JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе представлен метод разработки, характеристики и отслеживания в режиме реального времени метастазирования опухоли в модели нейробластомы рыбок данио, в частности в трансгенной линии рыбок данио с гиперэкспрессией MYCN и LMO1, которая развивает метастазирование спонтанно.

Аннотация

Рыбки данио стали важной животной моделью для изучения заболеваний человека, особенно рака. Наряду с надежными трансгенными технологиями и технологиями редактирования генома, применяемыми в моделировании рыбок данио, простота обслуживания, высокая продуктивность и мощная живая визуализация в целом делают рыбок данио ценной модельной системой для изучения метастазов и клеточных и молекулярных основ, лежащих в основе этого процесса in vivo. Первая модель метастазирования нейробластомы рыбок данио (NB) была разработана путем сверхэкспрессии двух онкогенов, MYCN и LMO1, под контролем промотора дофамина-бета-гидроксилазы (dβh). Ко-сверхэкспрессированные MYCN и LMO1 приводили к снижению латентности и усилению пенетрантности нейробластомагенеза, а также ускорению отдаленного метастазирования опухолевых клеток. Эта новая модель достоверно повторяет многие ключевые особенности метастатического НБ человека, включая участие клинически значимых и связанных с метастазами генетических изменений; естественное и спонтанное развитие метастазов in vivo; и сохраненные участки метастазов. Поэтому модель рыбок данио обладает уникальными преимуществами для рассечения сложного процесса метастазирования опухоли in vivo.

Введение

Рыбки данио широко используются и применяются в нескольких областях исследований, особенно при раке. Эта модель предоставляет множество преимуществ, таких как ее надежное размножение, экономически эффективное поддержание и универсальная визуализация роста опухоли и метастазирования - все это делает рыбок данио мощным инструментом для изучения и исследования клеточных и молекулярных основ опухолевого генеза и метастазирования. Новые методы крупномасштабного картирования генома, трансгенеза, сверхэкспрессии или нокаута генов, трансплантации клеток и химических экранов значительно увеличили мощность модели рыбок данио1. За последние несколько лет было разработано много линий рыбок данио для изучения опухолевого генеза и метастазирования различных видов рака человека, включая, но не ограничиваясь, лейкемией, меланомой, рабдомиосаркомой и гепатоцеллюлярной карциномой2,3,4,5. Кроме того, первая модель нейробластомы рыбок данио (NB) была получена путем сверхэкспрессии MYCN, онкогена, в периферической симпатической нервной системе (PSNS) под контролем промотора дофамина-бета-гидроксилазы (dβh). С помощью этой модели было дополнительно продемонстрировано, что активированный ALK может синергировать с MYCN для ускорения начала опухоли и увеличения пенетрантности опухоли in vivo6.

NB получен из симпатоадреналовой линии клеток нервного гребня и является высокометастатическим раком у детей7. Он ответственен за 10% детских смертей, связанных с раком8. Широко метастазируемый при постановке диагноза, NB может быть клинически представлен как опухоли, в основном происходящие по цепочке симпатических ганглиев и мозгового вещества надпочечников PSNS9,10. Амплификация MYCN обычно связана с плохими исходами у пациентов с NB11,12. Кроме того, LMO1 был идентифицирован как критический ген чувствительности к NB в случаях высокого риска13,14. Исследования показали, что трансгенная коэкспрессия MYCN и LMO1 в PSNS модели рыбок данио не только способствует более раннему началу NB, но и индуцирует широко распространенные метастазы в ткани и органы, которые похожи на участки, обычно наблюдаемые у пациентов с высоким риском NB13. Совсем недавно другой метастатический фенотип NB также наблюдался в более новой модели NB рыбок данио, в которой как MYCN, так и Lin28B, кодирующие РНК-связывающий белок, чрезмерно экспрессируются под контролем промотора dβh16.

Стабильный трансгенный подход у рыбок данио часто используется для изучения того, может ли чрезмерная экспрессия интересующего гена способствовать нормальному развитию и патогенезу заболевания14,15. Этот метод был успешно использован для демонстрации важности нескольких генов и путей к опухолевому NB 6,16,17,18,19,20. В этой статье будет представлено, как была создана трансгенная рыбья линия, которая чрезмерно экспрессирует как MYCN, так и LMO1 в PSNS, и как было продемонстрировано, что сотрудничество этих двух онкогенов ускоряет начало опухолевого NB и метастазирования13. Во-первых, трансгенная линия, которая сверхэкспрессирует EGFP-MYCN под контролем промотора dβh (обозначенная линией MYCN), была разработана путем инъекции конструкции dβh-EGFP-MYCN в одноклеточную стадию эмбрионов AB дикого типа (WT), как описано ранее6,17. Отдельная трансгенная линия, которая сверхэкспрессирует LMO1 в PSNS (обозначенная линией LMO1), была разработана путем коинъекции двух конструкций ДНК, dβh-LMO1 и dβh-mCherry, в эмбрионы WT на стадии одной клетки13. Ранее было продемонстрировано, что коинъекционные двойные конструкции ДНК могут быть коинтегрированы в геном рыбы; поэтому LMO1 и mCherry совместно экспрессируются в клетках PSNS трансгенных животных. Как только введенные эмбрионы F0 достигали половой зрелости, их затем скрещивали с рыбой WT для идентификации положительных рыб с интеграцией трансгенов. Короче говоря, потомство F1 было впервые проверено флуоресцентной микроскопией на экспрессию mCherry в клетках PSNS. Интеграция зародышевой линии LMO1 у mCherry-положительных рыб была дополнительно подтверждена геномной ПЦР и секвенированием. После успешной идентификации каждой трансгенной линии потомство гетерозиготных трансгенных рыб MYCN и LMO1 скрещивалось для получения составной рыбной линии, экспрессирующей как MYCN, так и LMO1 (обозначенный MYCN; Линия LMO1). Опухоленосный MYCN; Рыбу LMO1 контролировали с помощью флуоресцентной микроскопии раз в две недели на предмет наличия метастатических опухолей в областях, удаленных от первичного участка, области межпочечной железы (IRG, эквивалент надпочечников человека)13. Для подтверждения метастазирования опухолей в MYCN; Применены рыбный LMO1, гистологический и иммуногистохимический анализы.

протокол

Все методы исследования с использованием рыбок данио и ухода за животными были выполнены в соответствии с институциональными руководящими принципами клиники Майо.

1. Подготовка и микроинъекция трансгенных конструкций для разработки трансгенной линии рыбок данио LMO1 с гиперэкспрессией в PSNS

  1. Для разработки входного клона LMO1-pDONR221 амплифицируйте кодирующую область человеческого LMO1 из кДНК, полученной из клеточной линии человека с помощью ПЦР.
    1. Сделайте реакцию 25 мкл, как подробно описано здесь: 2,5 мкл 10x стандартного реакционного буфера Taq , 0,125 мкл ДНК-полимеразы Taq , 0,5 мкл 10 мМ дНТФ, 2 мкл шаблона кДНК, 0,5 мкл 10 мкМ прямого праймера LMO1 ATTB1, 0,5 мкл обратного праймера LMO1 ATTB2 и 18,875 мкл воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте прямую грунтовку LMO1 ATTB1: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACAC-3'.
      CATGATGGTGCTGGACAAGGAGGA-3' и обратная LMO1 ATTB2 грунтовка: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACTACT
      ГААКТТГГАТТХАААГГТ-3'
    2. Усиление с помощью следующей программы: 1 цикл 94 °C, 2 мин; затем 30 циклов (94 °C, 30 с, 55 °C, 30 с, 72 °C, 1 мин) и 72 °C, 7 мин.
  2. Клонирование продукта ПЦР LMO1 в донорский вектор шлюза pDONR221 с помощью реакции рекомбиназы АД6,13 (фрагмент ПЦР + донорский вектор = входной клон).
    1. Для реакции 10 мкл смешайте 1 мкл очищенного продукта ПЦР LMO1 (150 нг/мкл), 1 мкл (150 нг/мкл) донорского вектора pDONR221 и 6 мкл буфера TE (рН 8,0) с 2 мкл ферментной смеси ВР, инкубировать в течение 1 ч при 25 °C и преобразовать в ТОП10 компетентных E. coli с использованием протокола производителя.
    2. Затем выкладываем 50-200 мкл из флакона для трансформации на агаровую пластину Лурия Бульона (LB), содержащую 50 мкг/мл канамицина, и инкубируем при 37 °C в течение ночи.
    3. Отбор клонов путем инокуляции одной колонии в 2-5 мл LB с 50 мкг/мл канамицина и культивирования в течение ночи (16-18 ч) при 37 °C.
    4. Используйте 2 мл ночной бактериальной культуры для выделения плазмиды в соответствии с протоколом производителя. Чтобы проверить плазмиду LMO1, отправьте образец плазмиды для секвенирования с помощью праймера M13-F (5-GTAAAACGACGGCCAG-3').
  3. Чтобы получить входной клон dβh-pDONRP4-P1R, получите продукт ПЦР dβh6,13 путем амплификации промоторной области 5,2 КБ с использованием клона CH211-270H11 BAC в качестве шаблона для получения реакции 20 мкл, как описано ранее на этапе 1.1.1. Используйте следующие параметры программы ПЦР: 94 °C, 2 мин; 10 циклов 94 °C, 15 с, 50 °C, 30 с, 68 °C, 8 мин; 30 циклов 94 °C, 15 с, 53 °C, 30 с, 68 °C, 8 мин; 68 °C, 4 мин (с прямой грунтовкой 5'GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTC
    CCCCTTTTTAGG-3' и обратная грунтовка 5'-GGGGACTGCTTTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTG
    TCGTCTTTTGA-3').
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за длинных шаблонов ДНК на этом этапе обеспечьте использование соответствующей системы ПЦР для точной амплификации ПЦР.
  4. Клонирование продукта ПЦР dβh в донорский вектор шлюза pDONRP4-P1R с помощью реакции рекомбиназы BP6,13 (фрагмент ПЦР + вектор донора = входной клон).
    1. Смешайте 1 мкл очищенного продукта ПЦР dβh (172 нг/ул), 1 мкл (150 нг/мкл) донорского вектора pDONRP4-P1R и 6 мкл буфера TE (рН 8,0) с 2 мкл ферментной смеси BP в общей сложности 10 мкл реакции, инкубировать в течение 1 ч при 25 °C.
    2. Преобразование в ТОП10 компетентных E. coli по протоколу производителя. Выделяют плазмиду, как описано на этапах 1.2.2-1.2.4, и проверяют плазмиду путем секвенирования с помощью праймеров M13-F (5'-GTAAAACGACGGCCAG-3') и M13-R (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3').
  5. Создайте конструкцию выражения dβh:LMO1 .
    1. Объедините 1 мкл каждого входного клона (dβh-pDONRP4-P1R, LMO1-pDONR221 и p3E-polyA11) (по 20 фмоле), 1 мкл (60 нг/мкл) модифицированного вектора назначения с сайтами распознавания I-SceI и 4 мкл буфера TE (рН 8,0), содержащего 2 мкл смеси ферментов LR-рекомбиназы. Инкубировать эту смесь в течение 1 ч при 25 °C.
    2. Следуя протоколу производителя, преобразуйте бактерии в химически компетентную кишечную палочку TOP10. Изолируйте плазмиду, как описано на этапах 1.2.2-1.2.4, и проверьте плазмиду путем секвенирования с помощью праймеров DBH Forward (5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTG-3') и LMO1 (5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA-3').
  6. Сгенерируйте конструкцию ДНК dβh:mCherry с помощью шлюзовой системы, объединив входные клоны промотора dβh объемом 5,2 кб, pME-mCherry и p3E-polyA в модифицированный вектор назначения, содержащий сайты распознавания I-SceI, как упоминалось ранее на шаге 1.5.16. Изолируйте плазмиду, как описано на этапах 1.2.2-1.2.4, и проверьте плазмиду путем секвенирования с помощью прямого праймера DBH (5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTG-3').
  7. Линеаризуйте конструкцию ДНК dβh:LMO1 и днк-конструкцию dβh:mCherry (в соотношении 3:1 соответственно) в общей сложности 15 мкл реакционного объема с 1 мкл фермента I-SceI (5 ЕД/мкл) и 0,75 мкл буфера (10x) и инкубируйте при комнатной температуре в течение как минимум 4 ч или на ночь. Убедитесь, что концентрация ДНК не превышает 750 нг в реакции.
  8. На следующий день и после линеаризации конструкций добавляют 0,5 мкл свежего фермента I-SceI (5 ЕД/мкл) и 0,5 мкл 0,5% фенол-красного в 5 мкл общей смеси ДНК с предыдущей стадии 1,7. Микроинъецировать общий раствор (50-80 пг линеаризированной ДНК) в одноклеточные эмбрионы AB дикого типа (и до 500 эмбрионов) с использованием стеклянной микропипетки диаметром 1,0 мм, как описано ранее17. Храните оставшуюся смесь ДНК при -20 °C для будущих инъекций.

2. Скрининг и проверка трансгенной рыбьей линии LMO1 на зародышевую линию передачи LMO1 и mCherry

  1. Через 3-4 дня после оплодотворения (dpf) обезболивают введенные эмбрионы 0,02% трикаина и проверяют их на флуоресцентную экспрессию вишни, которая присутствует в любом месте по всему телу рыбы из-за мозаичного трансгенеза. Перенесите эмбрионы вишню в чашку Петри со свежей яичной водой и поднимите эмбрионы до половой зрелости в соответствии с книгой рыбок данио21.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидайте, что соотношение положительных рыб будет варьироваться в зависимости от знаний и опыта исследовательского персонала. Например, начинающие любители могут иметь низкий коэффициент интеграции 10%, по сравнению с экспертом ≥50%.
  2. Чтобы определить рыбу-основателя с трансгенами dβh:LMO1 и dβh:mCherry , интегрированными в половые клетки, перекрестите одиночные пары введенных mCherry-положительных F0 половозрелых рыб с предыдущей стадии (2.1) с рыбой WT AB. Скрининг поколения F1 на наличие эмбрионов mCherry-положительных при 3-4 dpf.
  3. Чтобы подтвердить, что мвихер-положительные рыбы несут трансген LMO1 , выделяют гДНК из F1 mCherry-положительного одиночного эмбриона с помощью буфера экстракции гДНК, который содержит: 12,5 мкл 4x лизисного буфера (500 мкл 1 M Tris с рН 8,4, 2,5 мл 1 М хлорида калия и 47 мл очищенной воды), 35 мкл очищенной воды, и 2,5 мкл протеиназы К при 10 мг/мл. Инкубируйте образец в течение 16 ч при 55 °C, затем 10 мин при 98 °C.
  4. Используйте экстрагированную гДНК (2 мкл) в качестве шаблона для генотипирования ПЦР с праймерами: LMO1 FW: 5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA -3' и LMO1 RV: 5'-CGAAGGCTGGGATCAGCTTG -3', и следующей программой ПЦР: 1 цикл 94 °C, 10 мин; 35 циклов (94 °C для 30 с, 60 °C для 30 с; 68 °C, 30 с); и 68 °C в течение 7 мин. Подтвердите усиление фрагмента 182 bp путем секвенирования.
  5. После подтверждения генотипа поднимите оставшиеся эмбрионы F1 до зрелости в соответствии со стандартными рекомендациями книги о рыбках данио21. Зажим и генотип их в возрасте 2-3 месяцев с использованием шагов 2.3-2.4 из протокола выше для дальнейшего подтверждения интеграции трансгена LMO1 в рыбу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: LMO1-положительная рыба F1 будет стабильной трансгенной рыбой [Tg(dβh:LMO1),Tg(dβh:mCherry)] (обозначенной как линия LMO1 ).
  6. Разводят F1 LMO1 стабильных трансгенных рыб с WT рыбой и повторяют по мере необходимости для размножения этой линии.

3. Пересечение трансгенных линий LMO1 и MYCN для создания метастатической модели

  1. После того, как трансгенная линия рыбок данио LMO1 получена, скрещивайтесь с линией MYCN6,17 для развития гетерозиготной трансгенной рыбной линии, чрезмерно экспрессирующей как MYCN, так и LMO1.
  2. При 1 dpf отсортируйте потомство ауткросса для экспрессии EGFP с помощью стереоскопического флуоресцентного микроскопа, который представлен в виде EGFP-положительных точек в области заднего мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, если не все эмбрионы отсортированы по MYCN при 1 dpf, поднимите эмбрионы до зрелого возраста и генотипа путем обрезки плавников и использования ранее заявленных руководящих принципов из шагов 2.3-2.4 для выделения гДНК и генотипирования ПЦР с праймерами: MYCN-F (5'-ATT CAC CAT CAC TGT GCG TCC-3'); MYCN-R (5'-TGC ATC CTC ACT CTC CAC GTA-3', и следующая программа со стандартной полимеразой Taq : 1 цикл 94 °C в течение 3 мин, 35 циклов (94 °C в течение 30 с, 60 °C в течение 30 с и 68 °C в течение 3 мин) и 68 °C в течение 7 мин с ожидаемым размером ампликона 145 bp.
  3. После сортировки по EGFP при 1 dpf изолируйте просеянные эмбрионы в отдельные чашки Петри и пометьте чашки как: MYCN+ (EGFP-положительный) или MYCN- (EGFP-отрицательный).
  4. При 3-4 dpf визуализируйте и сортируйте эмбрионы обеих групп (шаг 3.3) для экспрессии LMO1 с помощью стереоскопического флуоресцентного микроскопа. Ищите экспрессию красного флуоресцентного белка в виде пятен как в верхнем шейном ганглии, так и в не-PSNS дофаминергических нейронных клетках в области головы, особенно в продолговатом мозге заднего мозга6,13.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скрининг на вишню / LMO1 до того, как эмбрионы достигнут 5 dpf, потому что заполненные воздухом плавательные пузыри полностью развиваются к тому времени и заставят эмбрионы плавать, что приведет к трудной микроскопической фокусировке клеток PSNS во время процесса сортировки.
  5. Как только сортировка будет завершена, изолируйте отсортированную рыбу на четыре группы разных генотипов и пометьте, как показано ниже. Выращивайте отсортированную рыбу в одинаковых условиях согласно стандартным протоколам из книги «Рыбки данио»21.
    1. Только MYCN (EGFP-положительный),
    2. Только LMO1 (мВечерри-положительный),
    3. МИКН; LMO1 (EGFP и mCherry двойной положительный),
    4. WT (EGFP и mCherry двойной отрицательный).

4. Визуализация опухолевой нагрузки в трансгенных линиях рыбок данио

  1. Через 4 недели после оплодотворения (wpf) обезболить отсортированную рыбу со стадии 3,5 0,02% трикаином в чашке Петри.
  2. Визуализируйте опухоли с помощью стереоскопического флуоресцентного микроскопа, осторожно переворачивая рыб металлическим шпателем на обе боковые стороны, чтобы увидеть опухоль. Ожидайте, что опухоли будут представлять собой одиночные EGFP-, одиночные mCherry- или двойные EGFP-и-mCherry-положительные массы, которые возникают из области межпочечной железы (около головы и почки).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, что первоначальное начало опухоли обычно представлено более яркой и большей флуоресцентной положительной массой на одной стороне межпочечной железы, поэтому крайне важно визуализировать обе стороны рыб, чтобы избежать пропуска раннего начала опухоли.
  3. После идентификации возможной опухоленосной рыбы выделите рыбу в отдельный аквариум с соответствующими метками, которые включают дату рождения, дату скрининга опухоли и генотип.
  4. При 6 wpf повторите предыдущие шаги 4.1-4.3 для скрининга опухоленосных рыб и неопухолевых рыб снова, чтобы подтвердить наличие опухолей для ранее проверенных опухоленосных рыб или идентифицировать новых возможных опухоленосных рыб, соответственно. Ищите устойчивый или увеличенный размер флуоресцентно-положительной массы у подтвержденных опухоленосных рыб.
  5. После выявления опухоленосных рыб два раза в неделю контролируйте их за доказательствами миграции опухолевых клеток, которая представляет собой крошечные EGFP- и / или вишнеобразные опухолевые массы, удаленные от первичного места опухолевого генеза (межпочечной области железы). Выделите этих рыб в отдельные резервуары по мере необходимости и нанесите соответствующую маркировку, чтобы указать на возможные метастазы.
  6. Для дальнейшего подтверждения метастазирования продолжайте отслеживать этих рыб регулярно (каждые две недели) до тех пор, пока отдаленные флуоресцентно-положительные опухолевые массы не покажут явно увеличенные размеры, что указывает на рост опухолей в метастатических участках.

5. Обработка тканей и парафиновое сечение опухоленосных рыб

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот этап для характеристики спонтанно развившихся первичных и/или метастатических опухолей при MYCN и MYCN; LMO1 трансгенная рыба.

  1. После идентификации и проверки рыб, несущих опухоль, принесите в жертву рыбу со стадии 4,6 в чашку Петри, погружая рыбу в 0,02% трикаина, чтобы сначала обезболить, а затем увеличивая дозировку трикаина, пока рыба больше не дышит. Разрежьте рыбу на две части - с одним куском, содержащим голову и часть средней части тела (включая опухоль), и еще одним куском с остальной частью средней части рыбы и хвостом.
  2. Зафиксируйте обе секции рыбы 4% параформальдегидом (PFA) в 1x PBS в течение 1 ч при комнатной температуре на коромысле. Для повышения эффективности фиксации замените буфер свежим 4% PFA, чтобы эффективно и быстро увеличить проникновение во внутренние органы. Оставьте рыбу со свежим фиксирующим буфером на коромысле при 4 °C на ночь или на 48 ч.
    ВНИМАНИЕ: PFA токсичен. Поскольку предупредительные процедуры и правильная утилизация реагента зависят от правил вашего учреждения, обратитесь за надлежащими рекомендациями перед использованием и утилизацией реагента.
  3. Перед обработкой поместите образец (образцы) в 100% раствор быстрого декальцификатора в течение 15-20 мин при комнатной температуре. Обязательно используйте неметаллический контейнер и проверяйте образец (образцы) на протяжении всей инкубации, чтобы предотвратить чрезмерное декальцификацию. Если ткань образца выглядит сильно деградированной, поместите образец в воду или при температуре 4 °C, чтобы замедлить процесс декальцификации.
  4. После фиксации и декальцинации промывайте образец (образцы) рыбы проточной водопроводной водой в течение 1 ч и поместите его в кассету (кассеты) процессора. Если имеется более одного образца, разделите каждый из них на отдельную кассету.
  5. Обезвоживать и готовить ткань к встраиванию парафина путем помещения кассеты с рыбой в тканевой процессор, где образец (образцы) погружают в различные растворы, соответственно, следующим образом: 70% этанол (60 мин, 40 °C), 85% этанол (50 мин, 40 °C), 95% этанол (40 мин, 40 °C) дважды, 100% этанол (30 мин, 40 °C), другой свежий раствор 100% этанола (50 мин, 40 °C) дважды, ксилол (30 мин, 40 °C), еще один свежий раствор ксилола (50 мин, 40 °C), еще один свежий ксилол (50 мин, 45 °C), парафин (30 мин, 45 °C), парафин (20 мин, 58 °C) три раза.
  6. После того, как ткань обработана, выгрузите кассету (кассеты) из процессорной машины, сохраняя организацию каждой кассеты и предотвращая смешивание образцов рыбы.
  7. Выберите форму подходящего размера в зависимости от размера рыбы, убедившись, что форма будет соответствовать всей кассете с образцом рыбы. Закройте дно формы жидким парафином при температуре 60 °C.
  8. Немедленно поместите кассету с рыбой поверх плесени (убедившись, что рыба уложена на ее плоскую боковую сторону для сагиттальных секций) с жидким парафином и закончите наполнение парафином в верхнюю часть формы, чтобы полностью встроить рыбу.
  9. Поместите готовую форму на холодную пластину рассеченного микротома до тех пор, пока парафин не затвердеет.
  10. Как только парафиновый блок станет твердым, о чем можно судить, визуально наблюдая за более высокой непрозрачностью и твердым прикосновением к блоку, аккуратно извлеките блок из формы. Осторожно соскоблите лишний парафин со сторон кассеты.
  11. Разделите парафиновый рыбный блок сагиттально на 4 микрона на микротоме и плавайте секции на теплой водяной бане при 40 °C, содержащей дистиллированную воду.
  12. Осторожно переложите секции на положительно заряженные слайды и выпекайте в духовке при 60 °C в течение 30 минут перед окрашиванием, прежде чем перейти к шагу 6, 7 или 8.

6. Окрашивание гематоксилина и эозина (H&E) парафиновых срезов для обзора патологии

  1. Поместите слайды, содержащие парафиновые секции из шага 5.12, в держатель слайдов. Внутри химической вытяжки депарафинизируйте ксилолом 3 раза по 5 мин каждый. Выбрасывайте раствор после каждого использования.
  2. Регидратировать срезы со 100% этанолом в течение 3 мин, и повторить дважды со свежим 100% этанолом. Замените 100% этанол на 95% этанол в течение 3 мин, а затем 80% этанол в течение 3 мин.
  3. Промыть секции дистиллированной водой в течение 5 мин. Пока секции моются в воде, обязательно удалите окисленные частицы из гематоксилина путем фильтрации или обезжиривания поверхности гематоксилина безворсовой салфеткой.
  4. Промокните лишнюю воду из держателя слайда безворсовыми салфетками профессионального класса и окрашивайте горки в 50% гематоксилин (разбавление 1: 1 дистиллированной водой) в течение 2-5 минут в зависимости от желаемых предпочтений окрашивания и порчи реагентов. Откажитесь от гематоксилина, когда цвет раствора изменится с сливового на сине-коричневый или когда время окрашивания станет чрезмерным. Промойте горки проточной водопроводной водой в течение 20 минут.
  5. Обесцвечивайте срезы 1% кислым этанолом (3,3 мл соляной кислоты с 50 мл 70% этанола), быстро погружая слайды несколько раз. Горки можно опускать до 3 с, но чем дольше опускаются горки, тем легче становятся секции.
  6. Промойте горки в водопроводной воде дважды по 1 мин каждая и один раз деионизированной водой. Как вариант, горки можно оставить на ночь на этом этапе, замачивая в воде.
  7. Погружайте срезы в 1,36% раствор карбоната лития (47 г карбоната лития, 3500 мл воды) на 3 с. Убедитесь, что вы не чрезмерно инкубируете срезы, так как чем дольше время в растворе карбоната лития, тем больше вероятность того, что ткань будет плавать.
  8. Промойте секции в водопроводной воде в течение 5 минут и промойте лишнюю воду из держателя слайда безворсовыми салфетками профессионального класса.
  9. Размазывайте слайды 100% готовым к употреблению эозином в течение 15-30 с и немедленно обезвоживайте 95% этанолом дважды по 5 мин каждый. Заменить 100% этанолом дважды по 5 мин каждый, отбрасывая растворы после каждого использования.
  10. Очистите срезы в ксилоле в течение 15 мин и повторите дважды в общей сложности 3 раза. Опционально, горки можно оставить в ксилоле на ночь при комнатной температуре, чтобы лучше очистить избыток воды.
  11. Дайте слайдам высохнуть на воздухе в химическом вытяжном шкафу, а затем установите крышку с помощью монтажной среды для герметизации образца ткани.
  12. Визуализируйте и изобразите окрашенные участки тканей под микроскопией. Тщательно исследуйте опухоли в первичном месте (область межпочечной железы в головной почке) и отдаленные спорадические метастазы в других тканях и органах рыбы. Разошлите окрашенные слайды для участков тканей, которые будут рассмотрены патологоанатомами. Основываясь на патологических особенностях модели рыбы, сходных с нейробластомой человека, следует ожидать опухоли, возникшие только в MYCN или MYCN; Рыба LMO1 будет впервые диагностирована как нейробластома патологоанатомами.

7. Иммуногистохимический анализ (IHC) с антителами против NB-маркера и сверхэкспрессированных трансгенов для дальнейшего подтверждения распространения опухолей и их свойство симпатоадреналовой линии

  1. Окрашивание с полностью автоматической системой окрашивания
    1. Чтобы лучше сравнить результат IHC с результатом окрашивания H&E, выберите соседние слайды из шага 5.12 для окрашивания IHC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя автоматизированная система окрашивания обеспечивает более быстрые и менее трудоемкие результаты, ручной протокол окрашивания IHC может быть использован в отсутствие такового, ссылаясь на этапы подраздела 7.2.
    2. Разбавить первичное антитело против тирозингидроксилазы (TH) (1:500), маркера нейробластомы, на основе желаемой концентрации и общего количества, необходимого с помощью соответствующего разбавителя первичных антител автоматизированной системы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные концентрации антител могут варьироваться в зависимости от антитела и ткани.
    3. Поскольку автоматизированная система использует бортовой теплоиндуцированный забор антигена с раствором эпитопного извлечения в течение 20 мин и соответствующим реагентом системы обнаружения, убедитесь, что параметры для машины установлены следующим образом: Блокировка пероксидазы, 5 мин; Первичное антитело с желаемой концентрацией, 15 мин; биотинилированное анти-кроличье вторичное антитело IgG (1:500), 8 мин; Стрептавидин HRP, 8 мин; смешанный DAB интенсивный субстрат, 5 мин; и гематоксилин, 5 мин.
    4. Как только настройки будут установлены, поместите лоток антител в устройство. Настройте слайды, создав новый корпус, который будет помечать слайды. Теперь машина загружена и готова к работе (депарафинизация, окрашивание и контрокрашивание).
    5. После того, как слайды депарафинированы, окрашены и окрашены с помощью автоматизированной машины, обезвоживайте слайды в градиентах этанола 70%, 95% и 100% в течение 5 минут каждый. Снова погрузите слайды секций в 100% свежий этанол на 5 мин.
    6. Очистите участки в ксилоле в течение 5 мин, дважды или оставьте слайды в ксилоле на ночь, чтобы лучше очистить избыток воды.
    7. Дайте слайдам высохнуть на воздухе в химическом вытяжном шкафу, а затем установите крышку с помощью монтажной среды. Визуализируйте и изобразите окрашенные участки тканей с помощью микроскопии.
    8. Чтобы твердо подтвердить метастазирование в модели рыбы, сравните слайды, окрашенные антителами против маркера нейробластомы с этапа 7, с теми, которые окрашены H & E из шага 6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидайте увидеть положительное окрашивание для маркера нейробластомы, TH, во всех опухолевых клетках, идентифицированных окрашиванием H & E. Также не следует ожидать положительного окрашивания для TH в соседних тканях, где метастатические опухоли были идентифицированы в LMO1; Рыба MYCN . Убедитесь, что выбраны контрольные WT и MYCN-только рыбы, которые имеют возраст, аналогичный MYCN; LMO1 рыбы для этого анализа, чтобы исключить возможность того, что метастатические опухоли являются мультифокальными первичными опухолями.
  2. Ручное окрашивание без автоматизированной системы окрашивания IHC
    1. После того, как слайды запечены, выберите соседние слайды из шага 5.12, чтобы обеспечить лучшее сравнение между окрашиванием H&E и IHC для депарафинизации. Внутри химического вытяжного шкафа депаракс и регидратация слайдов ксилолом, используя предыдущие шаги 6.1 и 6.2. соответственно.
    2. После депараффифинизации и регидратации замочите слайды в эндогенном растворе, блокирующем перекись (1x PBS, содержащий 0,1% азида натрия и 0,3% перекиси водорода) в течение 5 мин при комнатной температуре. Вымойте слайды в свежем 1x PBS в течение 3 минут и повторите дважды в общей сложности 3 раза.
      ВНИМАНИЕ: Азид натрия остро токсичен. Обеспечьте практику предупредительных процедур и надлежащую утилизацию реагентов в зависимости от правил вашего учреждения.
    3. Получают антиген путем инкубации слайдов в растворе с протеиназой К (1:500 в 1x PBS) в течение 10 мин при комнатной температуре. Мойте слайды 3 раза по 1 pBS в течение 3 минут каждый.
    4. Блокируйте слайды путем инкубации с 5% козьей сывороткой в 1x PBS в течение 30 мин при комнатной температуре на коромысле. Мойте слайды свежим 1x PBS дважды по 3 мин каждая.
    5. Добавьте 4 капли блокирующего раствора Авидина непосредственно на слайд и инкубируйте в течение 15 мин при комнатной температуре. После промывки горок свежим 1x PBS дважды по 3 мин каждый, добавьте 4 капли раствора для блокировки биотина и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 мин.
    6. После блокирования слайдов инкубируют в первичном антителе тирозингидроксилазы (TH) (1:500) в течение 45-60 мин при комнатной температуре или на ночь при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание с дополнительными антителами против трансгенов и других соответствующих маркеров для решения физиологии и активности первичной опухоли и других метастатических участков. Оптимальные концентрации антител могут варьироваться в зависимости от антитела и ткани.
    7. Мойте слайды свежим 1x PBS в течение 3 минут, повторяя дважды в общей сложности 3 раза.
    8. Инкубировать слайды во вторичном антителе биотинилированного анти-кролика IgG вторичного антитела (1:500), разведенного в блокирующем растворе в течение 45-60 мин при комнатной температуре. Повторите предыдущий шаг стирки 7.2.7.
    9. Добавьте HRP конъюгированный авидин (1:300 в 1x PBS) и инкубируйте в течение 20 мин при комнатной температуре. Вымойте слайды 3 раза свежим 1x PBS в течение 5 минут каждый.
    10. Приготовьте раствор 3,3'-диаминобензидина (DAB) (2,5 мл дистиллированной воды, 1 капля буфера комплекта, 1 капля перекиси водорода и 2 капли DAB из комплекта) и поместите капли DAB непосредственно на слайды возле микроскопа. После добавления DAB понаблюдайте за реакцией изменения цвета на слайдах под микроскопом. Как только желаемая интенсивность окрашивания достигнута, остановите реакцию, поместив секции слайдов в холодную дистиллированную воду.
    11. Увлажняйте горки свежим 50% гематоксилином, погружая или погружая образцы на несколько коротких секунд и помещая обратно в дистиллированную воду. Повторите по желанию, но, как правило, одного раза должно быть достаточно, так как участки тканей тонкие.
    12. Обезвоживать образцы тканей на слайдах в градиенте алкоголя, как описано ранее на этапе 7.1.5, и продолжить прохождение оставшихся этапов (с последней стадией как 7.1.8) для завершения анализа IHC.

8. Picrosirius красное окрашивание парафиновых слайдов для накопления коллагена в опухолях как исследование механизма

  1. Повторите шаги 6.1-6.3, чтобы очистить, увлажнить и промыть парафиновые секции на слайдах.
  2. После смачивания лишней воды из держателя горки безворсовыми салфетками профессионального класса окрашивают в 50% гематоксилин в течение 10 мин. Промойте горки проточной водопроводной водой в течение 10 минут.
  3. Переложить горки в Picrosirius Red и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч.
  4. Промыть горки в подкисленной воде (5 мл ледниковой уксусной кислоты в 1 л водопроводной или дистиллированной воды) дважды, инкубируя в течение 5 мин на шейкере.
  5. Сначала отфильтруйте большую часть воды с горок, а затем физически встряхните и промокайте участки на горках, чтобы удалить как можно больше воды.
  6. Быстро поместите слайды в три смены 100% этанола для обезвоживания парафиновых секций.
  7. Повторите шаги 6.10 и 6.11, чтобы очистить слайды в ксилоле и смонтировать образец. Далее изображение с помощью составного микроскопа, который оснащен камерой.
  8. Используя ImageJ, подсчитайте красноположительные коллагеновые волокна picrosirius по крайней мере в трех случайных полях для каждого участка. Сравните слайды MYCN и MYCN; Секции рыбы LMO1.

Результаты

Чтобы определить, взаимодействует ли LMO1 с MYCN для воздействия на патогенез NB, трансгенные конструкции, которые управляют экспрессией LMO1 (dβh: LMO1 и dβh: mCherry) или MYCN (dβh: EGFP-MYCN) в клетках PSNS под контролем промотора dβh, были введены эмбрионам рыбок данио13.

Обсуждение

Рыбки данио широко использовались в исследованиях в течение последних нескольких десятилетий, особенно в исследованиях рака, по очевидным причинам, таким как простота обслуживания, надежное размножение и явные преимущества для визуализации in vivo1,28.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом R01 CA240323 (S.Z.) от Национального института рака; грант W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) от Министерства обороны США (DOD); награда V Scholar от V Фонда исследований рака (S.Z.) и грант платформы от Центра биомедицинских открытий Майо (S.Z.); и поддержка со стороны Онкологического центра клиники Майо и Центра индивидуализированной медицины (S.Z.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector KitVectorSK-4100
Acetic AcidFisher Scientific / Acros Organic64-19-7
Agarose GP2Midwest Scientific009012-36-6
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) AntibodyPel-FreezP40101
Avidin/Biotin Blocking KitVectorSP-2001
BOND Intense R DetectionLeica BiosystemsDS9263
BOND primary antibody diluentLeica Biosystems Newcastle, Ltd.AR9352
BOND-MAX IHC instrumentLeica Biosystems Newcastle, Ltd.N/Afully automated IHC staining system
CH211-270H11 BAC cloneBACPAC resources center (BRFC)N/A
Compound microscope equipped with DP71 cameraOlympusAX70
Cytoseal XYL (xylene based mounting medium)Richard-Allan Scientific8312-4
EosinLeica3801601ready-to-use (no preparation needed)
EthanolCarolina86-1263
Expand Long Template PCR SystemRoche Applied Science, IN11681834001
Gateway BP Clonase II enzyme mixInvitrogen, CA11789-020
Gateway LR Clonase II enzyme mixInvitrogen, CA11791-100
Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated)DakoE0432
Hematoxylin Solution, Harris ModifiedSigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFCHHS-32-1L
HRP Avidin DVectorA-2004
Hydrochloric AcidAqua Solutions4360-1L
Hydrogen Peroxide, 3%Fisher ScientificH324-500
I-SceI enzymeNew England Biolabs, MAR0694L
Kanamycin sulfateTeknova, Inc.K2150
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science KimwipesFisher Scientific34133
Lithium CarbonateSigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC554-13-2
Microtome for sectioningLeica BiosystemsRM2255
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coliInvitrogenC404006
p3E-polyA Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of UtahN/Aa generous gift
(Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)
Parafin waxSurgipath Paraplast39603002Parrafin to parafin
ParaformaldehydeAlfa AesarA11313
pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites)Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, GermanyN/Aa generous gift
pDONR 221 gateway donor vectorThermo Fisher Scientific12536-017
pDONRP4-P1R donor vector Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of UtahN/Aa generous gift
Phenol red, 0.5%Sigma Aldrich P0290
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10XBioRad1610780
Picrosirrius red stain kitPolysciences24901-250
pME-mCherryAddgene26028
Proteinase K, recombinant, PCR GradeRoche21712520
QIAprep Spin MiniPrep KitQiagen27104
RDO Rapid DecalcifierApex EnginerringRDO04
Sodium Azide (NaN3)Sigma Aldrich26628-22-8
Stereo fluorescence microscopeLeicaMZ10F
Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imagingNikonSMZ-1500
Taq DNA PolymeraseNew England Biolabs, MAM0273L
Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration ProcessorSakuraN/AModel #: VIP-6-A1
Tricaine-SWestern Chemical Incorporated20513
XyleneThermo Fisher ScientificX3P1GAL

Ссылки

  1. Veldman, M., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).
  2. Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Research. 6 (5), 694 (2008).
  3. Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).
  4. Benjamin, D. C., Hynes, R. O. Intravital imaging of metastasis in adult Zebrafish. BMC Cancer. 17 (1), 660 (2017).
  5. Kim, I. S., et al. Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma. Nature Communications. 8, 14343 (2017).
  6. Zhu, S., et al. Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
  7. Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. Neuroblastoma. Lancet. 369 (9579), 2106-2120 (2007).
  8. Park, J. R., et al. Children's oncology group's 2013 blueprint for research: neuroblastoma. Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).
  9. Hoehner, J. C., et al. A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors' progress along an extra-adrenal chromaffin lineage. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).
  10. Tsubota, S., Kadomatsu, K. Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma. Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).
  11. Tolbert, V. P., Matthay, K. K. Neuroblastoma: Clinical and biological approach to risk stratification and treatment. Cell and Tissue Research. 372 (2), 195-209 (2018).
  12. Maris, J. M. Recent advances in neuroblastoma. New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).
  13. Zhu, S., et al. LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis. Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).
  14. Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).
  15. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  16. Tao, T., et al. LIN28B regulates transcription and potentiates MYCN-induced neuroblastoma through binding to ZNF143 at target gene promotors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (28), 16516-16526 (2020).
  17. Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (97), e52567 (2015).
  18. Zhang, X., et al. Critical role for GAB2 in neuroblastoma pathogenesis through the promotion of SHP2/MYCN cooperation. Cell Reports. 18 (12), 2932-2942 (2017).
  19. Zimmerman, M. W., et al. MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification. Cancer Discovery. 8 (3), 320-335 (2018).
  20. Koach, J., et al. Drugging MYCN oncogenic signaling through the MYCN-PA2G4 binding interface. Cancer Research. 79 (21), 5652-5667 (2019).
  21. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  22. DuBois, S. G., et al. Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival. Journal of pediatric hematology/oncology. 21 (3), 181-189 (1999).
  23. Wattrus, S. J., Zon, L. I. Stem cell safe harbor: The hematopoietic stem cell niche in zebrafish. Blood Advances. 2 (21), 3063-3069 (2018).
  24. Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicologic Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
  25. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: Zebrafish and vertebrate immunity. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
  26. Junqueira, L. C., Cossermelli, W., Brentani, R. Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy. Archivum histologicum Japonicum (Nihon Soshikigaku Kiroku). 41 (3), 267-274 (1978).
  27. Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. I. Sirius red F3BA as a stain for connective tissue. Archives of Pathology. 78, 69-72 (1964).
  28. Ignatius, M. S., Hayes, M., Langenau, D. M. In vivo imaging of cancer in zebrafish. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 219-237 (2016).
  29. Howe, C. K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  30. Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).
  31. Yoganantharjah, P., Gibert, Y. The Use of the zebrafish model to aid in drug discovery and target validation. Current Topics in Medicinal Chemistry. 17 (18), 2041-2055 (2018).
  32. Ignatius, M. S., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 21 (5), 680-693 (2012).
  33. Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (44), 17406-17411 (2007).
  34. Ahmed, S., et al. Neuroblastoma with orbital metastasis: ophthalmic presentation and role of ophthalmologists. Eye. 20 (4), 466-470 (2006).
  35. Papaioannou, G., McHugh, K. Neuroblastoma in childhood: review and radiological findings. Cancer Imaging Society. 5 (1), 116-127 (2005).
  36. Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
  37. Amores, A., et al. Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution. Science. 282 (5394), 1711-1714 (1998).
  38. Postlethwait, J. H., et al. Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map. Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).
  39. Opazo, J. C., et al. Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins. Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

169

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены