Ein magnetperlenbasiertes Moskito-DNA-Extraktionsprotokoll für die Sequenzierung der nächsten Generation

Zusammenfassung

Hier wird ein DNA-Extraktionsprotokoll mit magnetischen Perlen beschrieben, um qualitativ hochwertige DNA-Extraktionen aus Moskitos herzustellen. Diese Extraktionen eignen sich für einen nachgelagerten Next-Generation-Sequencing-Ansatz.

Zusammenfassung

Ein kürzlich veröffentlichtes DNA-Extraktionsprotokoll mit magnetischen Perlen und einem automatisierten DNA-Extraktionsinstrument deutete darauf hin, dass es möglich ist, qualitativ hochwertige und quantitativ DNA aus einer gut erhaltenen einzelnen Mücke zu extrahieren, die für die nachgelagerte Sequenzierung des gesamten Genoms ausreicht. Die Abhängigkeit von einem teuren automatisierten DNA-Extraktionsinstrument kann jedoch für viele Labore unerschwinglich sein. Hier liefert die Studie ein budgetfreundliches magnetperlenbasiertes DNA-Extraktionsprotokoll, das für niedrigen bis mittleren Durchsatz geeignet ist. Das hier beschriebene Protokoll wurde erfolgreich mit einzelnen Aedes aegypti Mückenproben getestet. Die reduzierten Kosten, die mit einer qualitativ hochwertigen DNA-Extraktion verbunden sind, werden die Anwendung der Hochdurchsatzsequenzierung in ressourcenbeschmierten Laboren und Studien erhöhen.

Einleitung

Die jüngste Entwicklung eines verbesserten DNA-Extraktionsprotokolls¹ hat viele hochwirbende nachgelagerte Studien mit der Sequenzierung des gesamten Genoms^2,3,4,5,6ermöglicht. Dieses auf magnetischen Perlen basierende DNA-Extraktionsprotokoll bietet eine zuverlässige DNA-Ausbeute aus einzelnen Mückenproben, was wiederum die Kosten und den Zeitaufwand reduziert, die mit der Gewinnung einer ausreichenden Anzahl von Proben aus Feldsammlungen verbunden sind.

Jüngste Fortschritte in der Populations- und Landschaftsgenomik stehen in direktem Zusammenhang mit sinkenden Kosten für die Sequenzierung des gesamten Genoms. Obwohl das vorherige DNA-Extraktionsprotokoll¹ die Effizienz im Zusammenhang mit der Hochdurchsatzsequenzierung erhöht, können kleinere Labore / Studien ohne die Mittel die Verwendung dieser neuen leistungsstarken Landschafts- und Populationsgenomik-Tools aufgrund der Kosten für die Implementierung des Protokolls (z. B. Kosten für spezialisierte Instrumente) ablehnen.

Hier wird ein modifiziertes DNA-Extraktionsprotokoll vorgestellt, das einen ähnlichen magnetischen Perlenextraktionsschritt wie Neiman et al.¹ verwendet, um hochreine DNA zu erhalten, aber nicht auf kostenintensive Instrumente für die Gewebelyse und DNA-Extraktion angewiesen ist. Dieses Protokoll eignet sich für Experimente, die >10 ng hochwertiger DNA erfordern.

Protokoll

1. Allgemeine Probenlagerung und Vorbereitung vor der DNA-Extraktion

1. Hydratisieren Sie die Probe in 100 μL PCR-Wasser für 1 h (oder über Nacht) bei 4 °C, wenn die Probe in >70% Alkohol gelagert wurde, um das Gewebe weicher zu machen.

2. Unterbrechung der Probe

1. Stellen Sie einen Inkubator oder Schüttelwärmeblock auf 56 °C ein.
2. Machen Sie Proteinase K (PK) Puffer / Enzym-Mix. Für jede einzelne Mückenextraktion werden 2 μL Proteinase K (100 mg/ml) und 98 μL Proteinase K Buffer (insgesamt 100 μL) benötigt. Um einen Master-Mix für mehrere Proben vorzubereiten, erhöhen Sie die Gesamtmenge (kombiniert für alle Einzelproben) um ~ 15%, um die Verfügbarkeit eines ausreichenden Volumens zu gewährleisten.
3. Wenn die Proben vor der Extraktion hydratisiert wurden, entsorgen Sie Wasser aus jedem Probenröhrchen.
4. In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit Mückengewebe 100 μL PK-Puffer/Enzym-Mix hinzufügen.
5. Homogenisieren Sie das Gewebe mit Mikrozentrifugen-Schlauchstößel.
6. Zentrifugiert die Proben für 1 min bei 9.600 x g bei Raumtemperatur.
7. Inkubieren Sie die Probe für 2-3 h bei 56 °C.
8. Bereiten Sie während der Inkubation die anderen Reagenzien mit dem DNA-Extraktionsschritt (Schritt 3) vor.

3. DNA-Extraktion

1. Machen Sie eine magnetische Perlen-Master-Mischung. Mischen Sie für jede Probe 100 μL Lysepuffer, 100 μL Isopropanol und 15 μL magnetische Perlen (insgesamt 215 μL). Um eine Mastermischung für mehrere Reaktionen vorzubereiten, erhöhen Sie die Gesamtmenge (kombiniert für alle Einzelproben) um ~ 20%, um die Verfügbarkeit eines ausreichenden Volumens zu gewährleisten.
2. Nach der Inkubationszeit (Schritt 2.7) wird jedes Lysat mittels Pipette in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen oder eine Mikroplattenbohrung gegeben.
3. Zu jeder Probe werden 100 μL Lysat und 215 μL der magnetischen Perlen-Mastermischung hinzugefügt.
4. Verwenden Sie eine Pipette, um es für 10-20 s gut zu mischen und lassen Sie es dann für 10 min bei Raumtemperatur stehen. Schütteln Sie die Röhre gelegentlich vorsichtig, um die Bindung von Magnetischen Perlen und DNA zu maximieren.
5. Legen Sie das Rohr/die Platte auf den magnetischen Perlenabscheider und warten Sie, bis die Lösung klar ist.
6. Entsorgen Sie die Flüssigkeit aus dem Rohr/der Platte mit einer Pipette. Versuchen Sie beim Entfernen des Überstands, die magnetischen Perlen, die die DNA halten, nicht zu berühren oder zu stören.
7. Bewegen Sie das Rohr/die Platte vom magnetischen Perlenabscheider weg und fügen Sie 325 μL Waschpuffer 1 zu jeder Vertiefung hinzu.
8. Gründlich durch Pipettieren mischen und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.
9. Wiederholen Sie die Schritte 3.5-3.6.
10. Bewegen Sie das Rohr/die Platte vom magnetischen Perlenabscheider weg und fügen Sie 250 μL Waschpuffer 1 zu jeder Vertiefung hinzu.
11. Gründlich durch Pipettieren mischen und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.
12. Wiederholen Sie die Schritte 3.5-3.6.
13. Bewegen Sie das Röhrchen/die Platte vom magnetischen Perlenabscheider weg und fügen Sie jeder Probe 250 μL Waschpuffer 2 hinzu.
14. Gründlich mischen und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.
15. Wiederholen Sie die Schritte 3.5-3.6.
16. Bewegen Sie das Rohr/die Platte vom magnetischen Perlenabscheider weg und fügen Sie 250 μL Waschpuffer 2 zu jeder Vertiefung hinzu.
17. Gründlich mischen und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.
18. Wiederholen Sie die Schritte 3.5-3.6.
19. Bewegen Sie das Rohr/die Platte vom magnetischen Perlenabscheider weg und fügen Sie jeder Vertiefung 100 μL Elutionspuffer hinzu.
20. Gründlich mischen und 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
21. Bewegen Sie das Rohr/ die Platte auf den magnetischen Perlenabscheider und warten Sie, bis die Lösung klar ist.
22. Pipetetten Sie den Überstand in eine neue saubere 0,5-Mikrozentrifugenröhre oder Mikroplatten-Vertiefung.
23. Lagern Sie DNA-Proben bei 4 °C (bis zu 1 Woche) oder -80 °C.  Wenn eine Mikroplatte verwendet wird, bedecken Sie sie mit Parafilm.
24. Bestimmen Sie die DNA-Ausbeute mit einer geeigneten Methode.
    HINWEIS: In dieser Studie wurden DNA-Fluorometer-Messwerte und Absorption bei 260/280 nm verwendet.

Ergebnisse

Die durchschnittliche DNA-Ausbeute pro einzelnem Mückenkopf/Thoraxgewebe betrug 4,121 ng/μL (N = 92, Standardabweichung 3,513), gemessen mit einem Fluorometer, wenn es mit 100 μL Elutionspuffer eluiert wurde. Dies ist ausreichend für die 10-30 ng genomischen DNA-Eingangsanforderungen, die für den Aufbau der gesamten Genombibliothek erforderlich sind^1,7. Die Menge an DNA kann zwischen 0,3-29,7 ng / μL variieren, abhängig von der Körpergröße der Mücke un...

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll kann für andere Insektenarten angepasst werden. Die ursprüngliche Version des in Nieman et al.¹ eingeführten Protokolls wurde an mehreren Arten getestet, darunter Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta und Keifer...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AE Buffer	Qiagen	19077	Elution buffer
AL Buffer	Qiagen	19075	Lysis buffer
AW1 Buffer	Qiagen	19081	Washing buffer 1
AW2 Buffer	Qiagen	19072	Washing buffer 2
MagAttract Suspension G	Qiagen	1026901	magnetic bead
Magnetic bead separator	Epigentek	Q10002-1
Nanodrop	ThermoFisher	ND-2000	microvolume spectrophotometer
PK Buffer	ThermoFisher	4489111	Proteinase K buffer
Proteinase K	ThermoFisher	A25561
Qubit	Invitrogen	Q33238	fluorometer