JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقدم هذه الورقة طريقة تطوير وتوصيف وتتبع في الوقت الفعلي ورم خبيث في نموذج الزرد من الورم الأرومي العصبي ، وتحديدا في خط الزرد المعدل وراثيا مع الإفراط في التعبير عن MYCN و LMO1 ، والذي يتطور ورم خبيث تلقائيا.

Abstract

برزت أسماك الزرد كنموذج حيواني مهم لدراسة الأمراض البشرية ، وخاصة السرطان. جنبا إلى جنب مع تقنيات تحرير الجينات والجينوم القوية المطبقة في نمذجة أسماك الزرد ، فإن سهولة الصيانة والإنتاجية عالية الغلة والتصوير الحي القوي تجعل من الزرد نظاما نموذجيا قيما لدراسة ورم خبيث وقواعد خلوية وجزيئية كامنة وراء هذه العملية في الجسم الحي. تم تطوير أول نموذج للورم الأرومي العصبي لأسماك الزرد (NB) من ورم خبيث عن طريق الإفراط في التعبير عن اثنين من الجينات السرطانية ، MYCN و LMO1 ، تحت سيطرة مروج الدوبامين - بيتا - هيدروكسيلاز (dβh). أدى الإفراط في التعبير المشترك عن MYCN و LMO1 إلى تقليل الكمون وزيادة اختراق الورم الأرومي العصبي ، بالإضافة إلى تسارع الانبثاث البعيد للخلايا السرطانية. ويكرر هذا النموذج الجديد بشكل موثوق العديد من السمات الرئيسية للنموي البشري الخبيث، بما في ذلك مشاركة التعديلات الجينية ذات الصلة سريريا والمرتبطة بالانبثاث؛ التطور الطبيعي والتلقائي للورم الخبيث في الجسم الحي ؛ والمواقع المحفوظة من النقائل. لذلك ، يمتلك نموذج الزرد مزايا فريدة لتشريح العملية المعقدة لورم خبيث في الجسم الحي.

Introduction

تم استخدام الزرد على نطاق واسع وتطبيقه على العديد من مجالات البحث ، وخاصة في مجال السرطان. يوفر هذا النموذج العديد من المزايا - مثل تكاثره القوي ، وصيانته الفعالة من حيث التكلفة ، والتصور متعدد الاستخدامات لنمو الورم والانبثاث - وكلها تجعل من الزرد أداة قوية لدراسة والتحقيق في القواعد الخلوية والجزيئية لتكوين الورم والانبثاث. وقد أدت التقنيات الجديدة لرسم خرائط الجينوم على نطاق واسع، والتحول الجنسي، والتعبير المفرط عن الجينات أو الضربة القاضية، وزرع الخلايا، والشاشات الكيميائية إلى زيادة كبيرة في قوة نموذج الزرد1. خلال السنوات القليلة الماضية ، تم تطوير العديد من خطوط الزرد لدراسة تكوين الأورام والانبثاث لمجموعة متنوعة من أنواع السرطان البشرية ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر سرطان الدم وسرطان الجلد والساركوما العضلية المخططة وسرطان الخلايا الكبدية2،3،4،5. بالإضافة إلى ذلك ، تم إنشاء أول نموذج لأسماك الزرد من الورم الأرومي العصبي (NB) عن طريق الإفراط في التعبير عن MICN ، وهو جين ورمي ، في الجهاز العصبي الودي المحيطي (PSNS) تحت سيطرة مروج الدوبامين بيتا هيدروكسيلاز (dβh). مع هذا النموذج ، ثبت أيضا أن ALK المنشط يمكن أن يتآزر مع MYCN لتسريع ظهور الورم وزيادة اختراق الورم في الجسم الحي 6.

NB مشتق من السلالة الودية الكظرية لخلايا القمة العصبية ، وهو سرطان نقيلي للغاية عند الأطفال7. وهو مسؤول عن 10٪ من الوفيات المرتبطة بسرطان الأطفال8. ينتشر NB على نطاق واسع عند التشخيص ، ويمكن تقديمه سريريا على أنه أورام تنشأ في المقام الأول على طول سلسلة العقد الودية والنخاع الكظري من PSNS9,10. يرتبط تضخيم MYCN عادة بالنتائج السيئة في مرضى NB 11,12. وعلاوة على ذلك، تم تحديد LMO1 كجين حساس حاسم للقابلية للإصابة بالفيروس NB في الحالات عالية الخطورة13,14. وجدت الدراسات أن التعبير المشترك المعدل وراثيا ل MYCN و LMO1 في PSNS لنموذج الزرد لا يعزز فقط الظهور المبكر ل NB ، ولكنه يحفز أيضا على ورم خبيث واسع النطاق في الأنسجة والأعضاء التي تشبه المواقع التي شوهدت عادة في المرضى الذين يعانون من NB13 عالية الخطورة. في الآونة الأخيرة ، لوحظ أيضا نمط ظاهري نقيلي آخر من NB في نموذج أحدث لأسماك الزرد من NB ، حيث يتم التعبير عن كل من MYCN و Lin28B ، اللذين يشفران بروتين ربط الحمض النووي الريبي ، تحت سيطرة المروج dβh 16.

غالبا ما يستخدم النهج المعدل وراثيا المستقر في أسماك الزرد لدراسة ما إذا كان الإفراط في التعبير عن جين ذي أهمية يمكن أن يساهم في التطور الطبيعي وإمراض المرض14,15. تم استخدام هذه التقنية بنجاح لإثبات أهمية الجينات والمسارات المتعددة لتكوين الأورام NB 6,16,17,18,19,20. ستقدم هذه الورقة كيف تم إنشاء خط الأسماك المعدلة وراثيا الذي يبالغ في التعبير عن كل من MYCN و LMO1 في PSNS وكيف ثبت أن تعاون هذين الجينين الورميين يسرع من ظهور الورم NB والانبثاث 13. أولا ، تم تطوير الخط المعدل وراثيا الذي يبالغ في التعبير عن EGFP-MYCN تحت سيطرة المروج dβh (خط MYCN المعين) عن طريق حقن بنية dβh-EGFP-MYCN في مرحلة خلية واحدة من أجنة AB من النوع البري (WT) ، كما هو موضح سابقا6,17. تم تطوير خط منفصل معدل وراثيا يبالغ في التعبير عن LMO1 في PSNS (خط LMO1 المعين) عن طريق المشاركة في حقن اثنين من تركيبات الحمض النووي ، dβh-LMO1 و dβh-mCherry ، في أجنة WT في مرحلة الخلية الواحدة13. وقد ثبت سابقا أن تركيبات الحمض النووي المزدوج المحقونة يمكن دمجها في جينوم الأسماك. لذلك ، يتم التعبير عن LMO1 و mCherry في خلايا PSNS للحيوانات المعدلة وراثيا. بمجرد أن تصل أجنة F0 المحقونة إلى مرحلة النضج الجنسي ، يتم تجاوزها مع أسماك WT لتحديد الأسماك الإيجابية ذات التكامل الجيني (الجينات) المحورة. باختصار ، تم فحص ذرية F1 لأول مرة بواسطة المجهر الفلورسنت للتعبير عن mCherry في خلايا PSNS. كما تم تأكيد تكامل الخط الجرثومي للكائن الحي المحور1 في الأسماك إيجابية mCherry من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل الجيني والتسلسل. وبعد النجاح في تحديد كل خط معدل وراثيا، تزاوج ذرية الأسماك المحورة وراثيا من نوع MYCN غير المتجانسة والأسماك المعدلة وراثيا (LMO1) لتوليد خط أسماك مركب يعبر عن كل من MYCN و LMO1 (المسمى MYCN; خط LMO1). MYCN الحاملة للورم. ورصد المجهر الفلوري 1 الأسماك المحورة 1 كل أسبوعين بحثا عن أدلة على وجود أورام نقلية في المناطق البعيدة عن الموقع الرئيسي، وهي منطقة الغدة بين الكلى (IRG، مكافئ أسماك الزرد للغدة الكظرية البشرية)13. لتأكيد ورم خبيث من الأورام في MYCN; وطبقت التحليلات الكيميائية النسيجية والنسيجية والنسيجية والكيميائية المناعية للكائنات الحية المحورة 1.

Protocol

تم تنفيذ جميع طرق البحث باستخدام أسماك الزرد ورعاية/صيانة الحيوانات وفقا للإرشادات المؤسسية في Mayo Clinic.

1. التحضير والحقن المجهري للتركيبات الجينية المحورة لتطوير خط الزرد المحورة وراثيا LMO1 مع الإفراط في التعبير في PSNS

  1. لتطوير استنساخ دخول LMO1-pDONR221 ، تضخيم منطقة ترميز LMO1 البشري من cDNA التي تم الحصول عليها من خط الخلايا البشرية باستخدام PCR.
    1. قم بعمل تفاعل 25 ميكرولتر كما هو مفصل هنا: 2.5 ميكرولتر من 10x معيار Taq Reaction Buffer ، 0.125 μL من Taq DNA Polymerase ، 0.5 μL من 10 mM dNTPs ، 2 μL من قالب cDNA ، 0.5 μL من 10 μM إلى الأمام LMO1 ATTB1 التمهيدي ، 0.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر من LMO1 ATTB2 التمهيدي ، و 18.875 ميكرولتر من الماء.
      ملاحظة: استخدم التمهيدي LMO1 ATTB1 الأمامي: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACAC-3'.
      CATGATGGTGCTGGACAAGGAGGA-3' وعكس LMO1 ATTB2 التمهيدي: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACT
      GAACTTGGGATTCAAAGGT-3'
    2. تضخيم باستخدام البرنامج التالي: 1 دورة من 94 درجة مئوية ، 2 دقيقة ؛ تليها 30 دورة من (94 درجة مئوية ، 30 ثانية ، 55 درجة مئوية ، 30 ثانية ، 72 درجة مئوية ، 1 دقيقة) و 72 درجة مئوية ، 7 دقائق.
  2. استنساخ منتج PCR LMO1 في متجه المتبرع ببوابة pDONR221 بواسطة تفاعل BP recombinase 6,13 (جزء PCR + متجه المتبرع = استنساخ الدخول).
    1. للحصول على تفاعل 10 ميكرولتر، امزج 1 ميكرولتر من منتج LMO1 PCR النقي (150 نانوغرام/ميكرولتر)، و1 ميكرولتر (150 نانوغرام/ميكرولتر) pDONR221 ناقل مانح، و6 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE (الرقم الهيدروجيني 8.0) مع 2 ميكرولتر من مزيج إنزيم BP، واحتضن لمدة ساعة واحدة عند 25 درجة مئوية، وتحول إلى الإشريكية القولونية المختصة TOP10 باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة.
    2. بعد ذلك ، انشر 50-200 ميكرولتر من قارورة التحويل على صفيحة أجار لوريا بروث (LB) تحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاناميسين واحتضنها عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    3. اختر الحيوانات المستنسخة عن طريق تلقيح مستعمرة واحدة إلى 2-5 مل من LB مع 50 ميكروغرام / مل كاناميسين وزراعة بين عشية وضحاها (16-18 ساعة) عند 37 درجة مئوية.
    4. استخدم 2 مل من الثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها لعزل البلازميد وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. للتحقق من بلازميد LMO1 ، أرسل عينة البلازميد للتسلسل باستخدام التمهيدي M13-F (5- GTAAAACGACGGCCAG-3').
  3. لإنشاء استنساخ إدخال dβh-pDONRP4-P1R ، احصل على منتج dβh PCR 6,13 عن طريق تضخيم المنطقة المحفزة 5.2 كيلو بايت باستخدام استنساخ CH211-270H11 BAC كقالب لإعداد تفاعل 20 ميكرولتر كما هو موضح سابقا في الخطوة 1.1.1. استخدم معلمات برنامج PCR التالية: 94 درجة مئوية ، 2 دقيقة ؛ 10 دورات من 94 درجة مئوية ، 15 ثانية ، 50 درجة مئوية ، 30 ثانية ، 68 درجة مئوية ، 8 دقائق ؛ 30 دورة من 94 درجة مئوية ، 15 ثانية ، 53 درجة مئوية ، 30 ثانية ، 68 درجة مئوية ، 8 دقائق ؛ 68 درجة مئوية، 4 دقائق (مع التمهيدي الأمامي 5'GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTC
    CCCCTTTTTAGG-3' والتمهيدي العكسي 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTG
    TCGTCTTTTGA-3').
    ملاحظة: نظرا لقوالب الحمض النووي الطويلة في هذه الخطوة، تأكد من استخدام نظام PCR مناسب لتضخيم PCR بدقة.
  4. استنساخ منتج PCR dβh في متجه المتبرع بوابة pDONRP4-P1R بواسطة تفاعل BP recombinase 6,13 (جزء PCR + متجه المتبرع = استنساخ الدخول).
    1. امزج 1 ميكرولتر من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل dβh النقي (172 نانوغرام / uL) ، و 1 ميكرولتر (150 نانوغرام / ميكرولتر) من ناقل المتبرع pDONRP4-P1R ، و 6 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE (الرقم الهيدروجيني 8.0) مع 2 ميكرولتر من مزيج إنزيم BP في ما مجموعه تفاعل 10 ميكرولتر ، احتضن لمدة ساعة واحدة عند 25 درجة مئوية.
    2. قم بالتحويل إلى TOP10 E. coli المختصة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. اعزل البلازميد كما هو موضح في الخطوات 1.2.2-1.2.4 وتحقق من البلازميد عن طريق التسلسل باستخدام التمهيديات M13-F (5'-GTAAAACGACGGCCAG-3') و M13-R (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3').
  5. إنشاء بنية التعبير dβh:LMO1 .
    1. اجمع بين 1 ميكرولتر من كل استنساخ دخول (dβh-pDONRP4-P1R و LMO1-pDONR221 و p3E-polyA11) (20 fmole لكل منهما) ، و 1 ميكرولتر (60 نانوغرام / ميكرولتر) من متجه الوجهة المعدل مع مواقع التعرف على I-SceI ، و 4 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE (الرقم الهيدروجيني 8.0) الذي يحتوي على 2 ميكرولتر من مزيج إنزيم LR المؤتلف. احتضن هذا الخليط لمدة 1 ساعة عند 25 درجة مئوية.
    2. أثناء اتباع بروتوكول الشركة المصنعة ، قم بتحويل البكتيريا إلى TOP10 E. coli المختصة كيميائيا. اعزل البلازميد كما هو موضح في الخطوات 1.2.2-1.2.4 وتحقق من البلازميد عن طريق التسلسل باستخدام DBH Forward (5'-GAAGCTGTCAGGGTTGTG-3') و LMO1 (5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA-3') الاشعال .
  6. قم بإنشاء dβh:mCherry DNA مع نظام بوابة من خلال الجمع بين نسخ الدخول من مروج dβh 5.2-kb ، pME-mCherry ، و p3E-polyA في متجه الوجهة المعدل الذي يحتوي على مواقع التعرف على I-SceI كما هو مذكور سابقا في الخطوة 1.5.16. عزل البلازميد كما هو موضح في الخطوات 1.2.2-1.2.4 والتحقق من البلازميد عن طريق التسلسل باستخدام DBH Forward primer (5'-GAAGCTGTCAGGGTTGTG-3').
  7. قم بخطي بناء الحمض النووي dβh: LMO1 وبناء الحمض النووي dβh:mCherry (بنسبة 3:1 ، على التوالي) في إجمالي حجم تفاعل 15 ميكرولتر مع 1 ميكرولتر من إنزيم I-SceI (5 U / μL) و 0.75 ميكرولتر من المخزن المؤقت (10x) ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 4 ساعات أو بين عشية وضحاها. تأكد من أن تركيز الحمض النووي لا يتجاوز 750 نانوغرام في التفاعل.
  8. في اليوم التالي وبعد الخطية للتركيبات ، أضف 0.5 ميكرولتر من إنزيم I-SceI الطازج (5 U / μL) و 0.5 ميكرولتر من 0.5٪ من الفينول الأحمر إلى 5 ميكرولتر من إجمالي خليط الحمض النووي من الخطوة السابقة البالغة 1.7. الحقن الدقيق للمحلول الكلي (من 50-80 بيكوغرام من الحمض النووي الخطي) في أجنة AB من النوع البري أحادي الخلية (وما يصل إلى 500 جنين) باستخدام إبرة ماصة زجاجية قطرها 1.0 مم كما هو موضح سابقا17. تخزين خليط الحمض النووي المتبقي في -20 درجة مئوية للحقن في المستقبل.

2. فحص والتحقق من خط الأسماك المعدلة وراثيا LMO1 لانتقال الخط الجرثومي للكائنات الحية المحورة 1 و mCherry

  1. في 3-4 أيام بعد الإخصاب (dpf) ، قم بتخدير الأجنة المحقونة بنسبة 0.02٪ من التريكاين وفحصها بحثا عن تعبير mCherry الفلورسنت ، والذي يظهر في أي مكان في جميع أنحاء جسم السمكة بسبب التحول الفسيفسائي. انقل الأجنة إيجابية الكرز إلى طبق بتري بماء البيض العذب ورفع الأجنة إلى مرحلة النضج الجنسي وفقا لكتاب الزرد21.
    ملاحظة: توقع أن تختلف نسبة الأسماك الإيجابية اعتمادا على خبرة وتجربة موظفي البحوث. على سبيل المثال ، قد يكون لدى الهواة المبتدئين معدل تكامل منخفض يبلغ 10٪ ، مقارنة بالخبراء بنسبة ≥50٪.
  2. لتحديد الأسماك المؤسسة مع dβh: LMO1 و dβh:mCherry transgenes المدمجة في الخلايا الجرثومية ، تتقاطع أزواج مفردة من الأسماك F0 المحقونة الإيجابية للكرز F0 من الخطوة السابقة (2.1) مع أسماك WT AB. فحص جيل F1 للأجنة إيجابية mCherry عند 3-4 dpf.
  3. للتأكد من أن الأسماك إيجابية mCherry تحمل الجينات المحورة LMO1 ، اعزل gDNA من جنين واحد إيجابي F1 mCherry باستخدام المخزن المؤقت لاستخراج gDNA ، والذي يحتوي على: 12.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل 4x (500 ميكرولتر من 1 M Tris مع درجة حموضة 8.4 ، و 2.5 مل من 1 M كلوريد البوتاسيوم ، و 47 مل من المياه النقية) ، 35 ميكرولتر من المياه النقية ، و 2.5 ميكرولتر من بروتين K عند 10 ملغ / مل. احتضن العينة لمدة 16 ساعة عند 55 درجة مئوية، تليها 10 دقائق عند 98 درجة مئوية.
  4. استخدم gDNA المستخرج (2 ميكرولتر) كقالب للتنميط الجيني PCR مع الاشعال : LMO1 FW: 5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA -3' و LMO1 RV: 5'-CGAAGGCTGGGATCAGCTTG -3' ، وبرنامج PCR التالي: دورة واحدة من 94 درجة مئوية ، 10 دقائق ؛ 35 دورة من (94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ 68 درجة مئوية ، 30 ثانية) ؛ و 68 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. تأكد من الجزء المضخم 182 نقطة أساس عن طريق التسلسل.
  5. بعد تأكيد النمط الوراثي ، ارفع الأجنة F1 المتبقية الإيجابية للكرز إلى مرحلة النضج وفقا للمبادئ التوجيهية القياسية لكتاب الزرد 21. قص الزعانف والنمط الوراثي لها في عمر 2-3 أشهر باستخدام الخطوات 2.3-2.4 من البروتوكول أعلاه لزيادة تأكيد دمج الجين المحورة LMO1 في الأسماك.
    ملاحظة: ستكون سمكة F1 الإيجابية للكائنات الحية المحورة 1 هي الأسماك المستقرة المعدلة وراثيا [Tg(dβh:LMO1),Tg(dβh:mCherry)] (المعينة كخط LMO1 ).
  6. تولد F1 LMO1 الأسماك المعدلة وراثيا مستقرة مع الأسماك WT وتكرار حسب الحاجة لنشر هذا الخط.

3. تقاطع خطوط LMO1 و MYCN المعدلة وراثيا لإنشاء نموذج النقيلي

  1. بمجرد إنشاء خط الزرد المعدل وراثيا LMO1 ، تزاوج مع خط MYCN 6,17 لتطوير خط الأسماك المعدلة وراثيا غير المتجانس الزيجوت الذي يبالغ في التعبير عن كل من MYCN و LMO1.
  2. عند 1 dpf ، قم بفرز ذرية التقاطع الخارجي لتعبير EGFP باستخدام المجهر الفلوري المجسمة ، والذي يقدم كنقاط إيجابية EGFP في منطقة الدماغ الخلفي.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، إذا لم يتم فرز جميع الأجنة ل MYCN عند 1 DPF، قم برفع الأجنة إلى مرحلة البلوغ والنمط الوراثي عن طريق قص الزعانف واستخدام المبادئ التوجيهية المذكورة سابقا من الخطوات 2.3-2.4 لعزل الحمض النووي والنمط الجيني PCR، مع التمهيدي: MYCN-F (5'-ATT CAC CAT CAC TGT GCG TCC-3')؛ MYCN-R (5'-TGC ATC CTC ACT CTC CAC GTA-3' ، والبرنامج التالي مع بوليميراز Taq القياسي: دورة واحدة من 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، و 35 دورة من (94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 68 درجة مئوية لمدة 3 دقائق) ، و 68 درجة مئوية لمدة 7 دقائق مع حجم أمبليكون متوقع يبلغ 145 نقطة أساب.
  3. بعد فرز EGFP عند 1 dpf ، اعزل الأجنة التي تم فحصها في أطباق Petri منفصلة وقم بتسمية الأطباق على النحو التالي: MYCN+ (EGFP-positive) أو MYCN- (EGFP-negative).
  4. عند 3-4 dpf ، تصور وفرز الأجنة من كلتا المجموعتين (الخطوة 3.3) للتعبير عن LMO1 باستخدام مجهر فلوري مجسم. ابحث عن تعبير بروتين الفلورسنت الأحمر كبقع في كل من الخلايا العصبية العنقية المتفوقة وغير PSNS الدوبامينية في منطقة الرأس ، خاصة في النخاع المستطيل في الدماغ الخلفي6,13.
    ملاحظة: فحص mCherry/LMO1 قبل أن تصل الأجنة إلى 5 dpf، لأن مثانات السباحة المملوءة بالهواء تتطور بالكامل بحلول ذلك الوقت وستتسبب في طفو الأجنة، مما يؤدي إلى تركيز مجهري صعب لخلايا PSNS أثناء عملية الفرز.
  5. بمجرد الانتهاء من الفرز ، قم بعزل الأسماك التي تم فرزها إلى أربع مجموعات من الأنماط الجينية المختلفة والتسمية على النحو التالي. رفع الأسماك التي تم فرزها في ظروف متطابقة وفقا للبروتوكولات القياسية من كتاب الزرد21.
    1. MYCN-فقط (EGFP-إيجابي) ،
    2. LMO1 فقط (mCherry-positive) ،
    3. MYCN; LMO1 (EGFP و mCherry إيجابية مزدوجة) ،
    4. WT (EGFP و mCherry سالب مزدوج).

4. تصور عبء الورم في خطوط الزرد المعدلة وراثيا

  1. في 4 أسابيع بعد الإخصاب (wpf) ، قم بتخدير الأسماك المصنفة من الخطوة 3.5 مع 0.02٪ من التريكاين في طبق بتري.
  2. تصور الأورام باستخدام مجهر التألق المجسمة عن طريق قلب الأسماك بلطف باستخدام ملعقة معدنية على كلا الجانبين الجانبيين لرؤية الورم. توقع أن تظهر الأورام على شكل كتل EGFP مفردة أو مفردة أو مزدوجة EGFP و mCherry إيجابية تنشأ من منطقة الغدة بين الكلى (بالقرب من الرأس والكلى).
    ملاحظة: من الممكن أن يتم تقديم بداية الورم الأولية عادة مع كتلة إيجابية أكثر إشراقا وأكبر على جانب واحد من الغدة بين الكلى ، وهذا هو السبب في أنه من الأهمية بمكان تصور جانبي الأسماك لتجنب فقدان بداية الورم المبكرة.
  3. بعد تحديد الأسماك المحتملة الحاملة للورم ، اعزل الأسماك في خزان منفصل مع ملصقات مناسبة ، والتي تشمل تاريخ الميلاد ، وتاريخ فحص الورم ، والنمط الوراثي.
  4. في 6 wpf ، كرر الخطوات السابقة 4.1-4.3 لفحص الأسماك الحاملة للورم والأسماك غير الحاملة للورم مرة أخرى للتأكد من وجود أورام للأسماك الحاملة للورم التي تم فحصها مسبقا أو تحديد الأسماك الجديدة المحتملة الحاملة للورم ، على التوالي. ابحث عن الحجم المستدام أو المتزايد للكتلة الإيجابية الفلورية في الأسماك المؤكدة الحاملة للورم.
  5. بعد تحديد الأسماك الحاملة للورم ، راقبها كل أسبوعين للحصول على أدلة على هجرة الخلايا السرطانية ، والتي تظهر على شكل كتل ورم صغيرة إيجابية EGFP و / أو mCherry بعيدا عن الموقع الأساسي لتكوين الورم (منطقة الغدة بين الكلى). اعزل هذه الأسماك في خزانات منفصلة حسب الحاجة وقم بتصنيفها بشكل مناسب للإشارة إلى ورم خبيث محتمل.
  6. لمزيد من تأكيد الانبثاث ، استمر في تتبع هذه الأسماك بانتظام (كل أسبوعين) حتى تظهر كتل الورم الإيجابية الفلورية البعيدة زيادة واضحة في الحجم ، مما يشير إلى نمو الأورام في المواقع النقيلية.

5. معالجة الأنسجة وتقسيم البارافين للأسماك الحاملة للورم

ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوة لتوصيف الأورام الأولية و / أو النقيلية المطورة تلقائيا في MYCN و MYCN ؛ LMO1 الأسماك المعدلة وراثيا.

  1. بعد تحديد الأسماك الحاملة للورم والتحقق منها ، قم بالتضحية بالأسماك من الخطوة 4.6 في طبق بتري عن طريق غمر الأسماك في 0.02٪ من التريكاين للتخدير أولا ثم زيادة جرعة التريكاين حتى تتوقف الأسماك. قطع السمك إلى قطعتين - مع قطعة واحدة تحتوي على الرأس وجزء من القسم الأوسط من الجسم (بما في ذلك الورم) ، وقطعة أخرى مع بقية القسم الأوسط والذيل من السمكة.
  2. إصلاح كل من أقسام الأسماك مع 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في 1x PBS لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة على الهزاز. لتعزيز كفاءة التثبيت ، استبدل المخزن المؤقت ب PFA جديد بنسبة 4٪ لزيادة اختراق الأعضاء الداخلية بفعالية وسرعة. اترك السمك مع عازل تثبيت طازج على الروك عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها أو لمدة 48 ساعة.
    تحذير: PFA سامة. نظرا لأن الإجراءات الاحترازية والتخلص السليم من الكاشف يعتمد على لوائح مؤسستك ، فابحث عن الإرشادات المناسبة قبل استخدام الكاشف والتخلص منه.
  3. قبل المعالجة ، ضع العينة (العينات) في محلول مزيل الكلس السريع بنسبة 100٪ لمدة 15-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تأكد من استخدام حاوية غير معدنية وفحص العينة (العينات) طوال فترة الحضانة لمنع الإفراط في إزالة الكلس. إذا بدت أنسجة العينة متدهورة بشدة ، فضع العينة في الماء أو عند 4 درجات مئوية لإبطاء عملية إزالة الكلس.
  4. بمجرد إصلاحها وإزالة الكلس ، اغسل عينة (عينات) السمك بماء الصنبور الجاري لمدة 1 ساعة وضعها في كاسيت (كاسيت) المعالج. إذا كان هناك أكثر من عينة واحدة، فافصل كل منها في كاسيت خاص بها.
  5. تجفيف وتحضير الأنسجة لتضمين البارافين عن طريق وضع كاسيت (كاسيت) مع الأسماك في معالج الأنسجة حيث يتم غمر العينة (العينات) في محاليل مختلفة ، على التوالي ، على النحو التالي: 70٪ إيثانول (60 دقيقة ، 40 درجة مئوية) ، 85٪ إيثانول (50 دقيقة ، 40 درجة مئوية) ، 95٪ إيثانول (40 دقيقة ، 40 درجة مئوية) مرتين ، 100٪ إيثانول (30 دقيقة ، 40 درجة مئوية) ، محلول طازج آخر من الإيثانول 100٪ (50 دقيقة ، 40 درجة مئوية) مرتين ، الزيلين (30 دقيقة ، 40 درجة مئوية) ، محلول جديد آخر من الزيلين (50 دقيقة ، 40 درجة مئوية) ، زيلين طازج آخر (50 دقيقة ، 45 درجة مئوية) ، بارافين (30 دقيقة ، 45 درجة مئوية) ، بارافين (20 دقيقة ، 58 درجة مئوية) ثلاث مرات.
  6. بعد معالجة الأنسجة ، قم بتفريغ الكاسيت (الأنسجة) من جهاز المعالج مع الحفاظ على تنظيم كل كاسيت والتأكد من منع خلط عينات الأسماك.
  7. اختر القالب المناسب الحجم بناء على حجم السمكة ، مع التأكد من أن القالب سيناسب الكاسيت بأكمله مع عينة السمك. قم بتغطية الجزء السفلي من القالب بالبارافين السائل عند 60 درجة مئوية.
  8. ضع الكاسيت على الفور مع السمك فوق القالب (تأكد من وضع السمك على جانبه الجانبي المسطح للأقسام السهمية) مع البارافين السائل ، والانتهاء من الملء بالبارافين إلى أعلى القالب لتضمين الأسماك بالكامل.
  9. ضع القالب المكتمل على الصفيحة الباردة من ميكروتوم التقسيم حتى تصلب البارافين.
  10. بمجرد أن تصبح كتلة البارافين صلبة ، والتي يمكن الحكم عليها من خلال مراقبة التعتيم العالي بصريا ولمسة قوية على الكتلة ، قم بإزالة الكتلة بلطف من القالب. كشط بعناية أي البارافين الزائد من جوانب الكاسيت.
  11. قسم كتلة الأسماك المدمجة في البارافين بشكل مهكي عند 4 ميكرون على الميكروتوم وتطفو الأقسام على حمام مائي دافئ عند 40 درجة مئوية تحتوي على ماء مقطر.
  12. انقل الأجزاء بعناية إلى شرائح مشحونة إيجابيا واخبزها في الفرن على درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل التلطيخ قبل المتابعة إلى الخطوة 6 أو 7 أو 8.

6. الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) تلطيخ أقسام البارافين لمراجعة علم الأمراض

  1. ضع الشرائح التي تحتوي على مقاطع البارافين من الخطوة 5.12 في حامل الشرائح. داخل غطاء الدخان الكيميائي ، قم بإزالة البارافينات مع الزيلين 3 مرات ، 5 دقائق لكل منهما. تخلص من المحلول بعد كل استخدام.
  2. أعد ترطيب الأقسام بالإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 3 دقائق ، وكرر مرتين مع الإيثانول الطازج بنسبة 100٪. استبدل الإيثانول بنسبة 100٪ بالإيثانول بنسبة 95٪ لمدة 3 دقائق ثم 80٪ الإيثانول لمدة 3 دقائق.
  3. شطف المقاطع بالماء المقطر لمدة 5 دقائق. أثناء غسل الأقسام في الماء ، تأكد من إزالة الجسيمات المؤكسدة من الهيماتوكسيلين إما عن طريق تصفية أو قشط سطح الهيماتوكسيلين بمسح خال من الوبر.
  4. امسح الماء الزائد من حامل الشريحة باستخدام مناديل احترافية خالية من الوبر ، وقم بانزلاق البقع بنسبة 50٪ من الهيماتوكسيلين (تخفيف 1: 1 بالماء المقطر) لمدة 2-5 دقائق اعتمادا على تفضيل التلطيخ المطلوب وتدهور الكاشف. تخلص من الهيماتوكسيلين عندما يتغير لون المحلول من البرقوق إلى الأزرق / البني أو عندما يصبح وقت التلطيخ مفرطا. اشطف الشرائح بماء الصنبور الجاري لمدة 20 دقيقة.
  5. قم بإلغاء تلوين الأقسام في الإيثانول الحمضي بنسبة 1٪ (3.3 مل من حمض الهيدروكلوريك مع 50 مل من الإيثانول بنسبة 70٪) عن طريق غمس الشرائح بسرعة عدة مرات. يمكن غمس الشرائح حتى 3 ثوان ، ولكن كلما طالت مدة غمس الشرائح ، أصبحت الأقسام أخف وزنا.
  6. شطف الشرائح في ماء الصنبور مرتين لمدة 1 دقيقة لكل منهما، ومرة واحدة مع الماء منزوع الأيونات. كخيار ، يمكن ترك الشرائح بين عشية وضحاها في هذه المرحلة ، والنقع في الماء.
  7. اغمر الأقسام في محلول كربونات الليثيوم بنسبة 1.36٪ (47 جم من كربونات الليثيوم ، 3500 مل من الماء) لمدة 3 ثوان. تأكد من عدم الإفراط في احتضان الأقسام لأنه كلما طالت المدة في محلول كربونات الليثيوم ، زاد احتمال طفو الأنسجة.
  8. اشطف الأقسام في ماء الصنبور لمدة 5 دقائق، وامسح الماء الزائد من حامل الشريحة باستخدام مناديل احترافية خالية من الوبر.
  9. قم بتلطيخ الشرائح في 100٪ من الإيوسين الجاهز للاستخدام لمدة 15-30 ثانية ، وجفف على الفور بنسبة 95٪ من الإيثانول مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما. استبدل بالإيثانول بنسبة 100٪ مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما ، مع التخلص من المحاليل بعد كل استخدام.
  10. امسح الأقسام في الزيلين لمدة 15 دقيقة وكرر مرتين لمدة 3 مرات في المجموع. اختياريا ، يمكن ترك الشرائح في الزيلين بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة لإزالة المياه الزائدة بشكل أفضل.
  11. اترك الشرائح لتجف في الهواء في غطاء الدخان الكيميائي ثم قم بتركيب زلة غطاء باستخدام وسيط التركيب لإغلاق عينة الأنسجة.
  12. تصور وتصوير أقسام الأنسجة الملطخة تحت الفحص المجهري. افحص بعناية الأورام في الموقع الأساسي (منطقة الغدة بين الكلى في كلية الرأس) والنقائل المتفرقة البعيدة في الأنسجة والأعضاء الأخرى للأسماك. أرسل شرائح ملطخة لأقسام الأنسجة لمراجعتها من قبل علماء الأمراض. استنادا إلى السمات المرضية المماثلة لنموذج الأسماك للورم الأرومي العصبي البشري ، توقع الأورام التي نشأت في MYCN فقط أو MYCN. سيتم تشخيص أسماك LMO1 لأول مرة على أنها ورم أرومي عصبي من قبل علماء الأمراض.

7. التحليل الكيميائي النسيجي المناعي (IHC) مع الأجسام المضادة ضد علامة NB والجينات المحورة المبالغ فيها لزيادة تأكيد انتشار الورم وخاصية السلالة الودية الكظرية

  1. تلطيخ مع نظام تلطيخ أوتوماتيكي بالكامل
    1. لمقارنة نتيجة المدينة العالمية للخدمات الإنسانية بشكل أفضل مع نتيجة تلطيخ H&E، حدد الشرائح المجاورة من الخطوة 5.12 لتلطيخ المدينة العالمية للخدمات الإنسانية.
      ملاحظة: على الرغم من أن نظام التلطيخ الآلي يسمح بتحقيق نتائج أسرع وأقل صعوبة، إلا أنه يمكن استخدام بروتوكول يدوي لتلطيخ المدينة العالمية للخدمات الإنسانية في حالة عدم وجود مثل هذا من خلال الإشارة إلى خطوات القسم الفرعي 7.2.
    2. قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي ضد هيدروكسيلاز التيروزين (TH) (1:500) ، وهو علامة الورم الأرومي العصبي ، بناء على التركيز المطلوب والكمية الإجمالية اللازمة مع مخفف الأجسام المضادة الأولية المقابل للنظام الآلي.
      ملاحظة: قد تختلف تركيزات الأجسام المضادة المثلى اعتمادا على الأجسام المضادة والأنسجة.
    3. نظرا لأن النظام الآلي يستخدم استرجاع المستضد الناجم عن الحرارة على متن الطائرة مع حل استرجاع epitope لمدة 20 دقيقة وكاشف الكشف المقابل للنظام ، تأكد من تعيين معلمات الجهاز على النحو التالي: Peroxidase Blocking ، 5 دقائق ؛ الجسم المضاد الأولي مع التركيز المطلوب ، 15 دقيقة ؛ الأجسام المضادة الثانوية IgG المضادة للأرانب البيوتينيل (1:500) ، 8 دقائق ؛ ستريبتافيدين HRP ، 8 دقائق ؛ الركيزة المختلطة DAB مكثفة ، 5 دقائق ؛ والهيماتوكسيلين ، 5 دقائق.
    4. بمجرد ضبط الإعدادات ، ضع درج الأجسام المضادة في الجهاز. قم بإعداد الشرائح عن طريق إنشاء حالة جديدة، والتي ستقوم بتسمية الشرائح. يتم الآن تحميل الجهاز وجاهز للتشغيل (إزالة الشمع والتلطيخ والتلطيخ المضاد).
    5. بمجرد إزالة الشرائح من الشمع وتلوينها ومعالجتها باستخدام الجهاز الآلي ، قم بتجفيف الشرائح في تدرجات الإيثانول بنسبة 70٪ و 95٪ و 100٪ لمدة 5 دقائق لكل منها. غمر شرائح الأقسام في الإيثانول الطازج 100٪ مرة أخرى لمدة 5 دقائق.
    6. امسح الأقسام في الزيلين لمدة 5 دقائق ، مرتين ، أو اترك الشرائح في الزيلين بين عشية وضحاها لإزالة الماء الزائد بشكل أفضل.
    7. اترك الشرائح لتجف في الهواء في غطاء الدخان الكيميائي ثم قم بتركيب انزلاق غطاء باستخدام وسيط تركيب. تصور وتصوير أقسام الأنسجة الملطخة باستخدام الفحص المجهري.
    8. لتأكيد الانبثاث بقوة في نموذج الأسماك ، قارن الشرائح الملطخة بالأجسام المضادة ضد علامة الورم الأرومي العصبي من الخطوة 7 بتلك الملطخة ب H & E من الخطوة 6.
      ملاحظة: توقع أن ترى تلطيخا إيجابيا لعلامة الورم الأرومي العصبي ، TH ، في جميع الخلايا السرطانية التي تم تحديدها بواسطة تلطيخ H & E. نتوقع أيضا عدم وجود تلطيخ إيجابي ل TH في الأنسجة المجاورة حيث تم تحديد الأورام النقيلية في LMO1 ؛ أسماك MYCN. تأكد من اختيار التحكم في الأسماك WT و MYCN فقط التي لها عمر مماثل ل MYCN ؛ أسماك LMO1 لهذا التحليل لاستبعاد احتمال أن الأورام النقيلية هي أورام أولية متعددة البؤر.
  2. تلطيخ يدويا بدون نظام تلطيخ IHC الآلي
    1. بعد خبز الشرائح، حدد الشرائح المجاورة من الخطوة 5.12 للسماح بمقارنة أفضل بين تلطيخ H&E وIHC لإزالة الصبغة. داخل غطاء الدخان الكيميائي ، قم بإزالة الشمع وإعادة ترطيب الشرائح باستخدام الزيلين باستخدام الخطوتين السابقتين 6.1 و 6.2 ، على التوالي.
    2. بعد إزالة البارافينة وإعادة الإماهة ، انقع الشرائح في محلول مانع البيروكسيد الداخلي (1x PBS يحتوي على 0.1٪ من أزيد الصوديوم و 0.3٪ بيروكسيد الهيدروجين) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح في 1x PBS طازجة لمدة 3 دقائق وكرر مرتين لما مجموعه 3 مرات.
      تحذير: أزيد الصوديوم سام بشكل حاد. تأكد من ممارسة الإجراءات الاحترازية والتخلص السليم من الكاشف اعتمادا على لوائح مؤسستك.
    3. استرجع المستضد عن طريق احتضان الشرائح في محلول باستخدام بروتين K (1:500 في 1x PBS) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح 3 مرات باستخدام 1x PBS لمدة 3 دقائق لكل منها.
    4. كتلة الشرائح عن طريق احتضان مع مصل الماعز 5٪ في 1x PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الروكر. اغسل الشرائح مع 1x PBS الطازجة مرتين لمدة 3 دقائق لكل منهما.
    5. أضف 4 قطرات من محلول حجب Avidin مباشرة على الشريحة واحتضنها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل الشرائح مع 1x PBS الطازجة مرتين لمدة 3 دقائق لكل منها ، أضف 4 قطرات من محلول حجب البيوتين واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    6. بعد منع الشرائح ، احتضن في الجسم المضاد الأولي لهيدروكسيلاز التيروزين (TH) (1:500) لمدة 45-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: وصمة عار مع الأجسام المضادة الإضافية ضد الجينات المحورة وغيرها من العلامات ذات الصلة لمعالجة علم وظائف الأعضاء ونشاط الورم الأولي والمواقع النقيلية الأخرى. قد تختلف تركيزات الأجسام المضادة المثلى اعتمادا على الأجسام المضادة والأنسجة.
    7. اغسل الشرائح باستخدام 1x PBS الطازج لمدة 3 دقائق ، مع تكرارها مرتين بإجمالي 3 مرات.
    8. احتضان الشرائح في الجسم المضاد الثانوي للأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب IgG البيوتينيل (1:500) المخففة في محلول الحجب لمدة 45-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر خطوة الغسيل السابقة 7.2.7.
    9. أضف Avidin المقترن ب HRP (1:300 في 1x PBS) ، واحتضنه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح 3 مرات مع 1x PBS طازجة لمدة 5 دقائق لكل منها.
    10. قم بإعداد محلول 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) (2.5 مل من الماء المقطر ، وقطرة واحدة من المخزن المؤقت للعدة ، وقطرة واحدة من بيروكسيد الهيدروجين ، وقطرتين من DAB من المجموعة) ، ووضع قطرات من DAB مباشرة على الشرائح بالقرب من المجهر. بعد إضافة DAB ، لاحظ تفاعل تغيير اللون على الشرائح تحت المجهر. بمجرد الوصول إلى شدة التلطيخ المطلوبة ، أوقف التفاعل عن طريق وضع أقسام الشرائح في الماء المقطر البارد.
    11. قم بتلطيخ الشرائح بنسبة 50٪ من الهيماتوكسيلين الطازج عن طريق غمر العينات أو غمسها لبضع ثوان قصيرة ووضعها مرة أخرى في الماء المقطر. كرر حسب الرغبة ، ولكن عادة ، يجب أن تكون مرة واحدة كافية لأن أقسام الأنسجة رقيقة.
    12. قم بتجفيف عينات الأنسجة على شرائح في تدرج الكحول كما هو موضح سابقا في الخطوة 7.1.5 واستمر خلال الخطوات المتبقية (مع الخطوة الأخيرة 7.1.8) لإنهاء تحليل المدينة العالمية للخدمات الإنسانية.

8. Picrosirius تلطيخ أحمر من شرائح البارافين لتراكم الكولاجين في الأورام كآلية دراسة

  1. كرر الخطوات من 6.1 إلى 6.3 لإزالة الشمع من أقسام البارافين وترطيبها وغسلها على الشرائح.
  2. بعد نفخ الماء الزائد من حامل الشريحة باستخدام مناديل احترافية خالية من الوبر ، قم بتلطيخ الهيماتوكسيلين بنسبة 50٪ لمدة 10 دقائق. اشطف الشرائح بماء الصنبور الجاري لمدة 10 دقائق.
  3. انقل الشرائح إلى Picrosirius Red واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  4. اغسل الشرائح في الماء المحمض (5 مل من حمض الخليك الجليدي في 1 لتر من الصنبور أو الماء المقطر) مرتين ، مع احتضان لمدة 5 دقائق على الخلاط.
  5. قم بتفريغ معظم الماء من الشرائح أولا قبل الاهتزاز الجسدي وتقسيم المقاطع على الشرائح لإزالة أكبر قدر ممكن من الماء.
  6. ضع الشرائح بسرعة في ثلاثة تغييرات من الإيثانول بنسبة 100٪ لتجفيف أقسام البارافين.
  7. كرر الخطوتين 6.10 و6.11 لمسح الشرائح في الزيلين ونموذج التحميل. بعد ذلك ، صورة بمجهر مركب مجهز بكاميرا.
  8. باستخدام ImageJ ، عد ألياف الكولاجين الموجبة الحمراء picrosirius في ثلاثة حقول عشوائية على الأقل لكل قسم. قارن بين شرائح MYCN و MYCN ؛ أقسام الأسماك LMO1.

النتائج

لتحديد ما إذا كان LMO1 يتآزر مع MYCN للتأثير على التسبب في NB ، تم حقن التركيبات المعدلة وراثيا التي تدفع التعبير عن LMO1 (dβh: LMO1 و dβh: mCherry) أو MYCN (dβh: EGFP-MYCN) في خلايا PSNS الخاضعة لسيطرة مروج dβh في أجنة أسماك الزرد 13. وكما هو مبين في الشكل 1...

Discussion

يشيع استخدام سمك الزرد في الأبحاث على مدى العقود القليلة الماضية ، وخاصة في أبحاث السرطان ، لأسباب واضحة ، مثل سهولة صيانته ، وتكاثره القوي ، ومزاياه الواضحة للتصوير في الجسم الحي 1،28. يمكن التلاعب بسهولة بنموذج الزرد جنينا بسبب إخصابه الخارجي وتطوره ،...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية منافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منحة R01 CA240323 (S.Z.) من المعهد الوطني للسرطان. منحة W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) من وزارة الدفاع الأمريكية (DoD) ؛ جائزة V Scholar من مؤسسة V لأبحاث السرطان (S.Z.) ومنحة منصة من مركز Mayo للاكتشاف الطبي الحيوي (S.Z.) ؛ وبدعم من مركز Mayo Clinic للسرطان ومركز الطب الفردي (S.Z).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector KitVectorSK-4100
Acetic AcidFisher Scientific / Acros Organic64-19-7
Agarose GP2Midwest Scientific009012-36-6
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) AntibodyPel-FreezP40101
Avidin/Biotin Blocking KitVectorSP-2001
BOND Intense R DetectionLeica BiosystemsDS9263
BOND primary antibody diluentLeica Biosystems Newcastle, Ltd.AR9352
BOND-MAX IHC instrumentLeica Biosystems Newcastle, Ltd.N/Afully automated IHC staining system
CH211-270H11 BAC cloneBACPAC resources center (BRFC)N/A
Compound microscope equipped with DP71 cameraOlympusAX70
Cytoseal XYL (xylene based mounting medium)Richard-Allan Scientific8312-4
EosinLeica3801601ready-to-use (no preparation needed)
EthanolCarolina86-1263
Expand Long Template PCR SystemRoche Applied Science, IN11681834001
Gateway BP Clonase II enzyme mixInvitrogen, CA11789-020
Gateway LR Clonase II enzyme mixInvitrogen, CA11791-100
Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated)DakoE0432
Hematoxylin Solution, Harris ModifiedSigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFCHHS-32-1L
HRP Avidin DVectorA-2004
Hydrochloric AcidAqua Solutions4360-1L
Hydrogen Peroxide, 3%Fisher ScientificH324-500
I-SceI enzymeNew England Biolabs, MAR0694L
Kanamycin sulfateTeknova, Inc.K2150
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science KimwipesFisher Scientific34133
Lithium CarbonateSigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC554-13-2
Microtome for sectioningLeica BiosystemsRM2255
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coliInvitrogenC404006
p3E-polyA Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of UtahN/Aa generous gift
(Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)
Parafin waxSurgipath Paraplast39603002Parrafin to parafin
ParaformaldehydeAlfa AesarA11313
pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites)Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, GermanyN/Aa generous gift
pDONR 221 gateway donor vectorThermo Fisher Scientific12536-017
pDONRP4-P1R donor vector Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of UtahN/Aa generous gift
Phenol red, 0.5%Sigma Aldrich P0290
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10XBioRad1610780
Picrosirrius red stain kitPolysciences24901-250
pME-mCherryAddgene26028
Proteinase K, recombinant, PCR GradeRoche21712520
QIAprep Spin MiniPrep KitQiagen27104
RDO Rapid DecalcifierApex EnginerringRDO04
Sodium Azide (NaN3)Sigma Aldrich26628-22-8
Stereo fluorescence microscopeLeicaMZ10F
Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imagingNikonSMZ-1500
Taq DNA PolymeraseNew England Biolabs, MAM0273L
Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration ProcessorSakuraN/AModel #: VIP-6-A1
Tricaine-SWestern Chemical Incorporated20513
XyleneThermo Fisher ScientificX3P1GAL

References

  1. Veldman, M., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).
  2. Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Research. 6 (5), 694 (2008).
  3. Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).
  4. Benjamin, D. C., Hynes, R. O. Intravital imaging of metastasis in adult Zebrafish. BMC Cancer. 17 (1), 660 (2017).
  5. Kim, I. S., et al. Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma. Nature Communications. 8, 14343 (2017).
  6. Zhu, S., et al. Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
  7. Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. Neuroblastoma. Lancet. 369 (9579), 2106-2120 (2007).
  8. Park, J. R., et al. Children's oncology group's 2013 blueprint for research: neuroblastoma. Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).
  9. Hoehner, J. C., et al. A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors' progress along an extra-adrenal chromaffin lineage. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).
  10. Tsubota, S., Kadomatsu, K. Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma. Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).
  11. Tolbert, V. P., Matthay, K. K. Neuroblastoma: Clinical and biological approach to risk stratification and treatment. Cell and Tissue Research. 372 (2), 195-209 (2018).
  12. Maris, J. M. Recent advances in neuroblastoma. New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).
  13. Zhu, S., et al. LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis. Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).
  14. Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).
  15. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  16. Tao, T., et al. LIN28B regulates transcription and potentiates MYCN-induced neuroblastoma through binding to ZNF143 at target gene promotors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (28), 16516-16526 (2020).
  17. Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (97), e52567 (2015).
  18. Zhang, X., et al. Critical role for GAB2 in neuroblastoma pathogenesis through the promotion of SHP2/MYCN cooperation. Cell Reports. 18 (12), 2932-2942 (2017).
  19. Zimmerman, M. W., et al. MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification. Cancer Discovery. 8 (3), 320-335 (2018).
  20. Koach, J., et al. Drugging MYCN oncogenic signaling through the MYCN-PA2G4 binding interface. Cancer Research. 79 (21), 5652-5667 (2019).
  21. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  22. DuBois, S. G., et al. Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival. Journal of pediatric hematology/oncology. 21 (3), 181-189 (1999).
  23. Wattrus, S. J., Zon, L. I. Stem cell safe harbor: The hematopoietic stem cell niche in zebrafish. Blood Advances. 2 (21), 3063-3069 (2018).
  24. Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicologic Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
  25. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: Zebrafish and vertebrate immunity. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
  26. Junqueira, L. C., Cossermelli, W., Brentani, R. Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy. Archivum histologicum Japonicum (Nihon Soshikigaku Kiroku). 41 (3), 267-274 (1978).
  27. Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. I. Sirius red F3BA as a stain for connective tissue. Archives of Pathology. 78, 69-72 (1964).
  28. Ignatius, M. S., Hayes, M., Langenau, D. M. In vivo imaging of cancer in zebrafish. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 219-237 (2016).
  29. Howe, C. K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  30. Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).
  31. Yoganantharjah, P., Gibert, Y. The Use of the zebrafish model to aid in drug discovery and target validation. Current Topics in Medicinal Chemistry. 17 (18), 2041-2055 (2018).
  32. Ignatius, M. S., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 21 (5), 680-693 (2012).
  33. Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (44), 17406-17411 (2007).
  34. Ahmed, S., et al. Neuroblastoma with orbital metastasis: ophthalmic presentation and role of ophthalmologists. Eye. 20 (4), 466-470 (2006).
  35. Papaioannou, G., McHugh, K. Neuroblastoma in childhood: review and radiological findings. Cancer Imaging Society. 5 (1), 116-127 (2005).
  36. Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
  37. Amores, A., et al. Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution. Science. 282 (5394), 1711-1714 (1998).
  38. Postlethwait, J. H., et al. Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map. Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).
  39. Opazo, J. C., et al. Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins. Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

169

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved