Протокол экстракции ДНК комаров на магнитной основе для секвенирования следующего поколения

Резюме

Здесь описан протокол экстракции ДНК с использованием магнитных шариков для получения высококачественной экстракции ДНК от комаров. Эти извлечения подходят для последующего подхода к секвенированию следующего поколения.

Аннотация

Недавно опубликованный протокол экстракции ДНК с использованием магнитных шариков и автоматизированного инструмента экстракции ДНК предположил, что можно извлечь высококачественную и количественную ДНК из хорошо сохранившегося отдельного комара, достаточного для последующего секвенирования всего генома. Тем не менее, зависимость от дорогостоящего автоматизированного инструмента для извлечения ДНК может быть непомерно высокой для многих лабораторий. Здесь исследование предоставляет бюджетный протокол экстракции ДНК на магнитной основе, который подходит для низкой и средней пропускной способности. Протокол, описанный здесь, был успешно протестирован с использованием отдельных образцов комаров Aedes aegypti. Снижение затрат, связанных с высококачественной экстракцией ДНК, увеличит применение высокопроизводительного секвенирования в лабораториях и исследованиях с ограниченными ресурсами.

Введение

Недавняя разработка улучшенного протокола экстракции ДНК¹ позволила пролить много высокоэффективных последующих исследований, включающих секвенирование всего генома^2,3,4,5,6. Этот протокол экстракции ДНК на основе магнитных шариков обеспечивает надежный выход ДНК из отдельных образцов комаров, что, в свою очередь, снижает стоимость и время, связанные с приобретением достаточного количества образцов из полевых коллекций.

Последние достижения в популяции и ландшафтной геномике напрямую связаны со снижением затрат на секвенирование всего генома. Хотя предыдущий протокол экстракции ДНК¹ повышает эффективность, связанную с высокопроизводительный секвенированием, небольшие лаборатории / исследования без средств могут отказаться от использования этих новых мощных инструментов ландшафтной и популяционной геномики из-за затрат на внедрение протокола (например, затраты на специализированные инструменты).

Здесь представлен модифицированный протокол экстракции ДНК, который использует аналогичную магнитную ступень экстракции шариков, как Neiman et al.^1, для получения ДНК высокой чистоты, но не полагается на дорогостоящие инструменты для лизиса тканей и экстракции ДНК. Этот протокол подходит для экспериментов, требующих >10 нг высококачественной ДНК.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Общее хранение образцов и подготовка перед извлечением ДНК

1. Гидратировать образец в воде ПЦР-класса 100 мкл в течение 1 ч (или на ночь) при 4 °C, если образец хранился в >70% спирте для размягчения ткани.

2. Нарушение выборки

1. Установите инкубатор или встряхивательный тепловой блок при 56 °C.
2. Производят смесь буфера и фермента протеиназы K (PK). Для каждой отдельной экстракции комара требуется 2 мкл протеиназы К (100 мг/мл) и 98 мкл буфера протеиназы К (всего 100 мкл). Чтобы приготовить мастер-микс для нескольких образцов, увеличьте общее количество (объединенное для всех отдельных образцов) на ~ 15%, чтобы обеспечить наличие достаточного объема.
3. Если образцы были гидратированы перед извлечением, выбросьте воду из каждой пробы.
4. В микроцентрифужную трубку 1,5 мл, содержащую ткань комара, добавьте 100 мкл смеси буфера и фермента ПК.
5. Гомогенизируйте ткань с помощью микроцентрифуги трубчатого пестикла.
6. Центрифугировать образцы в течение 1 мин при 9 600 х г при комнатной температуре.
7. Инкубировать образец в течение 2-3 ч при 56 °C.
8. Во время инкубации подготовьте другие реагенты, используя этап экстракции ДНК (этап 3).

3. Извлечение ДНК

1. Сделайте магнитный бисероплетение. Для каждого образца смешайте 100 мкл лизисного буфера, 100 мкл изопропанола и 15 мкл магнитных шариков (всего 215 мкл). Чтобы приготовить мастер-микс для нескольких реакций, увеличьте общее количество (объединенное для всех отдельных образцов) на ~ 20%, чтобы обеспечить наличие адекватного объема.
2. По истечении времени инкубации (этап 2.7) перенесите каждый лизат в чистую микроцентрифужную трубку или микропластинку с помощью пипетки.
3. Добавьте 100 мкл лиазата и 215 мкл магнитной бисероплетительной смеси в каждый образец.
4. Используйте пипетку, чтобы хорошо перемешать ее в течение 10-20 с, а затем дайте ей постоять в течение 10 минут при комнатной температуре. Осторожно время от времени встряхивайте трубку, чтобы максимизировать связывание магнитных шариков и ДНК.
5. Поместите трубку/пластину на магнитный сепаратор шариков и подождите, пока раствор не очистится.
6. Выбросьте жидкость из трубки/пластины с помощью пипетки. При удалении супернатанта старайтесь не трогать и не беспокоить магнитные шарики, удерживающие ДНК.
7. Отодвинуть трубку/пластину от магнитного сепаратора шариков и добавить 325 мкл промывного буфера 1 в каждую скважину.
8. Тщательно перемешать путем пипетки и инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре.
9. Повторите шаги 3.5–3.6.
10. Отодвинуть трубку/пластину от магнитного сепаратора шариков и добавить 250 мкл промывного буфера 1 к каждой скважине.
11. Тщательно перемешать путем пипетки и инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре.
12. Повторите шаги 3.5–3.6.
13. Отодвинуть трубку/пластину от магнитного сепаратора шариков и добавить 250 мкл промывочного буфера 2 к каждому образцу.
14. Тщательно перемешать и инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре.
15. Повторите шаги 3.5–3.6.
16. Отодвинуть трубку/пластину от магнитного сепаратора шариков и добавить 250 мкл промывного буфера 2 к каждой скважине.
17. Тщательно перемешать и инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре.
18. Повторите шаги 3.5–3.6.
19. Отодвинуть трубку/пластину от магнитного сепаратора шариков и добавить 100 мкл буфера элюдения в каждую скважину.
20. Тщательно перемешать и инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре.
21. Переместите трубку/пластину на магнитный сепаратор шариков и подождите, пока раствор не очистится.
22. Пипетка супернатанта в новую чистую 0,5 микроцентрифужную трубку или микропластинку.
23. Храните образцы ДНК при 4 °C (до 1 недели) или -80 °C.  Если используется микропластиня, накройте ее парапленкой.
24. Определите выход ДНК с помощью любого подходящего метода.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовались показания и поглощение флуорометра ДНК при 260/280 нм.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Средний выход ДНК на отдельную голову комара / ткань грудной клетки составил 4,121 нг / мкл (N = 92, стандартное отклонение 3,513), измеренный с использованием флуорометра при элюировании с использованием 100 мкл буфера элюации. Этого достаточно для входных требований геномной ДНК в 10-30 нг, необхо...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Протокол, описанный здесь, может быть адаптирован для других видов насекомых. Первоначальная версия протокола, представленная в Nieman et al.^1, была протестирована на нескольких видах, включая Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannul...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AE Buffer	Qiagen	19077	Elution buffer
AL Buffer	Qiagen	19075	Lysis buffer
AW1 Buffer	Qiagen	19081	Washing buffer 1
AW2 Buffer	Qiagen	19072	Washing buffer 2
MagAttract Suspension G	Qiagen	1026901	magnetic bead
Magnetic bead separator	Epigentek	Q10002-1
Nanodrop	ThermoFisher	ND-2000	microvolume spectrophotometer
PK Buffer	ThermoFisher	4489111	Proteinase K buffer
Proteinase K	ThermoFisher	A25561
Qubit	Invitrogen	Q33238	fluorometer