Un protocole d’extraction de l’ADN des moustiques à base de perles magnétiques pour le séquençage de nouvelle génération

Résumé

Décrit ici est un protocole d’extraction d’ADN utilisant des perles magnétiques pour produire des extractions d’ADN de haute qualité à partir de moustiques. Ces extractions conviennent à une approche de séquençage de nouvelle génération en aval.

Résumé

Un protocole d’extraction de l’ADN récemment publié à l’aide de billes magnétiques et d’un instrument automatisé d’extraction de l’ADN suggère qu’il est possible d’extraire de l’ADN de haute qualité et en quantité d’un moustique individuel bien préservé suffisant pour le séquençage du génome entier en aval. Cependant, le recours à un instrument automatisé coûteux d’extraction de l’ADN peut être prohibitif pour de nombreux laboratoires. Ici, l’étude fournit un protocole d’extraction d’ADN à base de perles magnétiques économique, qui convient à un débit faible à moyen. Le protocole décrit ici a été testé avec succès à l’aide d’échantillons individuels de moustiques Aedes aegypti. La réduction des coûts associés à l’extraction de l’ADN de haute qualité augmentera l’application du séquençage à haut débit aux laboratoires et aux études aux ressources limitées.

Introduction

Le développement récent d’un protocole d’extraction d’ADN amélioré¹ a permis de nombreuses études en aval à fort impact impliquant le séquençage du génome entier^2,3,4,5,6. Ce protocole d’extraction d’ADN à base de perles magnétiques fournit un rendement fiable en ADN à partir d’échantillons individuels de moustiques, ce qui réduit le coût et le temps associés à l’acquisition d’un nombre suffisant d’échantillons provenant de collections sur le terrain.

Les progrès récents de la génomique des populations et des paysages sont directement corrélés à la diminution des coûts du séquençage du génome entier. Bien que l’ancien protocole d’extraction de l’ADN¹ augmente l’efficacité associée au séquençage à haut débit, les petits laboratoires ou études sans fonds peuvent choisir de ne pas utiliser ces nouveaux outils puissants de génomique du paysage et des populations en raison des coûts de mise en œuvre du protocole (p. ex. les coûts des instruments spécialisés).

Ici, un protocole d’extraction d’ADN modifié est présenté qui utilise une étape d’extraction de perles magnétique similaire à celle de Neiman et al.¹ pour obtenir de l’ADN de haute pureté, mais ne repose pas sur des instruments coûteux pour la lyse tissulaire et l’extraction de l’ADN. Ce protocole convient aux expériences nécessitant >10 ng d’ADN de haute qualité.

Protocole

1. Entreposage général des échantillons et préparations avant l’extraction de l’ADN

1. Hydrater l’échantillon dans de l’eau de qualité PCR de 100 μL pendant 1 h (ou pendant la nuit) à 4 °C si l’échantillon a été conservé dans de l’alcool de >70 % pour adoucir le tissu.

2. Perturbation de l’échantillon

1. Réglez un incubateur ou un bloc chauffant secouant à 56 °C.
2. Faire de la protéinase K (PK) tampon/mélange d’enzymes. 2 μL de protéinase K (100 mg/mL) et 98 μL de tampon protéinase K (total 100 μL) sont nécessaires pour chaque extraction individuelle du moustique. Pour préparer un mélange maître pour plusieurs spécimens, augmenter la quantité totale (combinée pour tous les spécimens individuels) d’environ 15% pour assurer la disponibilité d’un volume adéquat.
3. Si les échantillons ont été hydratés avant l’extraction, jetez l’eau de chaque tube d’échantillonnage.
4. Dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant du tissu de moustique, ajouter 100 μL de tampon PK/mélange d’enzymes.
5. Homogénéiser le tissu à l’aide d’un pilon à tube microcentrifuge.
6. Centrifuger les échantillons pendant 1 min à 9 600 x g à température ambiante.
7. Incuber l’échantillon pendant 2-3 h à 56 °C.
8. Pendant l’incubation, préparer les autres réactifs à l’aide de l’étape d’extraction de l’ADN (étape 3).

3. Extraction de l’ADN

1. Faire un mélange maître de perles magnétiques. Pour chaque échantillon, mélanger 100 μL de tampon de lyse, 100 μL d’isopropanol et 15 μL de billes magnétiques (total de 215 μL). Pour préparer un mélange maître pour les réactions multiples, augmenter la quantité totale (combinée pour tous les échantillons individuels) d’environ 20% pour assurer la disponibilité d’un volume adéquat.
2. Après le temps d’incubation (étape 2.7), transférer chaque lysat dans un tube microcentrifuge propre ou un puits de microplaque à l’aide d’une pipette.
3. Ajouter 100 μL de lysat et 215 μL du mélange maître de perles magnétiques à chaque échantillon.
4. Utilisez une pipette pour bien le mélanger pendant 10-20 s, puis laissez-le reposer pendant 10 min à température ambiante. Secouez doucement le tube de temps en temps pour maximiser la liaison des perles magnétiques et de l’ADN.
5. Placez le tube/la plaque sur le séparateur de perles magnétiques et attendez que la solution soit claire.
6. Jetez le liquide du tube ou de la plaque à l’aide d’une pipette. Lorsque vous retirez le surnageant, essayez de ne pas toucher ou déranger les perles magnétiques qui maintiennent l’ADN.
7. Éloignez le tube ou la plaque du séparateur de perles magnétiques et ajoutez 325 μL de tampon de lavage 1 à chaque puits.
8. Bien mélanger par pipetage et incuber pendant 1 min à température ambiante.
9. Répétez les étapes 3.5-3.6.
10. Éloignez le tube ou la plaque du séparateur de perles magnétiques et ajoutez 250 μL de tampon de lavage 1 à chaque puits.
11. Bien mélanger par pipetage et incuber pendant 1 min à température ambiante.
12. Répétez les étapes 3.5-3.6.
13. Éloignez le tube ou la plaque du séparateur de billes magnétiques et ajoutez 250 μL de tampon de lavage 2 à chaque échantillon.
14. Bien mélanger et incuber pendant 1 min à température ambiante.
15. Répétez les étapes 3.5-3.6.
16. Éloignez le tube ou la plaque du séparateur de perles magnétiques et ajoutez 250 μL de tampon de lavage 2 à chaque puits.
17. Bien mélanger et incuber pendant 1 min à température ambiante.
18. Répétez les étapes 3.5-3.6.
19. Éloignez le tube ou la plaque du séparateur de billes magnétiques et ajoutez 100 μL de tampon d’élution à chaque puits.
20. Bien mélanger et incuber pendant 2 min à température ambiante.
21. Déplacez le tube/la plaque sur le séparateur de billes magnétiques et attendez que la solution soit claire.
22. Pipettez le surnageant dans un nouveau tube ou microplaque propre de 0,5 microcentrifuge.
23. Conserver les échantillons d’ADN à 4 °C (jusqu’à 1 semaine) ou -80 °C.  Si une microplaque est utilisée, couvrez-la de parafilm.
24. Déterminer les rendements en ADN à l’aide de toute méthode appropriée.
    REMARQUE: Dans cette étude, la lecture et l’absorbance du fluoromètre à ADN à 260/280 nm ont été utilisées.

Résultats

Le rendement moyen en ADN par tissu de tête/thorax de moustique était de 4,121 ng/μL (N = 92, écart-type de 3,513) mesuré à l’aide d’un fluoromètre lorsqu’il était élué à l’aide de 100 μL de tampon d’élution. Ceci est suffisant pour les besoins d’entrée d’ADN génomique de 10 à 30 ng nécessaires à la construction de la bibliothèque de génomes^{entiers 1,7.} La quantité d’ADN peut varier entre 0,3 et 29,7 ng/μL selon la taille cor...

Discussion

Le protocole décrit ici peut être adapté à d’autres espèces d’insectes. La version originale du protocole introduit dans Nieman et al.¹ a été testée sur plusieurs espèces, y compris Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta, et Keiferia ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AE Buffer	Qiagen	19077	Elution buffer
AL Buffer	Qiagen	19075	Lysis buffer
AW1 Buffer	Qiagen	19081	Washing buffer 1
AW2 Buffer	Qiagen	19072	Washing buffer 2
MagAttract Suspension G	Qiagen	1026901	magnetic bead
Magnetic bead separator	Epigentek	Q10002-1
Nanodrop	ThermoFisher	ND-2000	microvolume spectrophotometer
PK Buffer	ThermoFisher	4489111	Proteinase K buffer
Proteinase K	ThermoFisher	A25561
Qubit	Invitrogen	Q33238	fluorometer