Análise dos padrões de motilidade do Stentor durante e após a regeneração do aparelho oral usando rastreamento celular

Resumo

Apresentamos um protocolo para a caracterização da motilidade e comportamento de uma população de cem células de tamanho mícnico a milímetro usando microscopia de campo brilhante e rastreamento celular. Este ensaio revela que Stentor coeruleus transita por quatro fases comportamentalmente distintas ao regenerar um aparelho oral perdido.

Resumo

Stentor coeruleus é um organismo modelo bem conhecido para o estudo da regeneração unicelular. A análise transcriômica de células individuais revelou centenas de genes — muitos não associados ao aparelho oral (OA) — que são regulados diferencialmente em fases ao longo do processo de regeneração. Foi a hipótese de que essa reorganização sistêmica e mobilização de recursos celulares para o crescimento de um novo OA levará a mudanças observáveis de movimento e comportamento correspondentes no tempo às fases da expressão genética diferencial. No entanto, a complexidade morfológica de S. coeruleus exigiu o desenvolvimento de um ensaio para capturar as estatísticas e a escala de tempo. Um script personalizado foi usado para rastrear células em vídeos curtos, e as estatísticas foram compiladas sobre uma grande população (N ~100). Após a perda do OA, S. coeruleus inicialmente perde a capacidade de movimento direcionado; em seguida, a partir de ~4 h, ele exibe uma queda significativa na velocidade até ~8 h. Este ensaio fornece uma ferramenta útil para a triagem de fenótipos de motilidade e pode ser adaptado para a investigação de outros organismos.

Introdução

Stentor coeruleus (Stentor) é um organismo modelo bem conhecido que tem sido usado para estudar a regeneração unicelular devido ao seu grande tamanho, capacidade de suportar várias técnicas microcirúrgicas e facilidade de cultivo em um ambiente de laboratório ^1,2,3. Os primeiros estudos de regeneração concentraram-se na maior e mais morfologicamente distinta característica em Stentor — o OA — que é completamente derramado após choque químico ^4,5,6. A substituição de novo de um OA perdido começa com o surgimento de uma nova faixa membranalar — uma matriz de cílios que gradualmente se deslocam para o anterior da célula antes de formar um OA funcional ao longo de oito estágios morfológicos³. Esses estágios têm sido observados sequencialmente, independentemente da temperatura, e fornecem um ponto de referência universal para quase todos os estudos⁵.

A análise mecanicista da regeneração de Stentor requer ferramentas para medir o tempo de regeneração que são robustas e simples o suficiente para serem aplicadas a múltiplas amostras como parte de uma tela química ou molecular. O método padrão para a realização de um ensaio baseado em células é a imagem, neste caso, de imagem da formação de novo OA durante a regeneração. No entanto, tais ensaios baseados em imagens são mais eficazes quando a estrutura regeneradora contém componentes moleculares distintos que podem ser usados como marcadores, de modo que eles seriam facilmente detectados em uma imagem de fluorescência. No caso do Stentor OA, os componentes conhecidos (cílios, corpos basais) também estão presentes no resto da superfície celular; portanto, reconhecer a restauração do OA não pode ser alcançado simplesmente procurando a presença ou ausência de um componente.

Em vez disso, alguma forma de reconhecimento de forma seria necessária para detectar um OA, e isso é potencialmente muito desafiador dado o fato de que as células Stentor muitas vezes mudam de forma através de um processo de contração rápida. Este artigo apresenta um ensaio alternativo para a regeneração que se baseia na atividade motil do corpo e da OA cilia. À medida que o OA se regenera, os cílios recém-formados sofrem mudanças reprodutíveis de posição e atividade, o que, por sua vez, afeta a motilidade de natação da célula. Analisando a motilidade, é possível realizar um ensaio para a "regeneração funcional" que quantifica a regeneração quantificando a função das estruturas regeneradas. Análise prévia da função ciliária de Stentor durante a regeneração usou velocimetria de imagem de partículas, combinada com contas de rastreador adicionadas à mídia externa, para observar mudanças no padrão de fluxo em diferentes estágios de regeneração⁷; no entanto, essa abordagem requer imagens laboriosas de células individuais e seus campos de fluxo associados, um de cada vez.

Usando o movimento da própria célula como um proxy para o fluxo gerado por cílios, seria possível analisar um número maior de células em paralelo, usando sistemas de imagem de baixa resolução compatíveis com plataformas de triagem de alto rendimento. Este ensaio pode, em princípio, ser usado para estudar o desenvolvimento e a regeneração funcional em outros organismos de natação nas centenas de mícrons a milímetros de tamanho. A seção 1 do protocolo descreve a construção de um slide de amostra de vários poços, que permite imagens de alto rendimento de uma população de células ao longo de um dia inteiro. Detalhes são fornecidos sobre como ajustar para uso com outros tipos de células. A seção 2 do protocolo abrange a aquisição de dados de vídeo para este ensaio, que pode ser realizado em um microscópio de dissecção com uma câmera reflexo de lente única digital. A seção 3 do protocolo fornece um passo-a-passo do rastreamento celular e cálculo da velocidade celular usando o código MATLAB (Informações Suplementares). A seção 4 do protocolo explica como transformar os resultados numéricos em parcelas como mostrado na Figura 1C-F e Figura 2C para fácil interpretação dos resultados.

Protocolo

NOTA: Uma população de aproximadamente cem células S. coeruleus foram cultivadas de acordo com um protocolo JoVE publicado anteriormente⁸.

1. Preparação da amostra

1. Corte um pedaço de 250 μm de espessura da folha espaçadora de silicone (Tabela de Materiais) ligeiramente menor em altura e largura do que um slide de microscópio. Usando um furo de 5/16", crie poços circulares. Tenha cuidado de deixar espaço suficiente entre os poços vizinhos para garantir um bom selo.
   NOTA: Um espaço de 3 mm entre os poços vizinhos foi suficiente. Com a prática, dez poços podem ser colocados em um único slide de amostra.
2. Iniciar a regeneração de OA incubando as células em 10% de sacarose ou 2% de ureia por 2 min (Figura 1A). Em seguida, lave três vezes com meio^{fresco 8}. Pipeta suavemente aproximadamente dez Stentor em cada poço. Tenha cuidado em combinar o volume da amostra com o volume do poço o mais próximo possível.
   NOTA: Para as dimensões do poço utilizadas aqui, 12,5 μL de amostra foram pipetos em cada poço.
3. Feche os poços baixando suavemente um pedaço de vidro de cobertura (ver Tabela de Materiais) sobre os poços a partir de uma borda. Use um objeto estreito e ligeiramente flexível, como uma ponta de pipeta de 10 μL, para pressionar a tampa onde entra em contato com a folha de silicone, para garantir uma boa vedação.

2. Microscopia de luz visível lapso de tempo

1. Coloque a amostra no estágio do microscópio e coloque a ampliação para o mais baixo disponível, de tal forma que se encaixe em quadro em sua totalidade.
   NOTA: Um adaptador de câmera de 1,6x e uma ampliação de 1x no objetivo foram utilizados no microscópio para este protocolo.
2. Comece o lapso de tempo. Adquira um vídeo de 10 s a 30 quadros por segundo de cada poço em cada ponto de tempo. Se usar uma configuração de microscópio com um estágio X-Y motorizado, automatize todo o lapso de tempo. Caso contrário, certifique-se de que um usuário esteja presente em cada ponto de tempo para traduzir manualmente a amostra para gravar cada poço.
   NOTA: Evite deixar a amostra iluminada quando não estiver por imagem para evitar aquecimento e evaporação. Os volumes amostrais são pequenos, e a evaporação levará a bolhas de ar.
3. Salve filmes como TIFF, MOV ou AVI.
   NOTA: Estes são os tipos de arquivos de vídeo não proprietários mais comuns. Dependendo do software de microscópio específico, os vídeos podem ser salvos por padrão para um tipo de arquivo proprietário, mas podem ser exportados para um dos tipos de arquivo supracitados.
4. Use um fator de conversão pixel a milímetro para escala física e realize uma calibração ou use o tamanho de pixel conhecido da câmera usada. Para calibrar, adquira uma imagem clara de um slide de calibração ou uma régua clara nas mesmas configurações de ampliação que os vídeos. Usando qualquer programa de visualização de imagens, conte o número de pixels entre marcas de uma distância física conhecida.
   NOTA: Por exemplo, se a imagem de uma régua mostrar a marca de 1 mm e a marca de 2 mm a ser separada por 100 pixels, o fator de conversão é de 1 mm por 100 pixels. Alternativamente, para derivar esse fator do tamanho do pixel da câmera, basta multiplicar o tamanho do pixel da câmera pela ampliação. Por exemplo, se a câmera usada tem 3,45 μm pixels, e a ampliação usada foi de 1,6x, então a conversão é de 3,45 μm * 1,6 = 5,52 μm por 1 pixel.

3. Rastreamento de células

1. Baixe os dois scripts, TrackCells.m e CleanTraces.m, para um local fácil de lembrar no computador. Se os vídeos de dados ainda não estiverem neste computador, transfira-os para este computador.
   NOTA: Os vídeos de dados e os scripts não precisam estar na mesma pasta.
2. Organize vídeos de dados em pastas, um para cada ponto de tempo. Use o script TrackCells.m primeiro para executar o rastreamento automatizado de células nos vídeos de dados. Abra TrackCells.m e execute o script.
3. Escolha Adicionar ao caminho se solicitado por uma janela pop-up., o que normalmente só acontecerá quando o script for executado pela primeira vez a partir de uma determinada pasta. Quando solicitado, selecione um ou mais vídeos de dados para iniciar o rastreamento, navegue até os vídeos de dados (seção 2). Selecione vários arquivos de vídeo usando shift-click, control-click ou segurando o botão do mouse esquerdo enquanto se move sobre os arquivos para realizá-los.
4. Uma vez satisfeito com a lista de arquivos no nome do arquivo: caixa na parte inferior da janela prompt, clique em Abrir. Realize um teste executado em um vídeo primeiro para confirmar que todos os parâmetros estão definidos corretamente (veja a discussão abaixo).
   NOTA: Este script agora criará uma pasta para cada arquivo de vídeo escolhido. Em seguida, ele escreverá nesta pasta cada quadro do vídeo como um arquivo .jpg e um arquivo chamado position_estimates.mat, que contém todos os traços encontrados no vídeo. Dependendo do tamanho dos vídeos, do número de vídeos e da velocidade do computador, este script pode levar horas para ser executado.

4. Verificação de rastreamento

1. Verifique se as etapas descritas na seção 3 foram seguidas corretamente verificando se não há mensagens de erro antes de prosseguir. Use o script CleanTraces.m para rejeitar manualmente traços anômalos ou falsos. Abra o CleanTraces.m na janela do editor MATLAB clicando duas vezes no arquivo.
2. No prompt Selecione a saída da pasta de dados pelo TrackCells.m. Ele terá o mesmo nome do arquivo de vídeo, navegará até uma das pastas criadas conforme descrito na seção 3. Escolha apenas uma pasta.
   NOTA: Este script agora exibirá os traços um por um em uma janela pop-up. Eles são sobrepostos na moldura do vídeo onde o traço começa, em verde, e o quadro do vídeo onde o traço termina, em magenta. Portanto, um traço válido deve ligar uma célula verde e uma célula magenta.
3. Quando solicitado, entre 1 para manter o rastro e 0 para rejeitar o rastro. Pressione Enter para passar para o próximo traço.
   NOTA: Novos traços continuarão a ser exibidos até que não haja mais vestígios, ou os primeiros sessenta tenham sido mostrados. Quando esse processo estiver concluído, o script criará automaticamente uma pasta chamada CLEAN TRACES para salvar as saídas e exibirá todos os vestígios restantes na parte superior do primeiro quadro do vídeo (Figura 1B). Esta imagem é salva automaticamente como LabeledTraces.png para referência futura. Todos os traços que o usuário optou por manter serão salvos no arquivo clean_traces.mat.
4. Complete esta etapa para todos os vídeos em um momento antes de continuar.
   NOTA: Para os dados deste manuscrito, um vídeo foi adquirido para cada poço em cada ponto de tempo, para um total de dez vídeos por ponto de tempo.

5. Visualização de dados

NOTA: Para comparar visualmente a motilidade de toda a população celular em diferentes pontos de tempo, todos os traços da seção 4 foram traduzidos para começar na origem e criar um deslocamento radial versus um período de tempo para cada ponto de tempo (Figura 1C-F, ver Figura Suplementar S1 para todos os pontos de tempo).

1. Comece baixando o roteiro intitulado SpaghettiPlots.m. Abra e execute o roteiro. Quando uma janela do navegador de arquivo de janela aparecer com a pasta de tempo select prompt contendo dados de poços (clean_traces.mat) para gráfico, navegue até a pasta de um dos pontos de tempo. Observe que esta pasta deve conter dentro dela uma pasta para cada um dos vídeos analisados.
2. Quando solicitado Calibração: Qual é o número de pixels por milímetro?, digite o valor de calibração encontrado na etapa 2.4 e pressione Enter.
   NOTA: O script agora combinará os traços de todos os vídeos analisados neste momento em um único plot (Figura 1C-F). Círculos pontilhados fracos na trama indicam deslocamentos radiais de 1, 2, 3 e 4 mm.
3. Ajuste os eixos da trama conforme necessário alterando a linha 55 do script, que por padrão, é definido como rr = 4 para incluir um raio de até 4 mm. Guarde o enredo.

Resultados

O objetivo deste ensaio é quantificar a mudança gradual dos padrões de movimento e o aumento gradual da velocidade de movimento das células dentro de uma grande (N ~100) regenerando a população de Stentor. Para auxiliar a interpretação dos resultados, o código personalizado incluído neste protocolo gera dois tipos de parcelas: uma sobreposição de todos os traços de movimento celular em um conjunto de dados de vídeo (Figura 1C-F e

Discussão

Muitos algoritmos de rastreamento de partículas e células existem atualmente, alguns totalmente livres. Custo e simpatia do usuário são muitas vezes trocas que requerem compromisso. Além disso, muitos dos programas de rastreamento celular existentes são projetados para rastrear o movimento lento de rastreamento das células da cultura tecidual, em vez do movimento de natação rápida de Stentor, que gira durante a natação e pode sofrer mudanças repentinas de direção. Depois de testar muitas dessas op...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m
MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m
Microscope with camera port			We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E
Pasteurized Spring Water	Carolina	132458
TAP Growth Media	ThermoFisher Scientific	A1379801	Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center