Анализ паттернов подвижности стентора во время и после регенерации ротового аппарата с помощью отслеживания клеток

Резюме

Представлен протокол для характеристики подвижности и поведения популяции клеток размером от ста микрон до миллиметра с использованием микроскопии яркого поля и отслеживания клеток. Этот анализ показывает, что Stentor coeruleus переходит через четыре поведенчески различные фазы при регенерации утраченного орального аппарата.

Аннотация

Stentor coeruleus является известным модельным организмом для изучения одноклеточной регенерации. Транскриптомный анализ отдельных клеток выявил сотни генов, многие из которых не связаны с оральным аппаратом (ОА), которые дифференциально регулируются фазами на протяжении всего процесса регенерации. Была выдвинута гипотеза, что эта системная реорганизация и мобилизация клеточных ресурсов в сторону роста новой ОА приведет к наблюдаемым изменениям в движении и поведении, соответствующим по времени фазам дифференциальной экспрессии генов. Однако морфологическая сложность S. coeruleus потребовала разработки анализа для захвата статистики и временных рамок. Пользовательский скрипт использовался для отслеживания клеток в коротких видеороликах, а статистика была собрана по большой популяции (N ~ 100). При потере ОА S. coeruleus первоначально теряет способность к направленному движению; затем, начиная с ~ 4 ч, он демонстрирует значительное падение скорости до ~ 8 ч. Этот анализ обеспечивает полезный инструмент для скрининга фенотипов подвижности и может быть адаптирован для исследования других организмов.

Введение

Stentor coeruleus (Стентор) является хорошо известным модельным организмом, который был использован для изучения одноклеточной регенерации благодаря своим большим размерам, способности выдерживать несколько микрохирургических методов и простоте культивирования в лабораторных условиях ^1,2,3. Ранние исследования регенерации были сосредоточены на самой большой и наиболее морфологически отличной особенности Стентора — ОА, которая полностью исчезает при химическом шоке ^4,5,6. De novo замена потерянной ОА начинается с появления новой мембранной полосы — массива ресничек, которые постепенно смещаются к передней части клетки, прежде чем сформировать функциональную ОА в течение восьми морфологических стадий³. Эти стадии наблюдались последовательно, независимо от температуры, и обеспечивают универсальную точку отсчета почти для всех исследований⁵.

Механистический анализ регенерации Stentor требует инструментов для измерения сроков регенерации, которые являются надежными и достаточно простыми для применения к нескольким образцам как часть химического или молекулярного экрана. Стандартным методом выполнения клеточного анализа является визуализация, в данном случае визуализация образования нового ОА во время регенерации. Однако такие анализы на основе визуализации наиболее эффективны, когда регенерирующая структура содержит различные молекулярные компоненты, которые могут быть использованы в качестве маркеров, так что они будут легко обнаружены на флуоресцентном изображении. В случае Stentor OA известные компоненты (реснички, базальные тела) также присутствуют на остальной поверхности клетки; поэтому признание восстановления ОА не может быть достигнуто простым поиском наличия или отсутствия компонента.

Скорее, для обнаружения ОА потребуется некоторая форма распознавания формы, и это потенциально очень сложно, учитывая тот факт, что клетки Стентора часто меняют форму с помощью быстрого сократительного процесса. В этой статье представлен альтернативный анализ регенерации, который опирается на подвижную активность организма и реснички ОА. По мере регенерации ОА вновь образованные реснички претерпевают воспроизводимые изменения в положении и активности, что, в свою очередь, влияет на плавательную подвижность клетки. Анализируя подвижность, можно выполнить анализ «функциональной регенерации», который количественно определяет регенерацию путем количественной оценки функции регенерированных структур. Предыдущий анализ цилиарной функции Стентора при регенерации использовал велоциметрию изображения частиц в сочетании с индикаторными шариками, добавленными во внешние среды, для наблюдения за изменениями структуры потока на разных стадиях регенерации⁷; однако этот подход требует трудоемкой визуализации отдельных клеток и связанных с ними полей потока, по одной за раз.

Используя движение самой клетки в качестве прокси для потока, генерируемого ресничками, можно было бы параллельно анализировать большее количество клеток, используя системы визуализации с низким разрешением, совместимые с высокопроизводительными платформами скрининга. Этот анализ может, в принципе, быть использован для изучения развития и функциональной регенерации у других плавающих организмов в масштабе от сотен микрон до миллиметров. Раздел 1 протокола описывает построение многолуночного образца слайда, который позволяет проводить высокопроизводительную визуализацию популяции клеток в течение всего дня. Приведены подробные сведения о том, как настроить использование с другими типами клеток. Раздел 2 протокола охватывает сбор видеоданных для этого анализа, который может быть выполнен на рассеченном микроскопе с цифровой однообъективной зеркальной камерой. Раздел 3 протокола обеспечивает пошаговое руководство по отслеживанию клеток и расчету скорости ячейки с использованием кода MATLAB (Дополнительная информация). В разделе 4 протокола объясняется, как превратить числовые результаты в графики, как показано на рисунках 1C-F и 2C для легкой интерпретации результатов.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Популяцию из примерно ста клеток S. coeruleus культивировали в соответствии с ранее опубликованным протоколом^{JoVE 8}.

1. Пробоподготовка

1. Вырежьте кусок силиконового распорного листа толщиной 250 мкм (Таблица материалов), немного меньший по высоте и ширине, чем слайд микроскопа. Используя дырокол 5/16", создайте круглые колодцы. Помните о том, чтобы оставить достаточно места между соседними скважинами, чтобы обеспечить хорошее уплотнение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пространство в 3 мм между соседними скважинами было признано достаточным. С практикой десять скважин могут быть размещены на одном образце слайда.
2. Инициируют регенерацию ОА путем инкубации клеток в 10% сахарозы или 2% мочевины в течение 2 мин (рисунок 1А). Затем трижды промыть свежей средой⁸. Аккуратно пипеткуйте примерно десять стенторов в каждую скважину. Будьте осторожны, чтобы как можно точнее сопоставить объем пробы с объемом скважины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для размеров скважины, используемых здесь, 12,5 мкл образца были пипетированы в каждую скважину.
3. Закройте скважины, осторожно опустив кусок покровного стекла (см. Таблицу материалов) над скважинами, начиная с одного края. Используйте узкий и слегка гибкий предмет, такой как наконечник пипетки объемом 10 мкл, чтобы надавить на покровное стекло, где оно контактирует с силиконовым листом, чтобы обеспечить хорошее уплотнение.

2. Микроскопия видимого света покадровая съемка

1. Поместите образец на ступень микроскопа и установите увеличение на самый низкий доступный, чтобы он хорошо помещался в рамку целиком.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола на микроскопе использовался адаптер камеры 1,6x и 1-кратное увеличение объектива.
2. Начните покадровую съемку. Получайте видео 10 с частотой 30 кадров в секунду каждой скважины в каждой точке времени. При использовании микроскопа с моторизованной ступенью X-Y автоматизируйте весь таймлапс. В противном случае убедитесь, что пользователь присутствует в каждой точке времени, чтобы вручную перевести образец для записи каждой скважины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте образец освещенным, когда нет изображения, чтобы избежать нагрева и испарения. Объемы образцов невелики, и испарение приведет к пузырькам воздуха.
3. Сохраняйте фильмы как TIFF, MOV или AVI.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это наиболее распространенные непатентованные типы видеофайлов. В зависимости от конкретного программного обеспечения микроскопа, видео могут сохраняться по умолчанию в проприетарный тип файла, но затем могут быть экспортированы в один из вышеупомянутых типов файлов.
4. Используйте коэффициент преобразования пикселя в миллиметр для физического масштаба, а также выполните калибровку или используйте известный размер пикселя от используемой камеры. Для калибровки получите четкое изображение калибровочного слайда или четкой линейки при тех же настройках увеличения, что и видео. Используя любую программу для просмотра изображений, подсчитайте количество пикселей между отметками известного физического расстояния.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если изображение линейки показывает отметку 1 мм и отметку 2 мм, разделенные 100 пикселями, коэффициент преобразования составляет 1 мм на 100 пикселей. Кроме того, чтобы получить этот коэффициент от размера пикселя камеры, просто умножьте размер пикселя камеры на увеличение. Например, если используемая камера имеет 3,45 мкм пикселей, а используемое увеличение было 1,6x, то преобразование составляет 3,45 мкм * 1,6 = 5,52 мкм на 1 пиксель.

3. Отслеживание клеток

1. Загрузите два скрипта, TrackCells.m и CleanTraces.m, в легко запоминающееся место на компьютере. Если видео с данными еще нет на этом компьютере, перенесите их на этот компьютер.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Видео с данными и скрипты не обязательно должны находиться в одной папке.
2. Организуйте видео с данными в папки, по одной для каждой точки времени. Сначала используйте скрипт TrackCells.m для выполнения автоматического отслеживания ячеек в видео данных. Откройте TrackCells.m и запустите скрипт.
3. Выберите «Добавить в путь », если появится всплывающее окно, что обычно происходит только при первом запуске сценария из заданной папки. При появлении запроса выберите одно или несколько видео с данными для начала отслеживания, перейдите к видео с данными (раздел 2). Выделите несколько видеофайлов с помощью щелчка, удерживающего клавишу SHIFT, CONTROL или удерживая левую кнопку мыши при перемещении по файлам, чтобы выделить их.
4. После того, как вы удовлетворены списком файлов в поле Имя файла: в нижней части окна приглашения, нажмите « Открыть». Сначала выполните тестовый запуск на одном видео, чтобы убедиться, что все параметры установлены правильно (см. обсуждение ниже).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот скрипт теперь создаст папку для каждого выбранного видеофайла. Затем он запишет в эту папку каждый кадр видео в виде файла .jpg и файла с именем position_estimates.mat, который содержит все следы, найденные в видео. В зависимости от размера видео, количества видео и скорости работы компьютера этот сценарий может занять несколько часов.

4. Проверка трассировки

1. Убедитесь, что действия, описанные в разделе 3, были выполнены правильно, проверив отсутствие сообщений об ошибках, прежде чем продолжить. Используйте сценарий CleanTraces.m , чтобы вручную отклонить аномальные или ложные трассировки. Откройте CleanTraces.m в окне редактора MATLAB , дважды щелкнув файл.
2. В командной строке Выберите папку данных, выведенную TrackCells.m. Он будет иметь то же имя, что и видеофайл, перейдите к одной из папок, созданных, как описано в разделе 3. Выберите только одну папку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот скрипт теперь будет отображать трассировки один за другим во всплывающем окне. Они накладываются на кадр видео, где начинается след, зеленым цветом, и кадр видео, где заканчивается след, пурпурным цветом. Поэтому допустимая трассировка должна связывать зеленую ячейку и пурпурную ячейку.
3. При появлении запроса введите 1 , чтобы сохранить трассировку, и 0 , чтобы отклонить трассировку. Нажмите клавишу ВВОД , чтобы перейти к следующей трассировке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Новые следы будут продолжать отображаться до тех пор, пока не появятся следы, либо не будут показаны первые шестьдесят. Когда этот процесс будет завершен, скрипт автоматически создаст папку с именем CLEAN TRACES для сохранения выходных данных и отображения всех оставшихся следов поверх первого кадра видео (рисунок 1B). Это изображение автоматически сохраняется как LabeledTraces.png для дальнейшего использования. Все трассировки, выбранные пользователем для сохранения, будут сохранены в файле clean_traces.mat.
4. Выполните этот шаг для всех видео за один момент времени, прежде чем продолжить.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для данных в этой рукописи было получено одно видео для каждой скважины в каждой точке времени, в общей сложности десять видео на точку времени.

5. Визуализация данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы визуально сравнить подвижность всей клеточной популяции в разных временных точках, все следы из раздела 4 были переведены в начало и создали один радиальный график смещения по отношению к времени для каждой временной точки (рисунок 1C-F, см. Дополнительный рисунок S1 для всех временных точек).

1. Начните с загрузки скрипта под названием SpaghettiPlots.m. Откройте и запустите сценарий. Когда появится окно браузера с запросом Выберите папку времени, содержащую данные скважины (clean_traces.mat) для построения графика, перейдите в папку одной из точек времени. Обратите внимание, что эта папка должна содержать в себе папку для каждого из анализируемых видео.
2. При появлении запроса Калибровка: каково количество пикселей на миллиметр?, введите значение калибровки, найденное на шаге 2.4, и нажмите клавишу ВВОД.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь скрипт объединит следы из всех проанализированных видео на данный момент времени в один график (рисунок 1C-F). Слабые пунктирные круги на графике указывают на радиальные смещения 1, 2, 3 и 4 мм.
3. Отрегулируйте оси графика по мере необходимости, изменив строку 55 скрипта, которая по умолчанию установлена на rr = 4 для включения радиуса до 4 мм. Сохраните участок.

Результаты

Целью этого анализа является количественная оценка постепенного изменения моделей движения и поэтапного увеличения скорости движения из клеток в пределах большой (N ~ 100) регенерирующей популяции стентора. Чтобы облегчить интерпретацию результатов, пользовательский код, включен?...

Обсуждение

В настоящее время существует множество алгоритмов отслеживания частиц и клеток, некоторые из них полностью бесплатны. Стоимость и удобство для пользователя часто являются компромиссами, требующими компромисса. Кроме того, многие из существующих программ отслеживания клеток предназн...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m
MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m
Microscope with camera port			We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E
Pasteurized Spring Water	Carolina	132458
TAP Growth Media	ThermoFisher Scientific	A1379801	Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center