細胞追跡を用いた口腔装置再生中および再生後の ステント の運動性パターンの解析

要約

我々は、明視野顕微鏡法および細胞追跡を用いて、百ミクロンからミリメートルサイズの細胞集団の運動性および挙動の特性評価のためのプロトコルを提示する。このアッセイは、 ステンター・コエルルスが 失われた口腔装置を再生する際に、4つの行動的に異なる段階を経て遷移することを明らかにする。

要約

Stentor coeruleus は、単細胞再生の研究のためのよく知られているモデル生物である。個々の細胞のトランスクリプトーム解析により、再生プロセス全体を通して段階的に差次的に調節される何百もの遺伝子(多くは口腔装置(OA)と関連していない)が明らかになった。新しいOAの成長に向けた細胞資源のこの全身的な再編成と動員は、異なる遺伝子発現の段階に対応する動きと行動の観察可能な変化をもたらすという仮説が立てられた。しかし、 S. coeruleus の形態学的複雑さは、統計と時間スケールを捉えるためのアッセイの開発を必要とした。カスタムスクリプトを使用して短いビデオのセルを追跡し、統計は大規模な人口(N〜100)にわたってコンパイルされました。OAが失われると、 S. coeruleus は最初に指向性運動の能力を失う。その後、〜4時間から始まり、〜8時間まで速度の大幅な低下を示す。このアッセイは、運動性表現型のスクリーニングに有用なツールを提供し、他の生物の調査に適合させることができる。

概要

Stentor coeruleus(Stentor)は、その大きなサイズ、いくつかの顕微外科的技術に耐える能力、および実験室環境での培養の容易さのために単細胞再生を研究するために使用されているよく知られているモデル生物である^1,2,3。初期の再生研究は、Stentorの最大かつ最も形態学的に異なる特徴であるOAに焦点を当てており、これは化学ショック^4,5,6で完全に放出される。失われたOAのDe novo置換は、新しい膜帯(8つの形態学的段階にわたって機能的なOAを形成する前に細胞の前部に向かって徐々にシフトする繊毛の配列)の出現から始まる³。これらの段階は、温度に関係なく順次観察されており、ほぼすべての研究に普遍的な基準点を提供しています⁵。

ステンター再生の機構的分析には、再生のタイミングを測定するためのツールが必要であり、化学的または分子的スクリーンの一部として複数のサンプルに適用するのに十分堅牢で簡単です。細胞ベースのアッセイを行うための標準的な方法は、イメージングであり、この場合、再生中の新しいOAの形成をイメージングする。しかし、このようなイメージングベースのアッセイは、再生構造がマーカーとして使用できる別個の分子成分を含む場合に最も効果的であり、蛍光画像で容易に検出される。ステンターOAの場合、既知の成分(繊毛、基底体)も細胞表面の残りの部分に存在する。したがって、OA の復元を認識することは、コンポーネントの有無を探すだけでは達成できません。

むしろ、OAを検出するには何らかの形の形状認識が必要であり、 ステンター 細胞がしばしば急速な収縮プロセスを介して形状を変化させるという事実を考えると、これは潜在的に非常に困難である。この論文は、身体およびOA繊毛の運動活性に依存する再生のための代替アッセイを提示する。OAが再生するにつれて、新たに形成された繊毛は位置および活動において再現可能な変化を受け、これは次に、細胞の遊泳運動性に影響を及ぼす。運動性を解析することにより、再生構造の機能を定量化して再生を定量化する「機能再生」のアッセイを行うことができる。再生中の ステンター 毛様体機能の以前の解析では、粒子画像速度測定を外部媒体に添加したトレーサービーズと組み合わせて、再生のさまざまな段階での流れパターンの変化を観察しました⁷。しかし、このアプローチでは、個々の細胞とそれに関連する流れ場を一度に1つずつ手間のかかるイメージングが必要です。

細胞自体の動きを繊毛生成フローのプロキシとして使用することで、ハイスループットスクリーニングプラットフォームと互換性のある低解像度イメージングシステムを使用して、より多くの細胞を並行して解析することが可能になります。このアッセイは、原理的には、数百ミクロンからミリメートルのサイズのスケールで他の遊泳生物の発達および機能的再生を研究するために使用することができる。プロトコルのセクション1は、マルチウェルサンプルスライドの構築について説明しており、これにより、最大1日にわたる細胞集団のハイスループットイメージングが可能になります。他の細胞型で使用するために調整する方法の詳細が提供されています。プロトコルのセクション2は、このアッセイのためのビデオデータの取得をカバーしており、これはデジタル一眼レフカメラを備えた解剖顕微鏡上で達成することができる。プロトコルのセクション 3 では、MATLAB コード (補足情報) を使用したセル追跡とセル速度計算のチュートリアルを提供します。プロトコルのセクション4では、結果を簡単に解釈できるように、図1C-Fおよび図2Cに示すように、数値結果をプロットに変換する方法について説明します。

プロトコル

注:約100の S. coeruleus 細胞の集団を、以前に公開されたJoVEプロトコル⁸に従って培養した。

1. サンプル調製

1. 厚さ250μmのシリコーンスペーサーシート(材料表)を顕微鏡スライドよりも高さと幅の両方でわずかに小さく切ります。5/16インチの穴を開けて、円形の井戸を作ります。良好なシールを確保するために、隣接する井戸の間に十分なスペースを残すように注意してください。
   注:隣接する井戸間の3mmのスペースで十分であることが判明しました。練習すると、1つのサンプルスライドに10個のウェルを置くことができます。
2. 細胞を10%スクロースまたは2%尿素中で2分間インキュベートすることによって、OAの再生を開始する(図1A)。その後、新鮮な培地8で3回洗浄^する。各ウェルに約10 個のステンター を静かにピペットで入れる。サンプル量とウェル量をできるだけ近づけるように注意してください。
   注:ここで使用したウェル寸法については、12.5 μLのサンプルを各ウェルにピペットで固定しました。
3. 片方の端からウェルの上にカバーガラス( 材料表を参照)を静かに下げて、ウェルを閉じます。10 μL のピペットチップなど、狭くてやや柔軟なものを使用して、カバーグラスを押し下げてシリコーンシートに接触させ、良好なシールを確保します。

2. 可視光顕微鏡タイムラプス

1. サンプルを顕微鏡ステージに置き、1つがフレーム全体に収まるように倍率を可能な限り低く設定します。
   注:このプロトコルでは、顕微鏡では1.6倍のカメラアダプターと対物レンズの倍率1倍が使用されました。
2. タイムラプスを開始します。各時点で各ウェルの毎秒30フレームで10秒のビデオを取得します。電動X-Yステージで顕微鏡セットアップを使用する場合は、タイムラプス全体を自動化します。それ以外の場合は、各時点にユーザーがいることを確認し、サンプルを手動で翻訳して各ウェルを記録します。
   メモ:イメージングを行わないときは、加熱や蒸発を避けるためにサンプルを点灯させたままにしないでください。サンプル量は少なく、蒸発は気泡につながります。
3. 映画を TIFF、MOV、または AVI として保存します。
   注:これらは最も一般的な非独占的なビデオファイルタイプです。特定の顕微鏡ソフトウェアに応じて、ビデオはデフォルトで独自のファイルタイプに保存されますが、前述のファイルタイプのいずれかにエクスポートできます。
4. 物理的なスケールにはピクセルからミリメートルへの変換係数を使用し、キャリブレーションを実行するか、使用するカメラから既知のピクセルサイズを使用します。キャリブレーションするには、キャリブレーションスライドまたはクリアルーラーの鮮明な画像をビデオと同じ倍率設定で取得します。任意の画像表示プログラムを使用して、既知の物理的距離のマーク間のピクセル数を数えます。
   メモ: たとえば、定規の画像に 1 mm マークと 2 mm マークが 100 ピクセルずつ区切られている場合、変換係数は 100 ピクセルあたり 1 mm です。または、カメラのピクセルサイズからこの係数を導き出すには、単にカメラのピクセルサイズに倍率を掛けます。たとえば、使用するカメラのピクセル数が 3.45 μm で、使用倍率が 1.6 倍の場合、変換は 1 ピクセルあたり 3.45 μm * 1.6 = 5.52 μm になります。

3. 細胞追跡

1. TrackCells.m と CleanTraces.m の 2 つのスクリプトを、コンピューター上の覚えやすい場所にダウンロードします。データビデオがこのコンピュータにまだない場合は、このコンピュータに転送します。
   注: データ ビデオとスクリプトは、同じフォルダーにある必要はありません。
2. データビデオを、各時点に1つずつフォルダに整理します。最初にスクリプト TrackCells.m を使用して、データ ビデオで自動セル追跡を実行します。 TrackCells.m を開き、スクリプトを実行します。
3. ポップアップウィンドウのプロンプトが表示されたら 、[パスに追加 ]を選択します。これは通常、スクリプトが特定のフォルダから初めて実行されるときにのみ発生します。プロンプトが表示されたら、[ 1つ以上のデータビデオ]を選択して追跡を開始し、データビデオに移動します(セクション2)。複数のビデオファイルを選択するには 、Shift キーを押しながらクリックするか、Ctrl キーを押しながらクリックするか、 マウスの左ボタンを押し ながらファイル上を移動してハイライト表示します。
4. プロンプトウィンドウの下部にある[ ファイル名: ]ボックスのファイルのリストに満足したら、[ 開く]をクリックします。最初に1つのビデオでテスト実行を行い、すべてのパラメータが正しく設定されていることを確認します(以下の説明を参照)。
   注:このスクリプトは、選択した各ビデオファイルのフォルダを作成します。次に、ビデオの各フレームが.jpgファイルとしてこのフォルダに書き込まれ、 position_estimates.matという名前のファイル(ビデオで見つかったすべてのトレースが含まれます)が書き込まれます。ビデオのサイズ、ビデオの数、およびコンピューターの速度によっては、このスクリプトの実行に数時間かかることがあります。

4. トレース検証

1. 先に進む前に、エラー・メッセージがないことを確認して、セクション 3 で説明されているステップが正しく実行されたことを確認します。CleanTraces.m スクリプトを使用して、異常または偽のトレースを手動で拒否します。ファイルをダブルクリックして、MATLABエディタウィンドウでCleanTraces.mを開きます。
2. プロンプトで TrackCells.mによって出力されたデータフォルダを選択します。ビデオファイルと同じ名前になり、セクション3の説明に従って作成されたフォルダの1つに移動します。フォルダを 1 つだけ選択します。
   注: このスクリプトは、ポップアップ ウィンドウにトレースを 1 つずつ表示するようになりました。これらは、トレースが開始されるビデオのフレームに緑色で、トレースが終了するビデオのフレームにマゼンタでオーバーレイされます。したがって、有効なトレースは、緑色のセルとマゼンタのセルをリンクする必要があります。
3. プロンプトが出されたら、トレースを保持するには 1 を入力し、トレースをリジェクトするには 0 を入力します。 Enter キーを押して、次のトレースに進みます。
   メモ: 新しいトレースは、トレースがなくなるか、最初の 60 個が表示されるまで表示され続けます。このプロセスが完了すると、スクリプトは出力を保存するための CLEAN TRACESという名前の フォルダを自動的に作成し、残りのすべてのトレースをビデオの最初のフレームの上に表示します(図1B)。このイメージは、後で参照できるように .png LabeledTraces として自動的に保存されます。ユーザーが保持することを選択したすべてのトレースは、 clean_traces.mat ファイルに保存されます。
4. 続行する前に、すべてのビデオについてこの手順を1つの時点で完了します。
   注:本稿のデータでは、各時点において各井戸について1つのビデオが取得され、各時点ごとに合計10本のビデオが取得されました。

5. データの可視化

注: 異なる時点にわたる細胞集団全体の運動性を視覚的に比較するために、セクション 4 からのすべてのトレースを原点から開始し、各時点に対して 1 つの放射状変位対時間プロットを作成します (図 1C-F、すべての時点について補足図 S1 を参照)。

1. まず、 SpaghettiPlots.mというタイトルのスクリプトをダウンロードします。スクリプトを開いて実行します。ウィンドウファイルブラウザウィンドウがポップアップし、 グラフ化する井戸データ(clean_traces.mat)を含む時間フォルダの選択プロンプトが表示されたら、いずれかのタイムポイントのフォルダに移動します。このフォルダには、分析された各ビデオのフォルダが含まれている必要があります。
2. キャリブレーションのプロンプトが表示されたら、 ミリメートルあたりのピクセル数はいくつですか?ステップ2.4で見つけたキャリブレーション値を入力し、 Enter キーを押します。
   注: スクリプトは、この時点で分析されたすべてのビデオのトレースを 1 つのプロットに結合します (図 1C-F)。プロット内のかすかな点線の円は、1、2、3、および 4 mm の半径方向の変位を示します。
3. 必要に応じてプロットの軸を調整するには、スクリプトの 55 行目 (デフォルトでは、最大 4 mm の半径を含める場合は rr = 4 に設定されています) を変更します。プロットを保存します。

結果

このアッセイの目的は、大きな(N〜100)再生ステンター集団内の細胞からの移動パターンの漸進的な変化および移動速度の段階的増加を定量化することである。結果の解釈を支援するために、このプロトコルに含まれるカスタムコードは、ビデオデータのセット内のすべての細胞移動トレースのオーバーレイ(図1C-Fおよび図S1)と、再生開始からの時?...

ディスカッション

現在、多くの粒子および細胞追跡アルゴリズムが存在し、一部は完全に無料です。コストと使いやすさは、多くの場合、妥協を必要とするトレードオフです。さらに、既存の細胞追跡プログラムの多くは、水泳中に回転し、突然の方向転換を受ける可能性がある Stentorの高速水泳運動ではなく、組織培養細胞のゆっくりとした這う動きを追跡するように設計されています。これらのオ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m
MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m
Microscope with camera port			We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E
Pasteurized Spring Water	Carolina	132458
TAP Growth Media	ThermoFisher Scientific	A1379801	Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center