بروتوكول استخراج الحمض النووي للبعوض القائم على الخرز المغناطيسي لتسلسل الجيل التالي

Summary

الموصوف هنا هو بروتوكول استخراج الحمض النووي باستخدام الخرز المغناطيسي لإنتاج استخراج الحمض النووي عالية الجودة من البعوض. هذه الاستخراجات مناسبة لنهج تسلسل الجيل التالي من المصب.

Abstract

اقترح بروتوكول استخراج الحمض النووي الذي نشر مؤخرا باستخدام الخرز المغناطيسي وأداة استخراج الحمض النووي الآلي أنه من الممكن استخراج الحمض النووي عالي الجودة والكمية من بعوضة فردية محفوظة جيدا كافية لتسلسل الجينوم الكامل في المصب. ومع ذلك، يمكن أن يكون الاعتماد على أداة استخراج الحمض النووي الآلية باهظة الثمن مانعة بالنسبة للعديد من المختبرات. هنا ، توفر الدراسة بروتوكول استخراج الحمض النووي القائم على حبة مغناطيسية صديقة للميزانية ، وهو مناسب للنسب المنخفضة إلى المتوسطة. تم اختبار البروتوكول الموصوف هنا بنجاح باستخدام عينات البعوض Aedes aegypti الفردية. سيؤدي انخفاض التكاليف المرتبطة باستخراج الحمض النووي عالي الجودة إلى زيادة تطبيق تسلسل الإنتاجية العالية على المختبرات والدراسات المحدودة الموارد.

Introduction

وقد سمح التطور الأخير لبروتوكول استخراج الحمض النووي المحسن¹ بالعديد من الدراسات عالية التأثير في المصب التي تنطوي على تسلسل الجينوم الكامل^{2و3و4و5و6}. يوفر بروتوكول استخراج الحمض النووي القائم على الخرز المغناطيسي هذا غلة الحمض النووي الموثوقة من عينات البعوض الفردية ، مما يقلل بدوره من التكلفة والوقت المرتبط بالحصول على عدد كاف من العينات من مجموعات الحقول.

وترتبط التطورات الأخيرة في علم الجينوم السكاني والمناظر الطبيعية ارتباطا مباشرا بانخفاض تكاليف تسلسل الجينوم بأكمله. على الرغم من أن بروتوكول استخراج الحمض النووي السابق¹ يزيد من الكفاءة المرتبطة بالتسلسل الإنتاجي العالي ، إلا أن المختبرات / الدراسات الأصغر بدون الأموال قد تختار عدم استخدام هذه المناظر الطبيعية القوية الجديدة وأدوات الجينوم السكاني بسبب تكاليف تنفيذ البروتوكول (على سبيل المثال ، تكاليف الأدوات المتخصصة).

هنا، يتم تقديم بروتوكول استخراج الحمض النووي المعدلة التي تستخدم خطوة استخراج حبة مغناطيسية مماثلة نيمان وآخرون¹ للحصول على الحمض النووي عالية النقاء ولكن لا تعتمد على أدوات عالية التكلفة لتحلل الأنسجة واستخراج الحمض النووي. هذا البروتوكول مناسب للتجارب التي تتطلب >10 نانوغرام من الحمض النووي عالي الجودة.

Protocol

1. تخزين العينات العامة والاستعدادات قبل استخراج الحمض النووي

1. هيدرات العينة في 100 ميكرولتر من الماء PCR الصف لمدة 1 ساعة (أو بين عشية وضحاها) في 4 درجة مئوية إذا تم تخزين العينة في الكحول >70٪ لتنعيم الأنسجة.

2. تعطيل العينة

1. تعيين حاضنة أو اهتزاز كتلة الحرارة في 56 درجة مئوية.
2. جعل البروتين K (PK) العازلة / مزيج الانزيم. مطلوب 2 ميكرولتر من البروتين K (100 ملغم / مل) و 98 ميكرولتر من البروتين K العازلة (مجموع 100 ميكرولتر) لكل استخراج البعوض الفردية. لإعداد مزيج رئيسي لعينات متعددة، وزيادة المبلغ الإجمالي (مجتمعة لجميع العينات الفردية) بنسبة ~ 15٪ لضمان توافر حجم كاف.
3. إذا كانت العينات رطبة قبل الاستخراج، فتخلص من المياه من كل أنبوب عينة.
4. في أنبوب طرد دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على أنسجة البعوض، أضف 100 ميكرولتر من مزيج PK العازل/الإنزيم.
5. تجانس الأنسجة باستخدام الحشرات أنبوب الطرد الدقيق.
6. طرد العينات لمدة دقيقة واحدة في 9600 × ز في درجة حرارة الغرفة.
7. احتضان العينة لمدة 2-3 ساعة عند 56 درجة مئوية.
8. أثناء الحضانة، قم بإعداد الكواشف الأخرى باستخدام خطوة استخراج الحمض النووي (الخطوة 3).

3. استخراج الحمض النووي

1. جعل مزيج رئيسي حبة المغناطيسي. لكل عينة، اخلط 100 ميكرولتر من حاجز التحلل، و100 ميكرولتر من الإيزوبروبانول، و15 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي (إجمالي 215 ميكرولتر). لإعداد مزيج رئيسي لتفاعلات متعددة، وزيادة المبلغ الإجمالي (مجتمعة لجميع العينات الفردية) بنسبة ~ 20٪ لضمان توافر حجم كاف.
2. بعد وقت الحضانة (الخطوة 2.7)، قم بنقل كل lysate إلى أنبوب طرد دقيق نظيف أو بئر ميكروبليت باستخدام ماصة.
3. إضافة 100 μL lysate و 215 ميكرولتر من مزيج حبة مغناطيسية رئيسية لكل عينة.
4. استخدام ماصة لخلط جيدا لمدة 10-20 ق ثم السماح لها الوقوف لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. هز الأنبوب برفق في بعض الأحيان لتحقيق أقصى قدر من الربط بين الخرز المغناطيسي والحمض النووي.
5. ضع الأنبوب/اللوحة على فاصل الخرز المغناطيسي وانتظر حتى يصبح المحلول واضحا.
6. تجاهل السائل من أنبوب / لوحة باستخدام ماصة. عند إزالة الناطقة الفائقة، حاول عدم لمس أو إزعاج الخرز المغناطيسي الذي يحمل الحمض النووي.
7. نقل أنبوب / لوحة بعيدا عن فاصل حبة المغناطيسي وإضافة 325 ميكرولتر من العازلة الغسيل 1 إلى كل بئر.
8. تخلط جيدا عن طريق pipetting واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
9. كرر الخطوات 3.5-3.6.
10. نقل أنبوب / لوحة بعيدا عن فاصل حبة المغناطيسي وإضافة 250 ميكرولتر من العازلة غسل 1 إلى كل بئر.
11. تخلط جيدا عن طريق pipetting واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
12. كرر الخطوات 3.5-3.6.
13. حرك الأنبوب/الصفيحة بعيدا عن فاصل الخرز المغناطيسي وأضف 250 ميكرولتر من عازل الغسيل 2 إلى كل عينة.
14. تخلط جيدا واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
15. كرر الخطوات 3.5-3.6.
16. نقل أنبوب / لوحة بعيدا عن فاصل حبة المغناطيسي وإضافة 250 ميكرولتر من العازلة غسل 2 إلى كل بئر.
17. تخلط جيدا واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
18. كرر الخطوات 3.5-3.6.
19. نقل أنبوب / لوحة بعيدا عن فاصل حبة المغناطيسي وإضافة 100 ميكرولتر من العازلة elution إلى كل بئر.
20. تخلط جيدا واحتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
21. تحريك أنبوب / لوحة على فاصل حبة المغناطيسي والانتظار حتى الحل واضح.
22. ماصة العملاقة في أنبوب جديد نظيف 0.5 ميكروسينتريف أو microplate جيدا.
23. تخزين عينات الحمض النووي في 4 °C (تصل إلى 1 أسبوع) أو -80 °C.  إذا كان يتم استخدام لوحة صغيرة، وتغطية ذلك مع parafilm.
24. تحديد غلة الحمض النووي باستخدام أي طريقة مناسبة.
    ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام قراءة الحمض النووي للفلورومتر وامتصاصه عند 260/280 نانومتر.

النتائج

وكان متوسط غلة الحمض النووي لكل رأس البعوض الفردية / أنسجة الصدر 4.121 نانوغرام / ميكرولتر (N = 92، الانحراف المعياري 3.513) تقاس باستخدام مقياس الفلورومتر عند التملبد باستخدام 100 ميكروغرام من العازلة elution. وهذا يكفي ل10-30 نانوغرام متطلبات إدخال الحمض النووي الجينوم اللازمة لبناء مكتبة الجينوم كله<...

Discussion

يمكن تكييف البروتوكول الموصوف هنا لأنواع الحشرات الأخرى. وقد تم اختبار النسخة الأصلية من البروتوكول الذي تم تقديمه في نيمان وآخرون¹ على أنواع متعددة، بما في ذلك Aedes aegypti، Ae. busckii، Ae. taeniorhynchus، Anopheles arabiensis، An. coluzzii، An. coustani, An. دارلينجي, An. funestus, An. غامبي, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, C...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AE Buffer	Qiagen	19077	Elution buffer
AL Buffer	Qiagen	19075	Lysis buffer
AW1 Buffer	Qiagen	19081	Washing buffer 1
AW2 Buffer	Qiagen	19072	Washing buffer 2
MagAttract Suspension G	Qiagen	1026901	magnetic bead
Magnetic bead separator	Epigentek	Q10002-1
Nanodrop	ThermoFisher	ND-2000	microvolume spectrophotometer
PK Buffer	ThermoFisher	4489111	Proteinase K buffer
Proteinase K	ThermoFisher	A25561
Qubit	Invitrogen	Q33238	fluorometer