Un protocolo de extracción de ADN de mosquitos a base de perlas magnéticas para la secuenciación de próxima generación

Resumen

Aquí se describe un protocolo de extracción de ADN que utiliza perlas magnéticas para producir extracciones de ADN de alta calidad de mosquitos. Estas extracciones son adecuadas para un enfoque de secuenciación de próxima generación aguas abajo.

Resumen

Un protocolo de extracción de ADN recientemente publicado utilizando perlas magnéticas y un instrumento automatizado de extracción de ADN sugirió que es posible extraer ADN de alta calidad y cantidad de un mosquito individual bien conservado suficiente para la secuenciación del genoma completo aguas abajo. Sin embargo, la dependencia de un costoso instrumento automatizado de extracción de ADN puede ser prohibitiva para muchos laboratorios. Aquí, el estudio proporciona un protocolo de extracción de ADN basado en perlas magnéticas económico, que es adecuado para un rendimiento bajo a medio. El protocolo descrito aquí se probó con éxito utilizando muestras individuales de mosquitos Aedes aegypti. Los costos reducidos asociados con la extracción de ADN de alta calidad aumentarán la aplicación de la secuenciación de alto rendimiento a laboratorios y estudios de recursos limitados.

Introducción

El desarrollo reciente de un protocolo mejorado de extracción de ADN¹ ha permitido muchos estudios posteriores de alto impacto que involucran la secuenciación delgenoma completo^2,3,4,5,6. Este protocolo de extracción de ADN basado en perlas magnéticas proporciona un rendimiento de ADN confiable de muestras individuales de mosquitos, lo que a su vez reduce el costo y el tiempo asociados con la adquisición de un número suficiente de muestras de colecciones de campo.

Protocolo

1. Almacenamiento general de muestras y preparados antes de la extracción de ADN

1. Hidratar la muestra en 100 μL de agua de grado PCR durante 1 h (o durante la noche) a 4 °C si la muestra se ha almacenado en alcohol >70% para ablandar el tejido.

2. Interrupción de la muestra

1. Establezca una incubadora o un bloque de calor de agitación a 56 °C.
2. Haga la mezcla del almacenador intermediario/de la enzima de la proteinasa K (PK). Se requieren 2 μL de proteinasa K (100 mg/mL) y 98 μL de tampón de proteinasa K (total 100 μL) para cada extracción individual de mosquitos. Para preparar una mezcla maestra para múltipl....

Resultados

El rendimiento promedio de ADN por cabeza de mosquito individual/tejido de tórax fue de 4.121 ng/μL (N = 92, desviación estándar 3.513) medido usando un fluorómetro cuando se elutía usando 100 μL de tampón de elución. Esto es suficiente para los requisitos de entrada de ADN genómico de 10-30 ng necesarios para la construcción de la biblioteca del genoma completo^1,7. La cantidad de ADN puede variar entre 0.3-29.7 ng/μL dependiendo del tamaño corporal .......

Discusión

El protocolo descrito aquí se puede adaptar para otras especies de insectos. La versión original del protocolo introducido en Nieman et al.¹ ha sido probada en múltiples especies, incluyendo Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta, y Keiferia ly.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AE Buffer	Qiagen	19077	Elution buffer
AL Buffer	Qiagen	19075	Lysis buffer
AW1 Buffer	Qiagen	19081	Washing buffer 1
AW2 Buffer	Qiagen	19072	Washing buffer 2
MagAttract Suspension G	Qiagen	1026901	magnetic bead
Magnetic bead separator	Epigentek	Q10002-1
Nanodrop	ThermoFisher	ND-2000	microvolume spectrophotometer
PK Buffer	ThermoFisher	4489111	Proteinase K buffer
Proteinase K	ThermoFisher	A25561
Qubit	Invitrogen	Q33238	fluorometer