Modèle de poisson-zèbre de métastases de neuroblastome

Résumé

Cet article présente la méthode de développement, de caractérisation et de suivi en temps réel des métastases tumorales dans le modèle de poisson zèbre du neuroblastome, en particulier dans la ligne transgénique de poisson-zèbre avec surexpression de MYCN et LMO1, qui développe des métastases spontanément.

Résumé

Le poisson-zèbre est devenu un modèle animal important pour étudier les maladies humaines, en particulier le cancer. Outre les technologies robustes d’édition transgénique et du génome appliquées à la modélisation du poisson-zèbre, la facilité d’entretien, la productivité à haut rendement et la puissante imagerie vivante font du poisson-zèbre un système modèle précieux pour étudier les métastases et les bases cellulaires et moléculaires sous-jacentes à ce processus in vivo. Le premier modèle de métastases du neuroblastome du poisson-zèbre (NB) a été développé en surexprimant deux oncogènes, MYCN et LMO1, sous contrôle du promoteur dopamine-bêta-hydroxylase (dβh). MyCN et LMO1 co-surexprimés ont conduit à la réduction de la latence et à l’augmentation de la pénétrance de la neuroblastomagenèse, ainsi qu’à une métastase à distance accélérée des cellules tumorales. Ce nouveau modèle réitère de manière fiable de nombreuses caractéristiques clés du NB métastatique humain, y compris l’implication d’altérations génétiques cliniquement pertinentes et associées aux métastases; développement naturel et spontané de métastases in vivo; et les sites conservés de métastases. Par conséquent, le modèle du poisson-zèbre possède des avantages uniques pour disséquer le processus complexe de métastases tumorales in vivo.

Introduction

Le poisson-zèbre a été largement utilisé et appliqué à plusieurs domaines de recherche, en particulier dans le cancer. Ce modèle offre de nombreux avantages, tels que sa reproduction robuste, son entretien rentable et sa visualisation polyvalente de la croissance tumorale et des métastases, qui font du poisson-zèbre un outil puissant pour étudier et étudier les bases cellulaires et moléculaires de la tumorigenèse et des métastases. De nouvelles techniques de cartographie du génome à grande échelle, de transgénèse, de surexpression ou d’assommation des gènes, de transplantation cellulaire et de criblages chimiques ont considérablement augmenté la puissance du modèle du....

Protocole

Toutes les méthodes de recherche utilisant le poisson-zèbre et les soins / entretien des animaux ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles de la Mayo Clinic.

1. Préparation et micro-injection de constructions transgéniques pour le développement de la ligne de poisson-zèbre transgénique LMO1 avec surexpression dans PSNS

1. Pour développer le clone d’entrée LMO1-pDONR221 , amplifier la région codante du LMO1 humain à partir de l’ADNc obtenu à partir d’une lignée cellulaire humaine à l’aide de la PCR.
   1. Faites une réaction de 25 μL comme détaillé ici: 2,5 μL de 10x tampon de réacti....

Résultats

Pour déterminer si le LMO1 est en synergie avec le MYCN pour affecter la pathogenèse du NB, des constructions transgéniques qui déterminent l’expression de LMO1 (dβh:LMO1 et dβh:mCherry) ou de MYCN (dβh:EGFP-MYCN) dans les cellules PSNS sous contrôle du promoteur dβh ont été injectées dans des embryons de poisson-zèbre13. Comme l’illustre la figure 1A, après le développement de .......

Discussion

Le poisson-zèbre est couramment utilisé dans la recherche depuis quelques décennies, en particulier dans la recherche sur le cancer, pour des raisons évidentes, telles que sa facilité d’entretien, sa reproduction robuste et ses avantages évidents pour l’imagerie in ^vivo1,28. Le modèle du poisson-zèbre peut être facilement manipulé embryonnairement en raison de sa fécondation externe et de son développement, ce qui complète bien les organ.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit	Vector	SK-4100
Acetic Acid	Fisher Scientific / Acros Organic	64-19-7
Agarose GP2	Midwest Scientific	009012-36-6
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody	Pel-Freez	P40101
Avidin/Biotin Blocking Kit	Vector	SP-2001
BOND Intense R Detection	Leica Biosystems	DS9263
BOND primary antibody diluent	Leica Biosystems Newcastle, Ltd.	AR9352
BOND-MAX IHC instrument	Leica Biosystems Newcastle, Ltd.	N/A	fully automated IHC staining system
CH211-270H11 BAC clone	BACPAC resources center (BRFC)	N/A
Compound microscope equipped with DP71 camera	Olympus	AX70
Cytoseal XYL (xylene based mounting medium)	Richard-Allan Scientific	8312-4
Eosin	Leica	3801601	ready-to-use (no preparation needed)
Ethanol	Carolina	86-1263
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
Gateway BP Clonase II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
Gateway LR Clonase II enzyme mix	Invitrogen, CA	11791-100
Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated)	Dako	E0432
Hematoxylin Solution, Harris Modified	Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC	HHS-32-1L
HRP Avidin D	Vector	A-2004
Hydrochloric Acid	Aqua Solutions	4360-1L
Hydrogen Peroxide, 3%	Fisher Scientific	H324-500
I-SceI enzyme	New England Biolabs, MA	R0694L
Kanamycin sulfate	Teknova, Inc.	K2150
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes	Fisher Scientific	34133
Lithium Carbonate	Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC	554-13-2
Microtome for sectioning	Leica Biosystems	RM2255
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404006
p3E-polyA	Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah	N/A	a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)
Parafin wax	Surgipath Paraplast	39603002	Parrafin to parafin
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	A11313
pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites)	Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany	N/A	a generous gift
pDONR 221 gateway donor vector	Thermo Fisher Scientific	12536-017
pDONRP4-P1R donor vector	Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah	N/A	a generous gift
Phenol red, 0.5%	Sigma Aldrich	P0290
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X	BioRad	1610780
Picrosirrius red stain kit	Polysciences	24901-250
pME-mCherry	Addgene	26028	(DBH construct)
Proteinase K, recombinant, PCR Grade	Roche	21712520
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
RDO Rapid Decalcifier	Apex Enginerring	RDO04
Sodium Azide (NaN3)	Sigma Aldrich	26628-22-8
Stereo fluorescence microscope	Leica	MZ10F
Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging	Nikon	SMZ-1500
Taq DNA Polymerase	New England Biolabs, MA	M0273L
Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor	Sakura	N/A	Model #: VIP-6-A1
Tricaine-S	Western Chemical Incorporated	20513
Xylene	Thermo Fisher Scientific	X3P1GAL