Un protocollo di estrazione del DNA delle zanzare a base di perline magnetiche per il sequenziamento di nuova generazione

Riepilogo

Qui descritto è un protocollo di estrazione del DNA che utilizza perline magnetiche per produrre estrazioni di DNA di alta qualità dalle zanzare. Queste estrazioni sono adatte per un approccio di sequenziamento di nuova generazione a valle.

Abstract

Un protocollo di estrazione del DNA recentemente pubblicato che utilizza perline magnetiche e uno strumento automatizzato di estrazione del DNA hanno suggerito che è possibile estrarre DNA di alta qualità e quantità da una zanzara individuale ben conservata sufficiente per il sequenziamento dell'intero genoma a valle. Tuttavia, la dipendenza da un costoso strumento automatizzato di estrazione del DNA può essere proibitiva per molti laboratori. Qui, lo studio fornisce un protocollo di estrazione del DNA basato su perline magnetiche budget-friendly, adatto per una produttività da bassa a media. Il protocollo qui descritto è stato testato con successo utilizzando singoli campioni di zanzare Aedes aegypti. La riduzione dei costi associati all'estrazione del DNA di alta qualità aumenterà l'applicazione del sequenziamento ad alta produttività a laboratori e studi limitati alle risorse.

Introduzione

Il recente sviluppo di un protocollo di estrazione del DNA^{migliorato 1} ha permesso molti studi a valle ad alto impatto che coinvolgono il sequenziamento dell'intero^{genoma 2,3,4,5,6}. Questo protocollo di estrazione del DNA basato su perline magnetiche fornisce una resa affidabile del DNA da singoli campioni di zanzara, che a sua volta riduce il costo e il tempo associati all'acquisizione di un numero sufficiente di campioni dalle raccolte sul campo.

I recenti progressi nella genomica della popolazione e del paesaggio sono direttamente correlati con la diminuzione dei costi del sequenziamento dell'intero genoma. Sebbene il precedente protocollo di estrazione del DNA¹ aumenti l'efficienza associata al sequenziamento ad alta produttività, laboratori / studi più piccoli senza i fondi possono scegliere di non utilizzare questi nuovi potenti strumenti genomici per il paesaggio e la popolazione a causa dei costi di implementazione del protocollo (ad esempio, i costi degli strumenti specializzati).

Qui viene presentato un protocollo di estrazione del DNA modificato che utilizza una fase di estrazione del tallone magnetico simile a Quella di Neiman et^al. Questo protocollo è adatto per esperimenti che richiedono >10 ng di DNA di alta qualità.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

1. Conservazione generale del campione e preparati prima dell'estrazione del DNA

1. Idratare il campione in acqua pcr da 100 μL per 1 h (o durante la notte) a 4 °C se il campione è stato conservato in alcool >70% per ammorbidire il tessuto.

2. Interruzione del campione

1. Impostare un incubatore o un blocco termico a tremante a 56 °C.
2. Fare proteinasi K (PK) tampone/enzima miscela. Per ogni singola estrazione di zanzare sono necessari 2 μL di Proteinasi K (100 mg/mL) e 98 μL di Proteinasi K Buffer (totale 100 μL). Per preparare un mix master per più campioni, aumentare la quantità totale (combinata per tutti i singoli campioni) di ~ 15% per garantire la disponibilità di un volume adeguato.
3. Se i campioni sono stati idratati prima dell'estrazione, scartare l'acqua da ciascun tubo campione.
4. In un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml contenente tessuto di zanzara, aggiungere 100 μL di miscela tampone/enzima PK.
5. Omogeneizzare il tessuto utilizzando il pestello del tubo di microcentrifugo.
6. Centrifugare i campioni per 1 minuto a 9.600 x g a temperatura ambiente.
7. Incubare il campione per 2-3 ore a 56 °C.
8. Durante l'incubazione, preparare gli altri reagenti utilizzando la fase di estrazione del DNA (fase 3).

3. Estrazione del DNA

1. Crea un mix magnetico di perline. Per ogni campione, mescolare 100 μL di tampone dilisi, 100 μL di isopropanolo e 15 μL di perline magnetiche (totale 215 μL). Per preparare un mix master per reazioni multiple, aumentare la quantità totale (combinata per tutti i singoli campioni) di ~ 20% per garantire la disponibilità di un volume adeguato.
2. Dopo il tempo di incubazione (fase 2.7), trasferire ogni lisato in un tubo di microcentrifugo pulito o in un pozzo di micropiatta usando pipetta.
3. Aggiungere 100 μL di lysate e 215 μL della miscela magnetica di perline master ad ogni campione.
4. Utilizzare una pipetta per mescolarla bene per 10-20 s e quindi lasciarla riposare per 10 minuti a temperatura ambiente. Agitare delicatamente il tubo di tanto in tanto per massimizzare il legame di perline magnetiche e DNA.
5. Posizionare il tubo/piastra sul separatore magnetico delle perline e attendere che la soluzione sia libera.
6. Scartare il liquido dal tubo/piastra utilizzando pipetta. Quando si rimuove il supernatante, cercare di non toccare o disturbare le perline magnetiche che tengono il DNA.
7. Spostare il tubo/piastra lontano dal separatore magnetico delle perline e aggiungere 325 μL di tampone di lavaggio 1 ad ogni pozzo.
8. Mescolare accuratamente con pipettazione e incubare per 1 minuto a temperatura ambiente.
9. Ripetere i passaggi da 3.5 a 3.6.
10. Spostare il tubo/piastra lontano dal separatore magnetico delle perline e aggiungere 250 μL di tampone di lavaggio 1 ad ogni pozzo.
11. Mescolare accuratamente con pipettazione e incubare per 1 minuto a temperatura ambiente.
12. Ripetere i passaggi da 3.5 a 3.6.
13. Spostare il tubo/piastra lontano dal separatore magnetico delle perline e aggiungere 250 μL di tampone di lavaggio 2 a ciascun campione.
14. Mescolare accuratamente e incubare per 1 minuto a temperatura ambiente.
15. Ripetere i passaggi da 3.5 a 3.6.
16. Spostare il tubo/piastra lontano dal separatore magnetico delle perline e aggiungere 250 μL di tampone di lavaggio 2 ad ogni pozzo.
17. Mescolare accuratamente e incubare per 1 minuto a temperatura ambiente.
18. Ripetere i passaggi da 3.5 a 3.6.
19. Spostare il tubo/piastra lontano dal separatore magnetico delle perline e aggiungere 100 μL di tampone di eluizione a ciascun pozzo.
20. Mescolare accuratamente e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente.
21. Spostare il tubo/piastra sul separatore di perline magnetiche e attendere che la soluzione sia libera.
22. Pipettare il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifugo pulito da 0,5 o in un pozzo di micropiatta.
23. Conservare campioni di DNA a 4 °C (fino a 1 settimana) o -80 °C.  Se viene utilizzata una micropiatta, coprirla con un parafilm.
24. Determinare le rese del DNA utilizzando qualsiasi metodo appropriato.
    NOTA: In questo studio sono stati utilizzati la lettura e l'assorbanza del fluorometro del DNA a 260/280 nm.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

La resa media del DNA per singolo tessuto testa di zanzara/torace era di 4,121 ng/μL (N = 92, deviazione standard 3.513) misurata utilizzando un fluorometro se eluita utilizzando 100 μL di tampone di eluizione. Questo è sufficiente per i requisiti di input di DNA genomico da 10-30 ng necessari per la costruzione dell'intera libreria^{del genoma 1,7}. La quantità di DNA può variare tra 0,3-29,7 ng / μL a seconda delle dimensioni del corpo della zanzara e delle ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Il protocollo qui descritto può essere adattato per altre specie di insetti. La versione originale del protocollo introdotto in Nieman et^al. An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta e Keiferia lycopersicella^2,8,9,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AE Buffer	Qiagen	19077	Elution buffer
AL Buffer	Qiagen	19075	Lysis buffer
AW1 Buffer	Qiagen	19081	Washing buffer 1
AW2 Buffer	Qiagen	19072	Washing buffer 2
MagAttract Suspension G	Qiagen	1026901	magnetic bead
Magnetic bead separator	Epigentek	Q10002-1
Nanodrop	ThermoFisher	ND-2000	microvolume spectrophotometer
PK Buffer	ThermoFisher	4489111	Proteinase K buffer
Proteinase K	ThermoFisher	A25561
Qubit	Invitrogen	Q33238	fluorometer