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Résumé

Cet article présente la méthode de développement, de caractérisation et de suivi en temps réel des métastases tumorales dans le modèle de poisson zèbre du neuroblastome, en particulier dans la ligne transgénique de poisson-zèbre avec surexpression de MYCN et LMO1, qui développe des métastases spontanément.

Résumé

Le poisson-zèbre est devenu un modèle animal important pour étudier les maladies humaines, en particulier le cancer. Outre les technologies robustes d’édition transgénique et du génome appliquées à la modélisation du poisson-zèbre, la facilité d’entretien, la productivité à haut rendement et la puissante imagerie vivante font du poisson-zèbre un système modèle précieux pour étudier les métastases et les bases cellulaires et moléculaires sous-jacentes à ce processus in vivo. Le premier modèle de métastases du neuroblastome du poisson-zèbre (NB) a été développé en surexprimant deux oncogènes, MYCN et LMO1, sous contrôle du promoteur dopamine-bêta-hydroxylase (dβh). MyCN et LMO1 co-surexprimés ont conduit à la réduction de la latence et à l’augmentation de la pénétrance de la neuroblastomagenèse, ainsi qu’à une métastase à distance accélérée des cellules tumorales. Ce nouveau modèle réitère de manière fiable de nombreuses caractéristiques clés du NB métastatique humain, y compris l’implication d’altérations génétiques cliniquement pertinentes et associées aux métastases; développement naturel et spontané de métastases in vivo; et les sites conservés de métastases. Par conséquent, le modèle du poisson-zèbre possède des avantages uniques pour disséquer le processus complexe de métastases tumorales in vivo.

Introduction

Le poisson-zèbre a été largement utilisé et appliqué à plusieurs domaines de recherche, en particulier dans le cancer. Ce modèle offre de nombreux avantages, tels que sa reproduction robuste, son entretien rentable et sa visualisation polyvalente de la croissance tumorale et des métastases, qui font du poisson-zèbre un outil puissant pour étudier et étudier les bases cellulaires et moléculaires de la tumorigenèse et des métastases. De nouvelles techniques de cartographie du génome à grande échelle, de transgénèse, de surexpression ou d’assommation des gènes, de transplantation cellulaire et de criblages chimiques ont considérablement augmenté la puissance du modèle du poisson-zèbre1. Au cours des dernières années, de nombreuses lignées de poissons-zèbres ont été développées pour étudier la tumorigenèse et les métastases d’une variété de cancers humains, y compris, mais sans s’y limiter, la leucémie, le mélanome, le rhabdomyosarcome et le carcinome hépatocellulaire2,3,4,5. De plus, le premier modèle de poisson-zèbre de neuroblastome (NB) a été généré en surexprimant MYCN, un oncogène, dans le système nerveux sympathique périphérique (PSNS) sous le contrôle du promoteur de la dopamine-bêta-hydroxylase (dβh). Avec ce modèle, il a été démontré que l’ALK activé peut créer une synergie avec MYCN pour accélérer l’apparition de la tumeur et augmenter la pénétrance tumorale in vivo6.

NB est dérivé de la lignée sympatho-surrénale des cellules de la crête neurale et est un cancer hautement métastatique chez les enfants7. Il est responsable de 10 % des décès liés au cancer pédiatrique8. Largement métastasé au moment du diagnostic, nb peut être cliniquement présenté comme des tumeurs provenant principalement le long de la chaîne des ganglions sympathiques et de la médullosurrénale de PSNS9,10. L’amplification du MYCN est généralement associée à de mauvais résultats chez les patients atteints de NB11,12. De plus, l’OVM1 a été identifié comme un gène critique de susceptibilité au NB dans les cas à haut risque13,14. Des études ont montré que la coexpression transgénique de MYCN et de LMO1 dans le PSNS du modèle du poisson-zèbre favorise non seulement l’apparition précoce du NB, mais induit également des métastases généralisées dans les tissus et les organes qui sont similaires aux sites couramment observés chez les patients atteints de NB13 à haut risque. Très récemment, un autre phénotype métastatique de NB a également été observé dans un nouveau modèle de POISSON-zèbre de NB, dans lequel MYCN et Lin28B, codant pour une protéine de liaison à l’ARN, sont surexprimés sous le contrôle du promoteur dβh16.

L’approche transgénique stable chez le poisson-zèbre est souvent utilisée pour étudier si la surexpression d’un gène d’intérêt pourrait contribuer au développement normal et à la pathogenèse de la maladie14,15. Cette technique a été utilisée avec succès pour démontrer l’importance de plusieurs gènes et voies pour la tumorigenèse NB6,16,17,18,19,20. Cet article présentera comment la lignée de poissons transgénique qui surexprime à la fois MYCN et LMO1 dans le PSNS a été créée et comment il a été démontré que la coopération de ces deux oncogènes accélère l’apparition de la tumorigenèse NB et des métastases13. Tout d’abord, la lignée transgénique qui surexprime EGFP-MYCN sous le contrôle du promoteur dβh (lignée MYCN désignée) a été développée en injectant la construction dβh-EGFP-MYCN dans une étape unicellulaire d’embryons AB de type sauvage (WT), comme décrit précédemment6,17. Une lignée transgénique distincte qui surexprime LMO1 dans la PSNS (lignée désignée LMO1) a été développée en cojectant deux constructions d’ADN, dβh-LMO1 et dβh-mCherry, dans des embryons WT au stade unicellulaire13. Il a déjà été démontré que les constructions à double ADN co-projetées peuvent être cointégrées dans le génome du poisson; par conséquent, LMO1 et mCherry sont coexprimés dans les cellules PSNS des animaux transgéniques. Une fois que les embryons F0 injectés ont atteint la maturité sexuelle, ils ont ensuite été croisés avec des poissons WT pour l’identification de poissons positifs avec intégration transgénique(s). En bref, la progéniture F1 a d’abord été examinée par microscopie fluorescente pour l’expression de mCherry dans les cellules PSNS. L’intégration germinale du LMO1 chez les poissons mCherry-positifs a été confirmée par PCR génomique et séquençage. Après identification réussie de chaque lignée transgénique, la descendance de poissons transgéniques hétérozygotes MYCN et LMO1 a été croisée pour générer une lignée de poissons composée exprimant à la fois MYCN et LMO1 (désigné MYCN; Ligne LMO1). MYCN porteur de tumeur; Les poissons LMO1 ont été surveillés par microscopie fluorescente toutes les deux semaines pour détecter la présence de tumeurs métastatiques dans les régions éloignées du site primaire, région de la glande interrénale (IRG, équivalent poisson-zèbre de la glande surrénale humaine)13. Confirmer la métastase des tumeurs dans MYCN; Des analyses LMO1, histologiques et immunohistochimiques ont été appliquées.

Protocole

Toutes les méthodes de recherche utilisant le poisson-zèbre et les soins / entretien des animaux ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles de la Mayo Clinic.

1. Préparation et micro-injection de constructions transgéniques pour le développement de la ligne de poisson-zèbre transgénique LMO1 avec surexpression dans PSNS

  1. Pour développer le clone d’entrée LMO1-pDONR221 , amplifier la région codante du LMO1 humain à partir de l’ADNc obtenu à partir d’une lignée cellulaire humaine à l’aide de la PCR.
    1. Faites une réaction de 25 μL comme détaillé ici: 2,5 μL de 10x tampon de réaction Taq standard, 0,125 μL d’ADN polymérase Taq , 0,5 μL de dNTP 10 mM, 2 μL de gabarit d’ADNc, 0,5 μL d’amorce LMO1 ATTB1 avant de μM, 0,5 μL d’amorce LMO1 ATTB2 inverse de 10 μM et 18,875 μL d’eau.
      REMARQUE: Utilisez l’amorce LMO1 ATTB1 avant: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACAC-3'.
      CATGATGGTGCTGGACAAGGAGGA-3' et amorce LMO1 ATTB2 inversée: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACT
      GAACTTGGGATTCAAAGGT-3'
    2. Amplifier à l’aide du programme suivant: 1 cycle de 94 °C, 2 min; suivi de 30 cycles de (94 °C, 30 s, 55 °C, 30 s, 72 °C, 1 min) et 72 °C, 7 min.
  2. Cloner le produit de PCR LMO1 dans le vecteur donneur passerelle pDONR221 par réaction de recombinase BP6,13 (fragment pcR + vecteur donneur = clone d’entrée).
    1. Pour une réaction de 10 μL, mélanger 1 μL de produit de PCR LMO1 purifié (150 ng/μL), 1 μL (150 ng/μL) de vecteur donneur pDONR221 et 6 μL de tampon TE (pH 8,0) avec 2 μL de mélange d’enzymes BP, incuber pendant 1 h à 25 °C et transformer en E. coli compétent TOP10 en utilisant le protocole du fabricant.
    2. Ensuite, étaler 50 à 200 μL du flacon de transformation sur une plaque de gélose Luria Broth (LB) contenant 50 μg/mL de kanamycine et incuber à 37 °C pendant la nuit.
    3. Sélectionner des clones en inoculant une seule colonie dans 2-5 mL de LB avec 50 μg/mL de kanamycine et en cultivant pendant la nuit (16-18 h) à 37 °C.
    4. Utilisez 2 mL de culture bactérienne pendant la nuit pour l’isolement plasmidique selon le protocole du fabricant. Pour vérifier le plasmide LMO1, envoyez l’échantillon de plasmide pour le séquençage avec l’amorce M13-F (5- GTAAAACGACGGCCAG-3').
  3. Pour générer un clone d’entrée dβh-pDONRP4-P1R, obtenez le produit PCR dβh6,13 en amplifiant la région promotrice de 5,2 kb en utilisant le clone BAC CH211-270H11 comme modèle pour préparer une réaction de 20 μL comme décrit précédemment à l’étape 1.1.1. Utilisez les paramètres de programme PCR suivants : 94 °C, 2 min ; 10 cycles de 94 °C, 15 s, 50 °C, 30 s, 68 °C, 8 min; 30 cycles de 94 °C, 15 s, 53 °C, 30 s, 68 °C, 8 min; 68 °C, 4 min (avec apprêt avant 5'GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTC
    CCCCTTTTTAGG-3' et amorce inverse 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTG
    TCGTCTTTTGA-3').
    REMARQUE: En raison des longs modèles d’ADN dans cette étape, assurez-vous d’utiliser un système de PCR approprié pour une amplification PCR précise.
  4. Cloner le produit de PCR dβh dans le vecteur donneur passerelle pDONRP4-P1R par réaction de recombinase BP6,13 (fragment PCR + vecteur donneur = clone d’entrée).
    1. Mélanger 1 μL de produit de PCR dβh purifié (172 ng/uL), 1 μL (150 ng/μL) de vecteur donneur pDONRP4-P1R et 6 μL de tampon TE (pH 8,0) avec 2 μL de mélange d’enzymes BP dans une réaction totale de 10 μL, incuber pendant 1 h à 25 °C.
    2. Transformez en TOP10 E. coli compétent selon le protocole du fabricant. Isoler le plasmide comme décrit aux étapes 1.2.2-1.2.4 et vérifier le plasmide par séquençage avec des amorces M13-F (5'-GTAAAACGACGGCCAG-3') et M13-R (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3').
  5. Générez la construction d’expression dβh:LMO1 .
    1. Combiner 1 μL de chaque clone d’entrée (dβh-pDONRP4-P1R, LMO1-pDONR221 et p3E-polyA11) (20 fmole chacun), 1 μL (60 ng/μL) de vecteur de destination modifié avec des sites de reconnaissance I-SceI, et 4 μL de tampon TE (pH 8,0) contenant 2 μL du mélange d’enzymes de recombinase LR. Incuber ce mélange pendant 1 h à 25 °C.
    2. Tout en suivant le protocole du fabricant, transformez les bactéries en TOP10 E. coli chimiquement compétent. Isoler le plasmide comme décrit aux étapes 1.2.2-1.2.4 et vérifier le plasmide par séquençage avec des amorces DBH Forward (5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTG-3') et LMO1 (5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA-3').
  6. Générez la construction d’ADN dβh:mCherry avec un système de passerelle en combinant des clones d’entrée d’un promoteur dβh de 5,2 kb, pME-mCherry et p3E-polyA dans le vecteur de destination modifié contenant des sites de reconnaissance I-SceI comme mentionné précédemment à l’étape 1.5.16. Isoler le plasmide comme décrit aux étapes 1.2.2-1.2.4 et vérifier le plasmide par séquençage avec l’amorce DBH Forward (5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTG-3').
  7. Linéariser la construction de l’ADN dβh:LMO1 et la construction de l’ADN dβh:mCherry (à un rapport de 3:1, respectivement) dans un volume de réaction total de 15 μL avec 1 μL d’enzyme I-SceI (5 U/μL) et 0,75 μL de tampon (10x), et incuber à température ambiante pendant au moins 4 h ou pendant la nuit. Assurez-vous que la concentration d’ADN ne dépasse pas 750 ng en réaction.
  8. Le lendemain et après linéarisation des constructions, ajouter 0,5 μL d’enzyme I-SceI fraîche (5 U/μL) et 0,5 μL de rouge phénolique à 0,5 % dans 5 μL de mélange d’ADN total de l’étape précédente de 1,7. Microinjecter la solution totale (de 50 à 80 pg d’ADN linéarisé) dans des embryons AB de type sauvage à un stade cellulaire (et jusqu’à 500 embryons) à l’aide d’une aiguille de micropipette en verre de 1,0 mm de diamètre, comme décrit précédemment17. Conservez le mélange d’ADN restant à -20 °C pour de futures injections.

2. Examiner et vérifier la lignée transgénique LMO1 pour la transmission germinale de LMO1 et mCherry

  1. À 3-4 jours après la fécondation (dpf), anesthésiez les embryons injectés avec 0,02% de tricaïne et dépister pour l’expression fluorescente de mCherry, qui se présente n’importe où dans le corps du poisson en raison de la transgénèse mosaïque. Transférer des embryons mCherry-positifs dans une boîte de Pétri avec de l’eau d’œuf fraîche et élever les embryons à maturité sexuelle conformément au livre sur le poisson-zèbre21.
    REMARQUE : Attendez-vous à ce que le ratio de poissons positifs varie en fonction de l’expertise et de l’expérience du personnel de recherche. Par exemple, les amateurs débutants peuvent avoir un faible taux d’intégration de 10%, par rapport à un expert de ≥50%.
  2. Pour déterminer le poisson fondateur avec des transgènes dβh:LMO1 et dβh:mCherry intégrés dans les cellules germinales, croiser des paires uniques de poissons mCherry-positifs injectés F0 sexuellement matures de l’étape précédente (2.1) avec des poissons WT AB. Filtrer la génération F1 pour les embryons mCherry-positifs à 3-4 dpf.
  3. Pour confirmer que les poissons mCherry-positif sont porteurs du transgène LMO1 , isoler l’ADNg de l’embryon unique F1 mCherry-positif à l’aide du tampon d’extraction de l’ADNg, qui contient : 12,5 μL de tampon de lyse 4x (500 μL de 1 M Tris avec un pH de 8,4, 2,5 mL de chlorure de potassium 1 M et 47 mL d’eau purifiée), 35 μL d’eau purifiée, et 2,5 μL de protéinase K à 10 mg/mL. Incuber l’échantillon pendant 16 h à 55 °C, puis 10 min à 98 °C.
  4. Utilisez l’ADNg extrait (2 μL) comme modèle pour la PCR de génotypage avec amorces : LMO1 FW : 5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA -3' et LMO1 RV : 5'-CGAAGGCTGGGATCAGCTTG -3', et le programme PCR suivant : 1 cycle de 94 °C, 10 min ; 35 cycles de (94 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 30 s; 68 °C, 30 s); et 68 °C pendant 7 min. Confirmez le fragment amplifié de 182 bp par séquençage.
  5. Après confirmation du génotype, élever les embryons F1 mCherry positifs restants à maturité conformément aux directives standard du livre de poisson zèbre21. Coupez les nageoires et les génotypez à l’âge de 2-3 mois en utilisant les étapes 2.3-2.4 du protocole ci-dessus pour confirmer davantage l’intégration du transgène LMO1 dans le poisson.
    REMARQUE: Le poisson F1 positif à l’OVM1 sera le poisson transgénique stable [Tg(dβh:LMO1),Tg(dβh:mCherry)] (désigné comme lignée LMO1 ).
  6. Élever F1 LMO1 poisson transgénique stable avec du poisson WT et répéter au besoin pour propager cette lignée.

3. Croisement des lignées transgéniques LMO1 et MYCN pour créer un modèle métastatique

  1. Une fois la lignée de poisson-zèbre transgénique LMO1 générée, croisez-la avec la ligne MYCN6,17 pour développer une ligne de poisson transgénique hétérozygote surexprimant à la fois MYCN et LMO1.
  2. À 1 dpf, trier la descendance de l’outcross pour l’expression de l’EGFP avec un microscope à fluorescence stéréoscopique, qui présente comme des points EGFP positifs dans la région du cerveau postérieur.
    REMARQUE: Alternativement, si tous les embryons ne sont pas triés pour MYCN à 1 dpf, élever les embryons à l’âge adulte et au génotype par coupe de nageoires et en utilisant les directives précédemment énoncées des étapes 2.3-2.4 pour l’isolement de l’ADNg et le génotypage par PCR, avec des amorces: MYCN-F (5'-ATT CAC CAT CAC TGT GCG TCC-3'); MYCN-R (5'-TGC ATC CTC ACT CTC CAC GTA-3', et le programme suivant avec la Taq polymérase standard : 1 cycle de 94 °C pendant 3 min, 35 cycles de (94 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 30 s et 68 °C pendant 3 min), et 68 °C pendant 7 min avec une taille d’amplicon prévue de 145 pb.
  3. Après avoir trié pour l’EGFP à 1 dpf, isolez les embryons criblés dans des boîtes de Petri séparées et étiquetez les plats comme suit: MYCN+ (EGFP-positif) ou MYCN- (EGFP-négatif).
  4. À 3-4 dpf, visualisez et triez les embryons des deux groupes (étape 3.3) pour l’expression de LMO1 avec un microscope à fluorescence stéréoscopique. Recherchez l’expression de protéines fluorescentes rouges sous forme de taches dans le ganglion cervical supérieur et les cellules neuronales dopaminergiques non PSNS dans la région de la tête, en particulier dans la médullaire oblongée du cerveau postérieur6,13.
    REMARQUE: Dépister mCherry / LMO1 avant que les embryons n’atteignent 5 dpf, car les vessies natatoires remplies d’air se développent complètement d’ici là et feront flotter les embryons, ce qui entraînera une focalisation microscopique difficile des cellules PSNS pendant le processus de tri.
  5. Une fois le tri terminé, isolez les poissons triés en quatre groupes de génotypes différents et étiquetez comme ci-dessous. Élevez les poissons triés dans des conditions identiques selon les protocoles standard du livre sur le poisson-zèbre21.
    1. MYCN uniquement (EGFP-positif),
    2. LMO1 uniquement (mCherry-positif),
    3. MYCN; LMO1 (EGFP et mCherry double positif),
    4. WT (EGFP et mCherry double négatif).

4. Visualisation de la charge tumorale dans les lignées transgéniques de poisson-zèbre

  1. À 4 semaines après la fécondation (wpf), anesthésiez les poissons triés à partir de l’étape 3.5 avec 0,02% de tricaïne dans une boîte de Pétri.
  2. Visualisez les tumeurs avec un microscope à fluorescence stéréoscopique en retournant doucement les poissons avec une spatule métallique sur les deux côtés latéraux pour voir la tumeur. Attendez-vous à ce que les tumeurs se présentent sous la forme de masses EGFP-, simple mCherry-, ou double EGFP-et-mCherry-positives qui proviennent de la région de la glande interrénale (près de la tête et des reins).
    REMARQUE: Il est possible que l’apparition initiale de la tumeur soit généralement présentée avec une masse positive de fluorescence plus brillante et plus grande d’un côté de la glande internatale, c’est pourquoi il est crucial de visualiser les deux côtés du poisson pour éviter de manquer l’apparition précoce de la tumeur.
  3. Après avoir identifié les poissons potentiellement porteurs de tumeurs, isolez les poissons dans un réservoir séparé avec des étiquettes appropriées, qui comprennent la date de naissance, la date à laquelle la tumeur a été dépistée et le génotype.
  4. À 6 wpf, répétez les étapes précédentes 4.1 à 4.3 pour dépister à nouveau les poissons porteurs de tumeurs et les poissons non porteurs de tumeurs afin de confirmer la présence de tumeurs pour les poissons porteurs de tumeurs précédemment sélectionnés ou d’identifier de nouveaux poissons porteurs de tumeurs possibles, respectivement. Recherchez une taille soutenue ou accrue de masse positive à fluorescence chez les poissons porteurs de tumeurs confirmés.
  5. Après avoir identifié les poissons porteurs de tumeurs, surveillez-les toutes les deux semaines pour détecter des signes de migration des cellules tumorales, qui se présentent sous la forme de minuscules masses tumorales EGFP et / ou mCherry positives loin du site primaire de la tumorgenèse (région de la glande interrénale). Isolez ces poissons dans des réservoirs séparés au besoin et étiquetez de manière appropriée pour indiquer les métastases possibles.
  6. Pour confirmer davantage les métastases, continuez à suivre ces poissons régulièrement (toutes les deux semaines) jusqu’à ce que les masses tumorales à fluorescence positive montrent une taille clairement accrue, indiquant la croissance de tumeurs dans les sites métastatiques.

5. Traitement des tissus et sectionnement de la paraffine des poissons porteurs de tumeurs

REMARQUE: Effectuer cette étape pour caractériser les tumeurs primaires et / ou métastatiques développées spontanément dans MYCN et MYCN; Poisson transgénique LMO1 .

  1. Après l’identification et la vérification des poissons porteurs de tumeurs, sacrifiez les poissons à partir de l’étape 4.6 dans une boîte de Pétri en immergeant les poissons dans 0,02% de tricaïne pour anesthésier d’abord, puis en augmentant la dose de tricaïne jusqu’à ce que le poisson ne respire plus. Coupez le poisson en deux morceaux - avec un morceau contenant la tête et une partie de la section centrale du corps (y compris la tumeur), et un autre morceau avec le reste de la section centrale et de la queue du poisson.
  2. Fixez les deux sections de poisson avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans 1x PBS pendant 1 h à température ambiante sur une bascule. Pour améliorer l’efficacité de la fixation, remplacez le tampon par du PFA frais de 4% pour augmenter la pénétrance des organes internes efficacement et rapidement. Laisser le poisson avec un tampon de fixation frais sur une bascule à 4 °C pendant la nuit ou pendant 48 h.
    ATTENTION : Le PFA est toxique. Étant donné que les procédures de précaution et l’élimination appropriée du réactif dépendent de la réglementation de votre établissement, demandez des directives appropriées avant d’utiliser et d’éliminer le réactif.
  3. Avant le traitement, placer le(s) échantillon(s) dans une solution décalcifiante rapide à 100% pendant 15 à 20 min à température ambiante. Assurez-vous d’utiliser un récipient non métallique et de vérifier le ou les échantillons tout au long de l’incubation pour éviter une décalcification excessive. Si le tissu de l’échantillon semble fortement dégradé, placez l’échantillon dans de l’eau ou à 4 °C pour ralentir le processus de décalcification.
  4. Une fois fixés et décalcifiés, lavez les échantillons de poisson avec de l’eau courante du robinet pendant 1 h et placez-les dans une ou plusieurs cassettes de processeur. S’il y a plus d’un échantillon, séparez-le dans sa propre cassette.
  5. Déshydrater et préparer le tissu pour l’incorporation de paraffine en plaçant des cassettes avec du poisson dans le processeur de tissus où les échantillons sont immergés dans diverses solutions, respectivement, comme suit: éthanol à 70% (60 min, 40 °C), éthanol à 85% (50 min, 40 °C), éthanol à 95% (40 min, 40 °C) deux fois, 100% éthanol (30 min, 40 °C), une autre solution fraîche d’éthanol à 100% (50 min, 40 °C) deux fois, xylène (30 min, 40 °C), une autre solution fraîche de xylène (50 min, 40 °C), un autre xylène frais (50 min, 45 °C), paraffine (30 min, 45 °C), paraffine (20 min, 58 °C) trois fois.
  6. Une fois le tissu traité, déchargez la ou les cassettes de la machine à processeur tout en maintenant l’organisation de chaque cassette et en vous assurant d’éviter de mélanger les échantillons de poisson.
  7. Choisissez le moule de taille appropriée en fonction de la taille du poisson, en vous assurant que le moule s’adaptera à toute la cassette avec l’échantillon de poisson. Couvrir le fond du moule avec de la paraffine liquide à 60 °C.
  8. Placez immédiatement la cassette avec le poisson sur le dessus du moule (en vous assurant que le poisson est posé sur son côté latéral plat pour les sections sagittales) avec de la paraffine liquide et terminez le remplissage avec de la paraffine au sommet du moule pour intégrer complètement le poisson.
  9. Placez le moule fini sur la plaque froide du microtome sectionnant jusqu’à ce que la paraffine soit durcie.
  10. Une fois que le bloc de paraffine est dur, ce qui peut être jugé en observant visuellement une opacité plus élevée et un toucher ferme du bloc, retirez doucement le bloc du moule. Grattez soigneusement tout excès de paraffine sur les côtés de la cassette.
  11. Couper le bloc de poisson incrusté de paraffine à 4 microns sur le microtome et faire flotter les sections sur un bain d’eau chaude à 40 °C contenant de l’eau distillée.
  12. Transférer délicatement les sections sur des lames chargées positivement et cuire au four à 60 °C pendant 30 min avant la coloration avant de passer à l’étape 6, 7 ou 8.

6. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) des sections de paraffine pour examen de la pathologie

  1. Placez les diapositives contenant des sections de paraffine de l’étape 5.12 dans un porte-diapositives. À l’intérieur d’une hotte chimique, déparaffiner avec du xylène 3 fois, 5 min chacun. Jeter la solution après chaque utilisation.
  2. Réhydrater les sections avec 100% d’éthanol pendant 3 min, et répéter deux fois avec de l’éthanol frais à 100%. Remplacez l’éthanol à 100 % par de l’éthanol à 95 % pendant 3 min, puis l’éthanol à 80 % pendant 3 min.
  3. Rincer les sections à l’eau distillée pendant 5 min. Pendant que les sections sont lavées dans l’eau, assurez-vous d’éliminer les particules oxydées de l’hématoxyline en filtrant ou en écrémant la surface de l’hématoxyline avec une lingette non pelucheuse.
  4. Épongez l’excès d’eau du porte-lames avec des lingettes de qualité professionnelle non pelucheuses et tachez les lames dans de l’hématoxyline à 50% (dilution 1:1 avec de l’eau distillée) pendant 2 à 5 minutes en fonction de la préférence de coloration souhaitée et de la détérioration du réactif. Jetez l’hématoxyline lorsque la couleur de la solution passe de la prune au bleu / brun ou lorsque le temps de coloration devient excessif. Rincez les glissières à l’eau courante du robinet pendant 20 min.
  5. Décolorer les sections dans de l’éthanol acide à 1 % (3,3 mL d’acide chlorhydrique avec 50 mL d’éthanol à 70 %) en trempant rapidement les lames plusieurs fois. Les diapositives peuvent être trempées jusqu’à 3 s, mais plus les diapositives sont trempées longtemps, plus les sections deviennent légères.
  6. Rincez les lames à l’eau du robinet deux fois pendant 1 min chacune, et une fois avec de l’eau désionisée. En option, les toboggans peuvent être laissés pendant la nuit à ce stade, trempant dans l’eau.
  7. Immerger les sections dans une solution de carbonate de lithium à 1,36% (47 g de carbonate de lithium, 3500 mL d’eau) pendant 3 s. Assurez-vous de ne pas trop incuber les sections car plus le temps passé dans la solution de carbonate de lithium est long, plus le tissu a de chances de flotter.
  8. Rincez les sections à l’eau du robinet pendant 5 minutes et épongez l’excès d’eau du porte-glissière avec des lingettes de qualité professionnelle non pelucheuses.
  9. Contre-maintenir les lames dans de l’éosine 100% prête à l’emploi pendant 15-30 s, et se déshydrater immédiatement avec de l’éthanol à 95% deux fois pendant 5 min chacune. Remplacer par de l’éthanol à 100% deux fois pendant 5 min chacun, en jetant les solutions après chaque utilisation.
  10. Effacez les sections dans le xylène pendant 15 minutes et répétez deux fois pendant 3 fois au total. En option, les lames peuvent être laissées dans du xylène pendant la nuit à température ambiante pour mieux éliminer l’excès d’eau.
  11. Laissez les glissières sécher à l’air libre dans la hotte de fumée chimique, puis montez un couvercle à l’aide d’un support de montage pour sceller l’échantillon de tissu.
  12. Visualisez et imagez les sections de tissus colorés sous microscopie. Examinez attentivement les tumeurs au site primaire (la région de la glande internadale dans le rein de la tête) et les métastases sporadiques à distance dans d’autres tissus et organes du poisson. Envoyez des lames tachées pour les coupes de tissus à examiner par les pathologistes. Sur la base des caractéristiques pathologiques similaires du modèle de poisson au neuroblastome humain, attendez-vous à ce que les tumeurs apparues dans MYCN uniquement ou MYCN; Le poisson LMO1 doit d’abord être diagnostiqué comme neuroblastome par les pathologistes.

7. Analyse immunohistochimique (IHC) avec des anticorps contre le marqueur NB et les transgènes surexprimés pour confirmer davantage la propagation de la tumeur et leur propriété de lignée sympathoadrénale

  1. Coloration avec système de coloration entièrement automatique
    1. Pour mieux comparer le résultat IHC avec celui de la coloration H&E, sélectionnez les lames adjacentes à l’étape 5.12 pour la coloration IHC.
      REMARQUE: Bien qu’un système de coloration automatisé permette des résultats plus rapides et moins laborieux, un protocole manuel pour la coloration IHC peut être utilisé en l’absence de tel en se référant aux étapes de la sous-section 7.2.
    2. Diluer l’anticorps primaire contre la tyrosine hydroxylase (TH) (1:500), un marqueur de neuroblastome, en fonction de la concentration souhaitée et de la quantité totale nécessaire avec le diluant d’anticorps primaire correspondant du système automatisé.
      REMARQUE: Les concentrations optimales d’anticorps peuvent varier en fonction des anticorps et des tissus.
    3. Étant donné que le système automatisé utilise la récupération d’antigène induite par la chaleur à bord avec une solution de récupération d’épitope pendant 20 minutes et le réactif de détection correspondant du système, assurez-vous que les paramètres de la machine sont définis comme suit: Blocage de la peroxydase, 5 min; Anticorps primaire avec concentration souhaitée, 15 min; anticorps secondaire IgG biotinylé anti-lapin (1:500), 8 min; Streptavidine HRP, 8 min; substrat intense DAB mixte, 5 min; et Hématoxyline, 5 min.
    4. Une fois les paramètres définis, placez le plateau d’anticorps dans la machine. Configurez les diapositives en créant un nouveau boîtier, qui étiquetera les diapositives. La machine est maintenant chargée et prête à fonctionner (déparaffinage, coloration et contre-coloration).
    5. Une fois les lames déparaffinées, colorées et contre-colorées à l’aide de la machine automatisée, déshydratez les lames dans des gradients d’éthanol de 70%, 95% et 100% pendant 5 min chacun. Immergez à nouveau les lames de sections dans de l’éthanol 100% frais pendant 5 min.
    6. Nettoyez les sections dans le xylène pendant 5 min, deux fois, ou laissez les lames dans le xylène pendant la nuit pour mieux éliminer l’excès d’eau.
    7. Laissez les glissières sécher à l’air libre dans la hotte à fumée chimique, puis montez un couvercle à l’aide d’un support de montage. Visualisez et imagez les sections de tissus colorés à la microscopie.
    8. Pour confirmer fermement les métastases dans le modèle de poisson, comparez les lames colorées avec des anticorps contre le marqueur du neuroblastome de l’étape 7 à celles colorées par H & E à partir de l’étape 6.
      REMARQUE: Attendez-vous à voir une coloration positive pour le marqueur de neuroblastome, TH, dans toutes les cellules tumorales identifiées par la coloration H & E. Ne vous attendez pas non plus à une coloration positive pour la TH dans les tissus adjacents où les tumeurs métastatiques ont été identifiées dans LMO1; Poisson MYCN . Assurez-vous de sélectionner des poissons de contrôle WT et MYCN seulement qui sont d’âge similaire à MYCN; LMO1 poisson pour cette analyse afin d’exclure la possibilité que les tumeurs métastatiques soient des tumeurs primaires multifocales.
  2. Coloration manuelle sans système de coloration IHC automatisé
    1. Une fois les lames cuites, sélectionnez les diapositives adjacentes à l’étape 5.12 pour permettre une meilleure comparaison entre la coloration H&E et IHC à déparaffiniser. À l’intérieur d’une hotte à fumée chimique, déparaffinez et réhydratez les lames avec du xylène en utilisant les étapes précédentes 6.1 et 6.2., respectivement.
    2. Après déparaffinisation et réhydratation, faire tremper les lames dans une solution endogène bloquant le peroxyde (1x PBS contenant 0,1% d’azoture de sodium et 0,3% de peroxyde d’hydrogène) pendant 5 min à température ambiante. Lavez les lames dans 1x PBS frais pendant 3 min et répétez deux fois pour un total de 3 fois.
      ATTENTION : L’azoture de sodium est extrêmement toxique. Assurez-vous de pratiquer des procédures de précaution et d’éliminer correctement le réactif en fonction de la réglementation de votre établissement.
    3. Récupérer l’antigène en incubant des lames en solution avec de la protéinase K (1:500 dans 1x PBS) pendant 10 min à température ambiante. Lavez les diapositives 3 fois avec 1x PBS pendant 3 minutes chacune.
    4. Bloquez les lames en incubant avec 5% de sérum de chèvre dans 1x PBS pendant 30 min à température ambiante sur bascule. Lavez les diapositives avec 1x PBS frais deux fois pendant 3 minutes chacune.
    5. Ajouter 4 gouttes de solution bloquant Avidin directement sur la lame et incuber pendant 15 min à température ambiante. Après avoir lavé les lames avec 1x PBS frais deux fois pendant 3 min chacune, ajouter 4 gouttes de solution bloquant la biotine et incuber à température ambiante pendant 15 min.
    6. Après avoir bloqué les lames, incuber dans un anticorps primaire de tyrosine hydroxylase (TH) (1:500) pendant 45-60 min à température ambiante, ou pendant la nuit à 4 °C.
      REMARQUE: Coloration avec des anticorps supplémentaires contre les transgènes et d’autres marqueurs pertinents pour traiter la physiologie et l’activité de la tumeur primaire et d’autres sites métastatiques. Les concentrations optimales d’anticorps peuvent varier en fonction des anticorps et des tissus.
    7. Lavez les diapositives avec 1x PBS frais pendant 3 min, en répétant deux fois avec un total de 3 fois.
    8. Incuber des lames dans un anticorps secondaire d’anticorps biotinylé anti-lapin IgG (1:500) dilué dans une solution bloquante pendant 45-60 min à température ambiante. Répétez l’étape de lavage précédente 7.2.7.
    9. Ajouter l’Avidin conjugué HRP (1:300 dans 1x PBS) et incuber pendant 20 min à température ambiante. Lavez les diapositives 3 fois avec 1x PBS frais pendant 5 minutes chacune.
    10. Préparer une solution de 3,3'-diaminobenzidine (DAB) (2,5 mL d’eau distillée, 1 goutte de tampon en kit, 1 goutte de peroxyde d’hydrogène et 2 gouttes de DAB du kit) et placer des gouttes de DAB directement sur des lames près d’un microscope. Après avoir ajouté DAB, observez la réaction de changement de couleur sur les lames au microscope. Une fois l’intensité de coloration souhaitée atteinte, arrêtez la réaction en plaçant des sections de lame dans de l’eau distillée froide.
    11. Contre-maintenir les lames avec de l’hématoxyline fraîche à 50% en submergeant ou en trempant des échantillons pendant quelques secondes et en les replaçant dans de l’eau distillée. Répétez comme vous le souhaitez, mais normalement, une fois devrait suffire car les sections de tissus sont minces.
    12. Déshydrater les échantillons de tissus sur les lames dans le gradient d’alcool comme décrit précédemment à l’étape 7.1.5 et continuer à travers les étapes restantes (avec la dernière étape comme 7.1.8) pour terminer l’analyse IHC.

8. Coloration rouge Picrosirius des lames de paraffine pour l’accumulation de collagène dans les tumeurs comme étude du mécanisme

  1. Répétez les étapes 6.1 à 6.3 pour dégazer, hydrater et laver les sections de paraffine sur les diapositives.
  2. Après avoir effacé l’excès d’eau du porte-glissière avec des lingettes non pelucheuses de qualité professionnelle, tacher 50% d’hématoxyline pendant 10 min. Rincez les lames à l’eau courante du robinet pendant 10 min.
  3. Transférer les lames dans Picrosirius Red et incuber à température ambiante pendant 1 h.
  4. Laver les lames dans de l’eau acidifiée (5 mL d’acide acétique glacial dans 1 L d’eau du robinet ou distillée) deux fois, en incubant pendant 5 min sur shaker.
  5. Décantez d’abord la majeure partie de l’eau des toboggans avant de secouer physiquement et d’éponger les sections sur les toboggans pour enlever autant d’eau que possible.
  6. Placez rapidement les glissières dans trois changements d’éthanol à 100% pour déshydrater les sections de paraffine.
  7. Répétez les étapes 6.10 et 6.11 pour dégager les lames dans le xylène et l’échantillon de montage. Ensuite, image avec microscope composé équipé d’une caméra.
  8. À l’aide d’ImageJ, comptez les fibres de collagène picrosirius rouge positif dans au moins trois champs aléatoires pour chaque section. Comparer entre les diapositives de MYCN et MYCN; Sections de poissons LMO1.

Résultats

Pour déterminer si le LMO1 est en synergie avec le MYCN pour affecter la pathogenèse du NB, des constructions transgéniques qui déterminent l’expression de LMO1 (dβh:LMO1 et dβh:mCherry) ou de MYCN (dβh:EGFP-MYCN) dans les cellules PSNS sous contrôle du promoteur dβh ont été injectées dans des embryons de poisson-zèbre13. Comme l’illustre la figure 1A, après le développement de ...

Discussion

Le poisson-zèbre est couramment utilisé dans la recherche depuis quelques décennies, en particulier dans la recherche sur le cancer, pour des raisons évidentes, telles que sa facilité d’entretien, sa reproduction robuste et ses avantages évidents pour l’imagerie in vivo1,28. Le modèle du poisson-zèbre peut être facilement manipulé embryonnairement en raison de sa fécondation externe et de son développement, ce qui complète bien les organ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une subvention R01 CA240323 (S.Z.) de l’Institut national du cancer; une subvention W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) du Département de la Défense des États-Unis (DoD); un prix V Scholar de la V Foundation for Cancer Research (S.Z.) et une subvention de plateforme du Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); et le soutien du Mayo Clinic Cancer Center et du Center for Individualized Medicine (S.Z.).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector KitVectorSK-4100
Acetic AcidFisher Scientific / Acros Organic64-19-7
Agarose GP2Midwest Scientific009012-36-6
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) AntibodyPel-FreezP40101
Avidin/Biotin Blocking KitVectorSP-2001
BOND Intense R DetectionLeica BiosystemsDS9263
BOND primary antibody diluentLeica Biosystems Newcastle, Ltd.AR9352
BOND-MAX IHC instrumentLeica Biosystems Newcastle, Ltd.N/Afully automated IHC staining system
CH211-270H11 BAC cloneBACPAC resources center (BRFC)N/A
Compound microscope equipped with DP71 cameraOlympusAX70
Cytoseal XYL (xylene based mounting medium)Richard-Allan Scientific8312-4
EosinLeica3801601ready-to-use (no preparation needed)
EthanolCarolina86-1263
Expand Long Template PCR SystemRoche Applied Science, IN11681834001
Gateway BP Clonase II enzyme mixInvitrogen, CA11789-020
Gateway LR Clonase II enzyme mixInvitrogen, CA11791-100
Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated)DakoE0432
Hematoxylin Solution, Harris ModifiedSigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFCHHS-32-1L
HRP Avidin DVectorA-2004
Hydrochloric AcidAqua Solutions4360-1L
Hydrogen Peroxide, 3%Fisher ScientificH324-500
I-SceI enzymeNew England Biolabs, MAR0694L
Kanamycin sulfateTeknova, Inc.K2150
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science KimwipesFisher Scientific34133
Lithium CarbonateSigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC554-13-2
Microtome for sectioningLeica BiosystemsRM2255
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coliInvitrogenC404006
p3E-polyA Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of UtahN/Aa generous gift
(Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)
Parafin waxSurgipath Paraplast39603002Parrafin to parafin
ParaformaldehydeAlfa AesarA11313
pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites)Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, GermanyN/Aa generous gift
pDONR 221 gateway donor vectorThermo Fisher Scientific12536-017
pDONRP4-P1R donor vector Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of UtahN/Aa generous gift
Phenol red, 0.5%Sigma Aldrich P0290
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10XBioRad1610780
Picrosirrius red stain kitPolysciences24901-250
pME-mCherryAddgene26028
Proteinase K, recombinant, PCR GradeRoche21712520
QIAprep Spin MiniPrep KitQiagen27104
RDO Rapid DecalcifierApex EnginerringRDO04
Sodium Azide (NaN3)Sigma Aldrich26628-22-8
Stereo fluorescence microscopeLeicaMZ10F
Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imagingNikonSMZ-1500
Taq DNA PolymeraseNew England Biolabs, MAM0273L
Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration ProcessorSakuraN/AModel #: VIP-6-A1
Tricaine-SWestern Chemical Incorporated20513
XyleneThermo Fisher ScientificX3P1GAL

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