JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, sivrisineklerden yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonları üretmek için manyetik boncuklar kullanan bir DNA ekstraksiyon protokolü açıklanmıştır. Bu ekstraksiyonlar, aşağı akış yeni nesil sıralama yaklaşımı için uygundur.

Özet

Manyetik boncuklar ve otomatik bir DNA ekstraksiyon cihazı kullanılarak yakın zamanda yayınlanan bir DNA ekstraksiyon protokolü, tüm genom dizilimleri için yeterli olan iyi korunmuş bir bireysel sivrisinekten yüksek kalite ve miktar DNA'sı çıkarmanın mümkün olduğunu öne sürdü. Bununla birlikte, pahalı bir otomatik DNA çıkarma cihazına güvenmek birçok laboratuvar için yasaklayıcı olabilir. Burada, çalışma düşük ila orta verim için uygun olan bütçe dostu manyetik boncuk bazlı BIR DNA ekstraksiyon protokolü sağlar. Burada açıklanan protokol, bireysel Aedes aegypti sivrisinek örnekleri kullanılarak başarıyla test edildi. Yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonu ile ilişkili düşük maliyetler, kaynak sınırlı laboratuvarlara ve çalışmalara yüksek verim diziliminin uygulanmasını artıracaktır.

Giriş

Geliştirilmiş bir DNA ekstraksiyon protokolü1'in son gelişimi, tüm genom dizilimini içeren birçok yüksek etkili aşağı akış çalışmasına izin verdi2,3,4,5,6. Bu manyetik boncuk bazlı DNA ekstraksiyon protokolü, bireysel sivrisinek örneklerinden güvenilir DNA verimi sağlar ve bu da alan koleksiyonlarından yeterli sayıda örnek elde etmekle ilgili maliyet ve zamanı azaltır.

Nüfus ve peyzaj genomiklerindeki son gelişmeler, tüm genom diziliminin azalan maliyetleri ile doğrudan ilişkilidir. Önceki DNA ekstraksiyon protokolü1, yüksek verim sıralaması ile ilişkili verimliliği artırsa da, fonlar olmadan daha küçük laboratuvarlar / çalışmalar, protokolün uygulanması maliyetleri (örneğin, özel aletlerin maliyetleri) nedeniyle bu yeni güçlü peyzaj ve popülasyon genomik araçlarını kullanmaktan vazgeçebilir.

Burada, yüksek saflıkta DNA elde etmek için Neiman ve ark.1 ile benzer bir manyetik boncuk ekstraksiyon adımı kullanan ancak doku lizisi ve DNA ekstraksiyonu için yüksek maliyetli araçlara dayanmayan değiştirilmiş bir DNA ekstraksiyon protokolü sunulmuştur. Bu protokol, >10 ng yüksek kaliteli DNA gerektiren deneyler için uygundur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. DNA ekstraksiyonu öncesinde genel numune depolama ve hazırlıklar

  1. Numune, dokuyu yumuşatmak için % 70 alkol > depolanmışsa, numuneyi 4 °C'de 1 saat (veya gece boyunca) 100 μL PCR sınıfı suda nemlendirin.

2. Örnek bozulması

  1. 56 °C'de bir inkübatör veya sallama ısı bloğu ayarlayın.
  2. Proteinaz K (PK) tampon/enzim karışımı yapın. Her bir sivrisinek ekstraksiyonu için 2 μL Proteinaz K (100 mg/mL) ve 98 μL Proteinaz K Tamponu (toplam 100 μL) gereklidir. Birden fazla numune için ana karışım hazırlamak için, yeterli hacmin kullanılabilirliğini sağlamak için toplam miktarı (tüm bireysel numuneler için birleştirilmiş) ~% 15 artırın.
  3. Numuneler ekstraksiyondan önce nemlendirilmişse, her numune tüpünden su atın.
  4. Sivrisinek dokusu içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne 100 μL PK tampon/enzim karışımı ekleyin.
  5. Mikrosantrifüj tüp pestle kullanarak dokuyu homojenize edin.
  6. Numuneleri oda sıcaklığında 9.600 x g'da 1 dakika santrifüj edin.
  7. Numuneyi 56 °C'de 2-3 saat kuluçkaya yatırın.
  8. Kuluçka sırasında, DNA ekstraksiyon adımını kullanarak diğer reaktifleri hazırlayın (adım 3).

3. DNA ekstraksiyonu

  1. Manyetik boncuk ana karışımı yapın. Her numune için 100 μL lizis tamponu, 100 μL İzopropanol ve 15 μL manyetik boncuk (toplam 215 μL) karıştırın. Birden fazla reaksiyon için ana karışım hazırlamak için, yeterli hacmin kullanılabilirliğini sağlamak için toplam miktarı (tüm bireysel numuneler için birleştirilmiş) ~% 20 artırın.
  2. Kuluçka süresinden sonra (adım 2.7), her bir lisatı pipet kullanarak temiz bir mikrosantrifüj tüpüne veya bir mikro plaka kuyusuna aktarın.
  3. Her numuneye 100 μL lysate ve 215 μL manyetik boncuk ana karışımı ekleyin.
  4. 10-20 s için iyice karıştırmak için bir pipet kullanın ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. Manyetik boncukların ve DNA'nın bağlanmasını en üst düzeye çıkarmak için tüpü ara sıra hafifçe sallayın.
  5. Tüpü/plakayı manyetik boncuk ayırıcıya yerleştirin ve çözelti temizlenine kadar bekleyin.
  6. Pipet kullanarak sıvıyı tüpten/plakadan atın. Süpernatant çıkarılırken, DNA'yı tutan manyetik boncuklara dokunmamaya veya rahatsız etmemeye çalışın.
  7. Tüpü/plakayı manyetik boncuk ayırıcıdan uzaklaştırın ve her kuyuya 325 μL yıkama tamponu 1 ekleyin.
  8. Pipetleme ile iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 1 dakika kuluçkaya yatırarak karıştırın.
  9. 3.5-3.6 arası adımları yineleyin.
  10. Tüpü/plakayı manyetik boncuk ayırıcıdan uzaklaştırın ve her kuyuya 250 μL yıkama tamponu 1 ekleyin.
  11. Pipetleme ile iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 1 dakika kuluçkaya yatırarak karıştırın.
  12. 3.5-3.6 arası adımları yineleyin.
  13. Tüpü/plakayı manyetik boncuk ayırıcıdan uzaklaştırın ve her numuneye 250 μL yıkama tamponu 2 ekleyin.
  14. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 1 dakika kuluçkaya yatır.
  15. 3.5-3.6 arası adımları yineleyin.
  16. Tüpü/plakayı manyetik boncuk ayırıcıdan uzaklaştırın ve her kuyuya 250 μL yıkama tamponu 2 ekleyin.
  17. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 1 dakika kuluçkaya yatır.
  18. 3.5-3.6 arası adımları yineleyin.
  19. Tüpü/plakayı manyetik boncuk ayırıcıdan uzağa taşıyın ve her kuyuya 100 μL elution tamponu ekleyin.
  20. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 2 dakika kuluçkaya yatır.
  21. Tüpü/plakayı manyetik boncuk ayırıcının üzerine taşıyın ve çözelti net olana kadar bekleyin.
  22. Süpernatantı yeni bir temiz 0.5 mikrosantrifüj tüpüne veya mikro plaka kuyusuna pipet.
  23. DNA örneklerini 4 °C (1 haftaya kadar) veya -80 °C'de saklayın.  Bir mikro plaka kullanılıyorsa, parafilm ile örtün.
  24. Uygun bir yöntem kullanarak DNA verimini belirleyin.
    NOT: Bu çalışmada 260/280 nm'de DNA florometre okuma ve absorbans kullanılmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bireysel sivrisinek başı/toraks dokusu başına ortalama DNA verimi 100 μL elüasyon tamponu kullanılarak elde edildiğinde florometre kullanılarak ölçülen 4.121 ng/μL (N = 92, standart sapma 3.513) idi. Bu, tüm genom kütüphanesi yapımı için gerekli olan 10-30 ng genomik DNA giriş gereksinimleri için yeterlidir1,7. DNA miktarı, sivrisinek vücut büyüklüğüne ve koruma koşullarına bağlı olarak 0,3-29,7 ng/μL arasında değişebilir. Yük...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada açıklanan protokol diğer böcek türleri için uyarlanabilir. Nieman ve ark.1'de sunulan protokolün orijinal versiyonu, Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, dahil olmak üzere birden fazla tür üzerinde test edilmiştir. An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta ve Keiferia ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

ABD Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (Kooperatif Anlaşması 1U01CK000516), CDC hibeSI NU50CK000420-04-04 tarafından finanse edilen Pasifik Güneybatı Vektör Kaynaklı Hastalıklar Bölgesel Mükemmeliyet Merkezi'nden fon desteğini kabul ediyoruz, USDA Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü (Hatch projesi 1025565), Tse-Yu Chen'e UF/IFAS Florida Tıbbi Entomoloji Laboratuvarı bursu, NSF CAMTech IUCRC Faz II hibesi (AWD05009_MOD0030) ve Florida Sağlık Bakanlığı (Sözleşmeli CODQJ). Bu makaledeki bulgular ve sonuçlar yazar(lar)ın bulgularıdır ve abd Balık ve Yaban Hayatı Servisi'nin görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
AE BufferQiagen19077Elution buffer
AL BufferQiagen19075Lysis buffer
AW1 BufferQiagen19081Washing buffer 1
AW2 BufferQiagen19072Washing buffer 2
MagAttract Suspension GQiagen1026901magnetic bead
Magnetic bead separatorEpigentekQ10002-1
NanodropThermoFisherND-2000microvolume spectrophotometer
PK BufferThermoFisher4489111Proteinase K buffer
Proteinase KThermoFisherA25561
QubitInvitrogenQ33238fluorometer

Referanslar

  1. Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314(2015).
  2. Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204(2019).
  3. Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425(2020).
  4. Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473(2019).
  5. Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
  6. Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303(2016).
  7. Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211(2016).
  8. Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
  9. Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
  10. Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
  11. Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 170DNA ekstraksiyonusivrisinekb cek

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır