale della velocità di movimento dalle cellule all'interno di una grande (N ~ 100) popolazione di Stentor rigenerante. Per facilitare l'interpretazione dei risultati, il codice personalizzato incluso in questo protocollo genera due tipi di grafici: una sovrapposizione di tutte le tracce di movimento cellulare in una serie di dati video (Figura 1C-F

Discussione

Attualmente esistono molti algoritmi di tracciamento di particelle e cellule, alcuni completamente gratuiti. Il costo e la facilità d'uso sono spesso compromessi che richiedono un compromesso. Inoltre, molti dei programmi di tracciamento cellulare esistenti sono progettati per tracciare il movimento lento di strisciamento delle cellule di coltura tissutale, piuttosto che il movimento di nuoto veloce di Stentor, che ruota durante il nuoto e può subire improvvisi cambiamenti di direzione. Dopo aver testato molte...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m