차세대 시퀀싱을 위한 자기 비드 기반 모기 DNA 추출 프로토콜

요약

여기에 설명된 DNA 추출 프로토콜은 모기에서 고품질의 DNA 추출을 생성하기 위하여 자기 구슬을 사용하여 입니다. 이러한 추출은 다운스트림 차세대 시퀀싱 접근 방식에 적합합니다.

초록

마그네틱 비즈와 자동화된 DNA 추출 기기를 사용하여 최근에 발표된 DNA 추출 프로토콜은 다운스트림 전체 게놈 시퀀싱에 충분한 잘 보존된 개별 모기로부터 고품질 및 수량 DNA를 추출할 수 있음을 시사했습니다. 그러나 고가의 자동화 된 DNA 추출 기기에 대한 의존은 많은 실험실에서 금지 될 수 있습니다. 여기서, 연구 결과는 저중간 처리량에 적합한 예산 친화적인 자기 비드 기지를 둔 DNA 추출 프로토콜을 제공합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 개별 Aedes aegypti 모기 견본을 사용하여 성공적으로 시험되었습니다. 고품질 DNA 추출과 관련된 비용 절감은 자원 제한된 실험실 및 연구에 높은 처리량 시퀀싱의 적용을 증가시킬 것이다.

서문

최근 개선된 DNA 추출 프로토콜^1의 개발로 전체 게놈 시퀀싱^2,3,4,5,6을포함하는 많은 고충격 다운스트림 연구를^허용하고있다. 이 자기 비드 기반 DNA 추출 프로토콜은 개별 모기 샘플에서 신뢰할 수있는 DNA 수율을 제공하므로 필드 수집에서 충분한 수의 샘플을 획득하는 데 드는 비용과 시간을 줄입니다.

인구와 조경 유전체학의 최근 발전은 전체 게놈 시퀀싱의 비용 감소와 직접적으로 상관관계가 있습니다. 이전 DNA 추출 프로토콜^1은 높은 처리량 시퀀싱과 관련된 효율성을 증가하지만, 자금이없는 작은 실험실 / 연구는 프로토콜 (예를 들어, 특수 기기의 비용)을 구현하는 비용으로 인해 이러한 새로운 강력한 풍경 및 인구 유전체 학 도구를 사용하지 않을 수 있습니다.

여기서, 수정된 DNA 추출 프로토콜은 Neiman^{외. 1과} 유사한 자기 비드 추출 단계를 사용하여 고순도 DNA를 얻지만 조직 용해 및 DNA 추출을 위한 고비용 기기에 의존하지 않는다는 것을 제시한다. 이 프로토콜은 고품질 DNA의 >10 ng를 요구하는 실험에 적합합니다.

프로토콜

1. DNA 추출 전에 일반 샘플 저장 및 준비

1. 샘플을 조직을 부드럽게 하기 위해 >70% 알코올에 저장된 경우 4°C에서 1시간(또는 하룻밤)에 100 μL PCR 급 수분으로 샘플을 수화한다.

2. 샘플 중단

1. 인큐베이터 또는 흔들림 열 블록을 56°C에서 설정합니다.
2. 단백질 효소 K (PK) 버퍼/ 효소 믹스를 만듭니다. 단백질제 K(100 mg/mL)의 2μL과 98μL의 단백질제 K 버퍼(총 100μL)는 각 개별 모기 추출에 필요합니다. 여러 시편에 대한 마스터 믹스를 준비하려면 적절한 부피의 가용성을 보장하기 위해 총 양(모든 개별 시편에 대한 결합)을 ~15% 증가시합니다.
3. 추출 하기 전에 샘플 수화 된 경우, 각 샘플 튜브에서 물을 폐기.
4. 모기 조직을 포함하는 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브에서 PK 완충 /효소 혼합물의 100 μL을 추가하십시오.
5. 마이크로 원심 분리기 튜브 유봉을 사용하여 조직을 균질화합니다.
6. 실온에서 9,600 x g에서 1 분 동안 샘플을 원심 분리합니다.
7. 56°C에서 2-3h의 시료를 배양한다.
8. 인큐베이션 하는 동안, DNA 추출 단계(단계 3)를 사용하여 다른 시약을 준비한다.

3. DNA 추출

1. 마그네틱 비드 마스터 믹스를 만드세요. 각 샘플에 대해, 용해 버퍼 100 μL, 이소프로판올 100 μL, 자기 비드 15 μL(총 215 μL)를 혼합합니다. 여러 반응에 대한 마스터 믹스를 준비하려면 적절한 부피의 가용성을 보장하기 위해 총 양(모든 개별 표본에 대한 결합)을 ~20% 증가시합니다.
2. 인큐베이션 시간(2.7단계)이 끝나면 각 리세이트를 깨끗한 미세원심분리기 튜브 또는 파이펫을 사용하여 마이크로플레이트로 옮김한다.
3. 각 샘플에 마그네틱 비드 마스터 믹스의 100 μL lysate 및 215 μL을 추가합니다.
4. 파이펫을 사용하여 10-20 s에 잘 섞은 다음 실온에서 10 분 동안 방치하십시오. 간으로 튜브를 부드럽게 흔들어 자기 구슬과 DNA의 결합을 최대화합니다.
5. 자기 비드 분리기위에 튜브/플레이트를 놓고 용액이 명확해질 때까지 기다립니다.
6. 파이펫을 사용하여 튜브 / 접시에서 액체를 버리십시오. 상체를 제거할 때 DNA를 들고 있는 자기 구슬을 만지거나 방해하지 않도록 하십시오.
7. 튜브/플레이트를 자기 비드 분리기에서 멀리 이동하고 각 우물에 325 μL의 세척 버퍼 1을 추가합니다.
8. 피펫팅으로 철저히 섞고 실온에서 1분 동안 배양합니다.
9. 3.5-3.6 단계를 반복합니다.
10. 튜브/플레이트를 자기 비드 분리기에서 멀리 이동하고 각 우물에 250 μL의 세척 버퍼 1을 추가합니다.
11. 피펫팅으로 철저히 섞고 실온에서 1분 동안 배양합니다.
12. 3.5-3.6 단계를 반복합니다.
13. 튜브/플레이트를 자기 비드 분리기에서 멀리 이동하고 각 샘플에 250 μL의 세척 버퍼 2를 추가합니다.
14. 철저히 섞어서 실온에서 1분 동안 인큐베이션합니다.
15. 3.5-3.6 단계를 반복합니다.
16. 튜브/플레이트를 자기 비드 분리기에서 멀리 이동하고 각 우물에 250 μL의 세척 버퍼 2를 추가합니다.
17. 철저히 섞어서 실온에서 1분 동안 인큐베이션합니다.
18. 3.5-3.6 단계를 반복합니다.
19. 자기 비드 분리기에서 튜브 /플레이트를 이동하고 각 우물에 용출 버퍼 100 μL을 추가합니다.
20. 철저히 섞어서 실온에서 2분 동안 배양하십시오.
21. 자기 비드 분리기위에 튜브/플레이트를 이동하고 용액이 명확해질 때까지 기다립니다.
22. 새로운 깨끗한 0.5 마이크로 센심 분리기 튜브 또는 마이크로 플레이트에 피펫.
23. DNA 샘플을 4°C(최대 1주) 또는 -80°C로 저장합니다.  마이크로 플레이트를 사용하는 경우 파라필름으로 덮습니다.
24. 적절한 방법을 사용하여 DNA 수율을 결정합니다.
    참고: 이 연구에서는 260/280 nm에서 DNA 불소계 판독 및 흡광도를 활용했습니다.

결과

개별 모기 헤드/흉부 조직당 평균 DNA 수율은 용출 버퍼 100μL을 사용하여 용출할 때 형광계를 사용하여 측정된 4.121 ng/μL(N= 92, 표준 편차 3.513)이었다. 이는 전체 게놈 라이브러리 시공^1,7에필요한 10-30 ng 게놈 DNA 입력 요구 사항에 충분합니다. DNA의 양은 모기 체 크기와 보존 조건에 따라 0.3-29.7 ng/μL 사이에서 다를 수 있습니다. 높은 가변성 중 일부는 연구...

토론

여기에 설명된 프로토콜은 다른 곤충 종에 맞게 조정할 수 있다. Nieman 외^1에 도입 된 프로토콜의원래 버전은 Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, 아노펠레스 아라비엔시스, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AE Buffer	Qiagen	19077	Elution buffer
AL Buffer	Qiagen	19075	Lysis buffer
AW1 Buffer	Qiagen	19081	Washing buffer 1
AW2 Buffer	Qiagen	19072	Washing buffer 2
MagAttract Suspension G	Qiagen	1026901	magnetic bead
Magnetic bead separator	Epigentek	Q10002-1
Nanodrop	ThermoFisher	ND-2000	microvolume spectrophotometer
PK Buffer	ThermoFisher	4489111	Proteinase K buffer
Proteinase K	ThermoFisher	A25561
Qubit	Invitrogen	Q33238	fluorometer