Zebrafisch-Modell der Neuroblastom-Metastasierung

Zusammenfassung

Diese Arbeit stellt die Methode der Entwicklung, Charakterisierung und Verfolgung in Echtzeit der Tumormetastasierung im Zebrafischmodell des Neuroblastoms vor, insbesondere in der transgenen Zebrafischlinie mit Überexpression von MYCN und LMO1, die spontan Metastasen entwickelt.

Zusammenfassung

Zebrafische haben sich zu einem wichtigen Tiermodell entwickelt, um menschliche Krankheiten, insbesondere Krebs, zu untersuchen. Zusammen mit den robusten transgenen und Genom-Editing-Technologien, die bei der Zebrafischmodellierung eingesetzt werden, machen die einfache Wartung, die ertragreiche Produktivität und die leistungsstarke Live-Bildgebung den Zebrafisch insgesamt zu einem wertvollen Modellsystem, um Metastasen und zelluläre und molekulare Grundlagen, die diesem Prozess zugrunde liegen, in vivo zu untersuchen. Das erste Zebrafisch-Neuroblastom -Modell (NB) der Metastasierung wurde durch Überexpression von zwei Onkogenen, MYCN und LMO1, unter Kontrolle des Dopamin-beta-Hydroxylase (dβh) -Promotors entwickelt. Co-überexprimiertes MYCN und LMO1 führten zur reduzierten Latenz und erhöhten Penetranz der Neuroblastomagenese sowie zu einer beschleunigten Fernmetastasierung von Tumorzellen. Dieses neue Modell wiederholt zuverlässig viele Schlüsselmerkmale der metastasierenden NB beim Menschen, einschließlich der Beteiligung klinisch relevanter und metastasenassoziierter genetischer Veränderungen; natürliche und spontane Entwicklung von Metastasen in vivo; und konservierte Metastasenstellen. Daher besitzt das Zebrafischmodell einzigartige Vorteile, um den komplexen Prozess der Tumormetastasierung in vivo zu analysieren.

Einleitung

Zebrafisch wurde in verschiedenen Forschungsbereichen, insbesondere bei Krebs, weit verbreitet und angewendet. Dieses Modell bietet viele Vorteile - wie seine robuste Reproduktion, kostengünstige Wartung und vielseitige Visualisierung von Tumorwachstum und Metastasierung -, die Zebrafische zu einem leistungsstarken Werkzeug machen, um die zellulären und molekularen Grundlagen der Tumorgenese und Metastasierung zu untersuchen und zu untersuchen. Neue Techniken für groß angelegte Genomkartierung, Transgenese, Genüberexpression oder Knockout, Zelltransplantation und chemische Screens haben die Leistungsfähigkeit des Zebrafischmodells ^{immens erhöht1}. In den letzten Jahren wurden viele Zebrafischlinien entwickelt, um die Tumorgenese und Metastasierung einer Vielzahl von menschlichen Krebsarten zu untersuchen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Leukämie, Melanom, Rhabdomyosarkom und hepatozelluläres Karzinom2,3,4,5. Darüber hinaus wurde das erste Zebrafischmodell des Neuroblastoms (NB) durch Überexpression von MYCN, einem Onkogen, im peripheren sympathischen Nervensystem (PSNS) unter Kontrolle des Dopamin-beta-Hydroxylase(dβh)-Promotors erzeugt. Mit diesem Modell wurde weiter gezeigt, dass aktiviertes ALK mit MYCN synergistisch wirken kann, um den Tumorbeginn zu beschleunigen und die Tumorpenetranz in vivo zu ^erhöhen6.

NB stammt aus der sympathoadrenalen Linie der Neuralleistenzellen und ist ein hochmetastasierender Krebs bei ^Kindern7. Es ist für 10% der pädiatrischen Krebstodesfälle ^{verantwortlich8}. Bei der Diagnose weit verbreitet metastasiert, kann NB klinisch als Tumore dargestellt werden, die hauptsächlich entlang der Kette der sympathischen Ganglien und des Nebennierenmarks von PSNS9,10 entstehen. Die MYCN-Amplifikation ist häufig mit schlechten Ergebnissen bei NB-Patienten ^{assoziiert11,12}. Darüber hinaus wurde LMO1 als kritisches NB-Suszeptibilitätsgen in Hochrisikofällen ^{identifiziert13,14}. Studien fanden heraus, dass die transgene Koexpression von MYCN und LMO1 im PSNS des Zebrafischmodells nicht nur ein früheres Auftreten von NB fördert, sondern auch eine weit verbreitete Metastasierung in den Geweben und Organen induziert, die Stellen ähneln, die häufig bei Patienten mit Hochrisiko-NB13 beobachtet werden. Vor kurzem wurde ein weiterer metastasierender Phänotyp von NB auch in einem neueren Zebrafischmodell von NB beobachtet, in dem sowohl MYCN als auch Lin28B, die für ein RNA-bindendes Protein kodieren, unter Kontrolle des dβh-Promotors ^{überexprimiert werden16}.

Der stabile transgene Ansatz bei Zebrafischen wird häufig verwendet, um zu untersuchen, ob die Überexpression eines Gens von Interesse zur normalen Entwicklung und Pathogenese der Krankheit beitragen ^könnte14,15. Diese Technik wurde erfolgreich eingesetzt, um die Bedeutung mehrerer Gene und Wege für die NB-Tumorgenese zu demonstrieren6,16,17,18,19,20. In diesem Beitrag wird vorgestellt, wie die transgene Fischlinie, die sowohl MYCN als auch LMO1 im PSNS überexprimiert, geschaffen wurde und wie gezeigt wurde, dass die Zusammenarbeit dieser beiden Onkogene den Beginn der NB-Tumorgenese und -Metastasierung ^{beschleunigt13}. Erstens wurde die transgene Linie, die EGFP-MYCN unter Kontrolle des dβh-Promotors überexprimiert (als MYCN-Linie bezeichnet), durch Injektion des dβh-EGFP-MYCN-Konstrukts in einZellstadium von Wildtyp-AB-Embryonen entwickelt, wie zuvor ^{beschrieben6,17}. Eine separate transgene Linie, die LMO1 im PSNS überexprimiert (als LMO1-Linie bezeichnet), wurde entwickelt, indem zwei DNA-Konstrukte, dβh-LMO1 und dβh-mCherry, in WT-Embryonen im Einzellstadium koprojiziert ^wurden13. Es wurde bereits gezeigt, dass koinjizierte Doppel-DNA-Konstrukte in das Fischgenom kointegriert werden können; Daher werden LMO1 und mCherry in den PSNS-Zellen der transgenen Tiere koexprimiert. Sobald die injizierten F0-Embryonen die Geschlechtsreife erreicht hatten, wurden sie dann mit WT-Fischen ausgekreuzt, um positive Fische mit Transgenintegration zu identifizieren. Kurz gesagt, die F1-Nachkommen wurden zuerst durch Fluoreszenzmikroskopie auf mCherry-Expression in den PSNS-Zellen untersucht. Die Keimbahnintegration von LMO1 in mCherry-positiven Fischen wurde durch genomische PCR und Sequenzierung weiter bestätigt. Nach erfolgreicher Identifizierung jeder transgenen Linie wurden die Nachkommen heterozygoter MYCN- und LMO1-transgener Fische miteinander verpaart, um eine zusammengesetzte Fischschnur zu erzeugen, die sowohl MYCN als auch LMO1 (als MYCN bezeichnet; LMO1-Linie). Tumortragendes MYCN; LMO1-Fische wurden alle zwei Wochen mittels Fluoreszenzmikroskopie auf hinweise auf metastasierende Tumore in den Regionen überwacht, die vom primären Ort, der Interrenaldrüsenregion (IRG, Zebrafischäquivalent der menschlichen Nebenniere) entfernt ^sind13. Um die Metastasierung von Tumoren in MYCN zu bestätigen; LMO1 Fisch,histologische und immunhistochemische Analysen wurden angewendet.

Protokoll

Alle Forschungsmethoden mit Zebrafisch und Tierpflege / -pflege wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien der Mayo Clinic durchgeführt.

1. Vorbereitung und Mikroinjektion von Transgenkonstrukten für die Entwicklung der transgenen LMO1-Zebrafischlinie mit Überexpression in PSNS

1. Um den LMO1-pDONR221-Eingangsklon zu entwickeln, verstärken Sie die kodierende Region des menschlichen LMO1 aus cDNA, die aus der menschlichen Zelllinie mithilfe der PCR gewonnen wird.
   1. Führen Sie eine 25-μL-Reaktion durch, wie hier beschrieben: 2,5 μL 10x Standard-Taq-Reaktionspuffer, 0,125 μL Taq-DNA-Polymerase, 0,5 μL 10 mM dNTPs, 2 μL cDNA-Vorlage, 0,5 μL 10 μM Forward LMO1 ATTB1 Primer, 0,5 μL 10 μM Reverse LMO1 ATTB2 Primer und 18,875 μL Wasser.
      HINWEIS: Verwenden Sie vorwärts LMO1 ATTB1 Primer: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACAC-3'.
      CATGATGGTGCTGGACAAGGAGGA-3' und Reverse LMO1 ATTB2 Primer: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACT
      GAACTTGGGATTCAAAGGT-3'
   2. Verstärken Sie mit dem folgenden Programm: 1 Zyklus von 94 °C, 2 min; gefolgt von 30 Zyklen von (94 °C, 30 s, 55 °C, 30 s, 72 °C, 1 min) und 72 °C, 7 min.
2. Klon des LMO1-PCR-Produkts in den pDONR221-Gateway-Donorvektor durch BP-Rekombinase-Reaktion6,13 (PCR-Fragment + Donorvektor = Entry Clone).
   1. Für eine 10-μL-Reaktion mischen Sie 1 μL gereinigtes LMO1-PCR-Produkt (150 ng /μL), 1 μL (150 ng/μL) pDONR221-Donorvektor und 6 μL TE-Puffer (pH 8,0) mit 2 μL BP-Enzymmischung, inkubieren Sie für 1 h bei 25 °C und wandeln Sie es unter Verwendung des Herstellerprotokolls in TOP10-kompetente E. coli um.
   2. Als nächstes 50-200 μL aus der Umwandlungsflasche auf einer Luria Bouillon (LB) Agarplatte mit 50 μg/ml Kanamycin verteilen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
   3. Wählen Sie Klone aus, indem Sie eine einzelne Kolonie in 2-5 ml LB mit 50 μg/ml Kanamycin impfen und über Nacht (16-18 h) bei 37 °C kultivieren.
   4. Verwenden Sie 2 ml Bakterienkultur über Nacht zur Plasmidisolierung gemäß dem Protokoll des Herstellers. Um das LMO1-Plasmid zu überprüfen, senden Sie die Plasmidprobe zur Sequenzierung mit M13-F-Primer (5- GTAAAACGACGGCCAG-3') aus.
3. Um einen dβh-pDONRP4-P1R-Eintragsklon zu erzeugen, erhält man das dβh-PCR-Produkt6,13 durch Amplifikation der 5,2-kb-Promotorregion unter Verwendung des CH211-270H11 BAC-Klons als Vorlage zur Herstellung einer 20-μL-Reaktion, wie zuvor in Schritt 1.1.1 beschrieben. Verwenden Sie die folgenden PCR-Programmparameter: 94 °C, 2 min; 10 Zyklen von 94 °C, 15 s, 50 °C, 30 s, 68 °C, 8 min; 30 Zyklen von 94 °C, 15 s, 53 °C, 30 s, 68 °C, 8 min; 68 °C, 4 min (mit Vorwärtsprimer 5'GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTC
   CCCCTTTTTAGG-3' und Reverse Primer 5'-GGGGACTGCTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTG
   TCGTCTTTTGA-3').
   HINWEIS: Aufgrund der langen DNA-Templates in diesem Schritt sollten Sie die Verwendung eines geeigneten PCR-Systems für eine genaue PCR-Amplifikation sicherstellen.
4. Klonen Sie das dβh-PCR-Produkt in den pDONRP4-P1R-Gateway-Donorvektor durch BP-Rekombinase-Reaktion6,13 (PCR-Fragment + Donorvektor = Entry Clone).
   1. Mischen Sie 1 μL gereinigtes dβh PCR-Produkt (172 ng /uL), 1 μL (150 ng/μL) pDONRP4-P1R-Donorvektor und 6 μL TE-Puffer (pH 8,0) mit 2 μL BP-Enzymmischung in einer Gesamtreaktion von 10 μL, inkubieren Sie für 1 h bei 25 °C.
   2. Verwandeln Sie sich in TOP10 kompetente E. coli gemäß dem Protokoll des Herstellers. Isolieren Sie das Plasmid wie in den Schritten 1.2.2-1.2.4 beschrieben und verifizieren Sie das Plasmid durch Sequenzierung mit M13-F (5'-GTAAAACGACGGCCAG-3') und M13-R (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3') Primern.
5. Generieren Sie das dβh:LMO1-Ausdruckskonstrukt .
   1. Kombinieren Sie 1 μL jedes Eintragsklons (dβh-pDONRP4-P1R, LMO1-pDONR221 und p3E-polyA11) (je 20 Fmol), 1 μL (60 ng/μL) modifizierten Zielvektors mit I-SceI-Erkennungsstellen und 4 μL TE-Puffer (pH 8,0), der 2 μL der LR-Rekombinase-Enzymmischung enthält. Diese Mischung für 1 h bei 25 °C inkubieren.
   2. Wandeln Sie Bakterien nach dem Protokoll des Herstellers in chemisch kompetente TOP10 E. coli um. Isolieren Sie das Plasmid wie in den Schritten 1.2.2-1.2.4 beschrieben und verifizieren Sie das Plasmid durch Sequenzierung mit DBH Forward (5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTG-3') und LMO1 (5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA-3') Primern.
6. Generieren Sie dβh:mCherry DNA-Konstrukt mit einem Gateway-System, indem Sie Eingangsklone eines 5,2-kb-dβh-Promotors, pME-mCherry und p3E-polyA in den modifizierten Zielvektor kombinieren, der I-SceI-Erkennungsstellen enthält, wie zuvor in Schritt 1.5.16 erwähnt. Isolieren Sie das Plasmid wie in den Schritten 1.2.2-1.2.4 beschrieben und verifizieren Sie das Plasmid durch Sequenzierung mit DBH Forward Primer (5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTG-3').
7. Linearisieren Sie dβh: LMO1 DNA-Konstrukt und dβh: mCherry DNA-Konstrukt (im Verhältnis 3: 1) in einem Gesamtreaktionsvolumen von 15 μL mit 1 μL I-SceI-Enzym (5 U / μL) und 0,75 μL Puffer (10x) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für mindestens 4 h oder über Nacht. Stellen Sie sicher, dass die DNA-Konzentration 750 ng in der Reaktion nicht überschreitet.
8. Am nächsten Tag und nach der Linearisierung der Konstrukte werden 0,5 μL frisches I-SceI-Enzym (5 U / μL) und 0,5 μL 0,5% Phenolrot in 5 μL Gesamt-DNA-Mischung aus dem vorherigen Schritt von 1,7 gegeben. Mikroinjizieren Sie die Gesamtlösung (von 50-80 pg linearisierter DNA) in Wildtyp-AB-Embryonen im Einzelzellstadium (und bis zu 500 Embryonen) mit einer Glasmikropipettenadel mit einem Durchmesser von 1,0 mm, wie zuvor ^{beschrieben17}. Lagern Sie die restliche DNA-Mischung bei -20 °C für zukünftige Injektionen.

2. Screening und Verifizierung der transgenen LMO1-Fischschnur auf Keimbahnübertragung von LMO1 und mCherry

1. Nach 3-4 Tagen nach der Befruchtung (dpf) betäuben Sie injizierte Embryonen mit 0,02% Tricain und screenen sie auf fluoreszierende mCherry-Expression, die sich aufgrund der Mosaik-Transgenese überall im Fischkörper zeigt. mCherry-positive Embryonen in eine Petrischale mit frischem Eiwasser überführen und Embryonen gemäß ^{Zebrafischbuch21} zur Geschlechtsreife bringen.
   HINWEIS: Erwarten Sie, dass das Verhältnis von positivem Fisch je nach Fachwissen und Erfahrung des Forschungspersonals variiert. Zum Beispiel können beginnende Amateure eine niedrige Integrationsrate von 10% haben, verglichen mit einem Experten von ≥50%.
2. Um die Gründerfische mit dβh:LMO1 und dβh:mCherry Transgenen zu bestimmen, die in Keimzellen integriert sind, werden einzelne Paare von injizierten mCherry-positiven F0 geschlechtsgereiften Fischen aus dem vorherigen Schritt (2.1) mit WT AB-Fischen ausgekreuzt. Screenen Sie die F1-Generation auf mCherry-positive Embryonen bei 3-4 dpf.
3. Um zu bestätigen, dass die mCherry-positiven Fische LMO1-Transgen tragen, isolieren Sie die gDNA aus F1 mCherry-positivem Einzelembryo unter Verwendung des gDNA-Extraktionspuffers, der Folgendes enthält: 12,5 μL 4x Lysepuffer (500 μL 1 M Tris mit pH-Wert von 8,4, 2,5 ml 1 M Kaliumchlorid und 47 ml gereinigtes Wasser), 35 μL gereinigtes Wasser, und 2,5 μL Proteinase K bei 10 mg/ml. Inkubieren Sie die Probe für 16 h bei 55 °C, gefolgt von 10 min bei 98 °C.
4. Verwenden Sie die extrahierte gDNA (2 μL) als Vorlage für die genotypisierende PCR mit Primern: LMO1 FW: 5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA -3' und LMO1 RV: 5'-CGAAGGCTGGGATCAGCTTG -3', und das folgende PCR-Programm: 1 Zyklus von 94 °C, 10 min; 35 Zyklen von (94 °C für 30 s, 60 °C für 30 s; 68 °C, 30 s); und 68 °C für 7 min. Bestätigen Sie das amplifizierte 182 bp-Fragment durch Sequenzierung.
5. Nach Bestätigung des Genotyps die verbleibenden mCherry-positiven F1-Embryonen nach den Standardrichtlinien des Zebrafischbuches ^{zur Reife bringen21}. Flossenclip und Genotyp im Alter von 2-3 Monaten unter Verwendung der Schritte 2.3-2.4 aus dem obigen Protokoll, um die Integration des LMO1-Transgens in den Fisch weiter zu bestätigen.
   HINWEIS: Der LMO1-positive F1-Fisch ist der stabile transgene Fisch [Tg(dβh:LMO1),Tg(dβh:mCherry)] (bezeichnet als LMO1-Linie ).
6. Züchten Sie F1 LMO1 stabile transgene Fische mit WT-Fischen und wiederholen Sie sie nach Bedarf, um diese Linie zu vermehren.

3. Auskreuzung von LMO1 - und MYCN-transgenen Linien zur Erstellung eines metastatischen Modells

1. Sobald die transgene Zebrafischlinie LMO1 erzeugt ist, kreuzen Sie sich mit der MYCN-Linie6,17, um eine heterozygote transgene Fischlinie zu entwickeln, die sowohl MYCN als auch LMO1 überexprimiert.
2. Sortieren Sie bei 1 dpf die Nachkommen der Auskreuzung für die EGFP-Expression mit dem stereoskopischen Fluoreszenzmikroskop, das sich als EGFP-positive Punkte im Hinterhirnbereich präsentiert.
   HINWEIS: Alternativ, wenn nicht alle Embryonen für MYCN bei 1 dpf sortiert werden, heben Sie die Embryonen auf das Erwachsenenalter und den Genotyp durch Flossenschnitt und unter Verwendung der zuvor angegebenen Richtlinien aus den Schritten 2.3-2.4 für die gDNA-Isolierung und PCR-Genotypisierung mit Primern an: MYCN-F (5'-ATT CAC CAT CAC TGT GCG TCC-3'); MYCN-R (5'-TGC ATC CTC ACT CTC CAC GTA-3' und das folgende Programm mit Standard-Taq-Polymerase : 1 Zyklus von 94 °C für 3 min, 35 Zyklen von (94 °C für 30 s, 60 °C für 30 s und 68 °C für 3 min) und 68 °C für 7 min mit einer erwarteten Amplikongröße von 145 bp.
3. Nach der Sortierung nach EGFP bei 1 dpf isolieren Sie die gescreenten Embryonen in separate Petrischalen und kennzeichnen sie als: MYCN+ (EGFP-positiv) oder MYCN- (EGFP-negativ).
4. Bei 3-4 dpf werden Embryonen beider Gruppen (Schritt 3.3) für die LMO1-Expression mit einem stereoskopischen Fluoreszenzmikroskop visualisiert und sortiert. Suchen Sie nach rot fluoreszierender Proteinexpression als Flecken sowohl im oberen zervikalen Ganglion als auch in nicht-PSNS-dopaminergen neuronalen Zellen in der Kopfregion, insbesondere in oblongata medulla des Hinterhirns6,13.
   HINWEIS: Screening auf mCherry/LMO1, bevor die Embryonen 5 dpf erreichen, da sich luftgefüllte Schwimmblasen bis dahin vollständig entwickeln und die Embryonen zum Schwimmen bringen, was zu einer schwierigen mikroskopischen Fokussierung der PSNS-Zellen während des Sortiervorgangs führt.
5. Sobald die Sortierung abgeschlossen ist, isolieren Sie sortierte Fische in vier Gruppen verschiedener Genotypen und kennzeichnen Sie sie wie folgt. Züchten Sie die sortierten Fische unter identischen Bedingungen gemäß den Standardprotokollen aus dem ^{Zebrafischbuch21}.
   1. NUR MYCN (EGFP-positiv),
   2. Nur LMO1 (mCherry-positiv),
   3. MYCN; LMO1 (EGFP und mCherry doppelt positiv),
   4. WT (EGFP und mCherry doppelt negativ).

4. Tumorbelastung in transgenen Zebrafischlinien sichtbar machen

1. 4 Wochen nach der Befruchtung (wpf) sortierte Fische ab Schritt 3,5 mit 0,02% Tricain in einer Petrischale betäuben.
2. Visualisieren Sie Tumore mit einem stereoskopischen Fluoreszenzmikroskop, indem Sie Fische vorsichtig mit einem Metallspatel auf beide seitenseitigen Seiten drehen, um den Tumor zu sehen. Erwarten Sie, dass Tumore als einzelne EGFP-, einzelne mCherry- oder doppelte EGFP- und mCherry-positive Massen auftreten, die aus der Interrenaldrüsenregion (in der Nähe von Kopf und Niere) entstehen.
   HINWEIS: Es ist möglich, dass der anfängliche Tumorbeginn typischerweise mit einer helleren und größeren fluoreszenzpositiven Masse auf einer Seite der Interrenaldrüse präsentiert wird, weshalb es wichtig ist, beide Seiten von Fischen zu visualisieren, um einen frühen Tumorbeginn zu vermeiden.
3. Nach der Identifizierung der möglichen tumortragenden Fische isolieren Sie die Fische in einem separaten Tank mit entsprechenden Etiketten, die Geburtsdatum, Datum des Tumorscreenings und Genotyp enthalten.
4. Wiederholen Sie bei 6 wpf die vorherigen Schritte 4.1-4.3, um tumortragende Fische und nicht tumortragende Fische erneut zu screenen, um das Vorhandensein von Tumoren für zuvor gescreente tumortragende Fische zu bestätigen oder neue mögliche tumortragende Fische zu identifizieren. Suchen Sie nach anhaltender oder erhöhter Größe der fluoreszenzpositiven Masse in bestätigten tumortragenden Fischen.
5. Nachdem Sie tumortragende Fische identifiziert haben, überwachen Sie sie alle zwei Wochen auf Hinweise auf eine Tumorzellmigration, die sich als winzige EGFP- und / oder mCherry-positive Tumormassen weit vom primären Ort der Tumorgenese (interrenale Drüsenregion) präsentiert. Isolieren Sie diese Fische bei Bedarf in separaten Tanks und kennzeichnen Sie sie entsprechend, um mögliche Metastasen anzuzeigen.
6. Um die Metastasierung weiter zu bestätigen, verfolgen Sie diese Fische regelmäßig (alle zwei Wochen), bis die entfernten fluoreszenzpositiven Tumormassen eine deutlich vergrößerte Größe aufweisen, was auf das Wachstum von Tumoren in den metastatischen Stellen hinweist.

5. Gewebeaufbereitung und Paraffinschnitt von tumortragenden Fischen

HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt durch, um die spontan entwickelten primären und/oder metastasierenden Tumoren in MYCN und MYCN zu charakterisieren; LMO1 transgener Fisch.

1. Nach der Identifizierung und Überprüfung von tumortragenden Fischen opfern Sie Fische ab Schritt 4.6 in einer Petrischale, indem Sie Fische in 0,02% Tricain tauchen, um zuerst zu betäuben und dann die Tricaindosis zu erhöhen, bis der Fisch nicht mehr atmet. Schneiden Sie den Fisch in zwei Stücke - wobei ein Stück den Kopf und einen Teil des mittleren Teils des Körpers (einschließlich Tumor) enthält, und ein anderes Stück mit dem Rest des mittleren Teils und des Schwanzes des Fisches.
2. Fixieren Sie beide Fischabschnitte mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS für 1 h bei Raumtemperatur auf einer Wippe. Um die Fixationseffizienz zu verbessern, ersetzen Sie den Puffer durch frische 4% PFA, um die Penetranz zu den inneren Organen effektiv und schnell zu erhöhen. Lassen Sie den Fisch mit frischem Fixierpuffer über Nacht oder für 48 h bei 4 °C auf einer Wippe stehen.
   VORSICHT: PFA ist giftig. Da die Vorsichtsmaßnahmen und die ordnungsgemäße Entsorgung des Reagenzes von den Vorschriften Ihrer Institution abhängen, sollten Sie vor der Verwendung und Entsorgung des Reagenzes die richtigen Richtlinien einholen.
3. Vor der Verarbeitung die Probe(n) für 15-20 min bei Raumtemperatur in 100%ige Schnellentwerterlösung geben. Stellen Sie sicher, dass Sie einen Nichtmetallbehälter verwenden und die Probe(n) während der gesamten Inkubation überprüfen, um eine Überenkalkung zu verhindern. Wenn das Probengewebe stark abgebaut aussieht, legen Sie die Probe in Wasser oder bei 4 °C, um den Entkalkungsprozess zu verlangsamen.
4. Nach dem Fixieren und Entkalken die Fischproben 1 h lang mit fließendem Leitungswasser waschen und in prozessorische Kassette(n) legen. Wenn es mehr als ein Sample gibt, trennen Sie jedes in eine eigene Kassette.
5. Dehydrieren und bereiten Sie das Gewebe für die Paraffineinbettung vor, indem Sie Kassette(n) mit Fisch in den Gewebeprozessor geben, wo die Probe(n) zweimal in verschiedene Lösungen getaucht werden: 70% Ethanol (60 min, 40 °C), 85% Ethanol (50 min, 40 °C), 95% Ethanol (40 min, 40 °C) zweimal, 100% Ethanol (30 min, 40 °C), eine weitere frische Lösung von 100% Ethanol (50 min, 40 °C) zweimal, Xylol (30 min, 40 °C), eine weitere frische Lösung von Xylol (50 min, 40 °C), ein weiteres frisches Xylol (50 min, 45 °C), Paraffin (30 min, 45 °C), Paraffin (20 min, 58 °C) dreimal.
6. Nachdem das Gewebe verarbeitet wurde, entladen Sie die Kassette(n) aus der Prozessormaschine, während Sie die Organisation jeder Kassette beibehalten und sicherstellen, dass die Fischproben nicht vermischt werden.
7. Wählen Sie die geeignete Form basierend auf der Größe des Fisches und stellen Sie sicher, dass die Form in die gesamte Kassette mit der Fischprobe passt. Den Boden der Form bei 60 °C mit flüssigem Paraffin bedecken.
8. Legen Sie sofort die Kassette mit dem Fisch auf die Form (stellen Sie sicher, dass der Fisch für sagittale Abschnitte auf seiner flachen Seitenseite liegt) mit flüssigem Paraffin und füllen Sie ihn mit Paraffin an der Oberseite der Form ab, um den Fisch vollständig einzubetten.
9. Legen Sie die fertige Form auf die kalte Platte des Schneidens mikrotoms, bis das Paraffin gehärtet ist.
10. Sobald der Paraffinblock hart ist, was durch visuelle Beobachtung einer höheren Opazität und einer festen Berührung des Blocks beurteilt werden kann, entfernen Sie den Block vorsichtig aus der Form. Kratzen Sie überschüssiges Paraffin vorsichtig von den Seiten der Kassette ab.
11. Schneiden Sie die in Paraffin eingebetteten Fischblöcke sagittal bei 4 Mikrometern auf dem Mikrotom und schwimmen Sie die Abschnitte in einem Warmwasserbad bei 40 ° C mit destilliertem Wasser.
12. Die Abschnitte vorsichtig auf positiv geladene Objektträger überführen und vor dem Färben 30 min im Ofen bei 60 °C backen, bevor sie mit Schritt 6, 7 oder 8 fortfahren.

6. Hämatoxylin- und Eosin (H & E) -Färbung von Paraffinabschnitten zur Überprüfung der Pathologie

1. Legen Sie Dias mit Paraffinabschnitten aus Schritt 5.12 in einen Diahalter. In einem chemischen Abzug 3 mal, jeweils 5 min, mit Xylol entparaffinisieren. Entsorgen Sie die Lösung nach jedem Gebrauch.
2. Rehydrieren Sie Abschnitte mit 100% Ethanol für 3 min und wiederholen Sie zweimal mit frischem 100% Ethanol. Ersetzen Sie 100% Ethanol durch 95% Ethanol für 3 min und dann 80% Ethanol für 3 min.
3. Spülabschnitte mit destilliertem Wasser für 5 min. Während die Abschnitte in Wasser gewaschen werden, stellen Sie sicher, dass Sie oxidierte Partikel aus Hämatoxylin entfernen, indem Sie entweder die Oberfläche von Hämatoxylin filtern oder mit einem fusselfreien Wisch abschöpfen.
4. Tupfen Sie das überschüssige Wasser aus dem Objektträgerhalter mit fusselfreien professionellen Tüchern ab und färben Sie Rutschen in 50% Hämatoxylin (1: 1-Verdünnung mit destilliertem Wasser) für 2-5 min, abhängig von der gewünschten Färbepräferenz und der Verschlechterung des Reagenzes. Verwerfen Sie Hämatoxylin, wenn sich die Farbe der Lösung von Pflaume zu Blau / Braun ändert oder wenn die Färbezeit übermäßig wird. Spülen Sie die Rutschen 20 Min. mit fließendem Leitungswasser ab.
5. Entfärben Sie die Abschnitte in 1% saurem Ethanol (3,3 ml Salzsäure mit 50 ml 70 % Ethanol), indem Sie die Objektträger mehrmals schnell eintauchen. Dias können bis zu 3 s getaucht werden, aber je länger die Dias getaucht werden, desto heller werden die Abschnitte.
6. Spülen Sie die Rutschen zweimal für jeweils 1 min in Leitungswasser und einmal mit entionisiertem Wasser. Optional können Rutschen in diesem Stadium über Nacht in Wasser eingeweicht werden.
7. Tauchen Sie die Abschnitte für 3 s in 1,36% ige Lithiumcarbonatlösung (47 g Lithiumcarbonat, 3500 ml Wasser) ein. Achten Sie darauf, die Abschnitte nicht zu stark zu inkubieren, denn je länger die Zeit in der Lithiumcarbonatlösung ist, desto wahrscheinlicher ist es, dass das Gewebe schwimmt.
8. Spülen Sie die Abschnitte 5 Minuten lang in Leitungswasser ab und tupfen Sie das überschüssige Wasser mit fusselfreien professionellen Tüchern aus dem Schieberhalter.
9. Halten Sie die Objektträger in 100% gebrauchsfertigem Eosin für 15-30 s und dehydrieren Sie sofort mit 95% Ethanol zweimal für jeweils 5 min. Ersetzen Sie zweimal für jeweils 5 Minuten durch 100% Ethanol und verwerfen Sie die Lösungen nach jedem Gebrauch.
10. Reinigen Sie die Abschnitte in Xylol für 15 min und wiederholen Sie zweimal für insgesamt 3 Mal. Optional können die Rutschen über Nacht bei Raumtemperatur in Xylol belassen werden, um überschüssiges Wasser besser zu reinigen.
11. Lassen Sie die Objektträger im Chemikalienabzug an der Luft trocknen und montieren Sie dann einen Abdeckschlitten mit einem Montagemedium, um die Gewebeprobe zu versiegeln.
12. Visualisieren und bilden Sie die gefärbten Gewebeschnitte unter der Mikroskopie ab. Untersuchen Sie sorgfältig die Tumoren an der primären Stelle (die interrenale Drüsenregion in der Kopfniere) und die entfernten sporadischen Metastasen in anderen Geweben und Organen des Fisches. Versenden Sie gefärbte Objektträger für Gewebeschnitte, die von Pathologen überprüft werden sollen. Basierend auf den ähnlichen pathologischen Merkmalen des Fischmodells wie das menschliche Neuroblastom erwarten Sie die Tumore, die in MYCN-only oder MYCN entstanden sind; LMO1-Fisch wird erstmals von Pathologen als Neuroblastom diagnostiziert.

7. Immunhistochemische Analyse (IHC) mit Antikörpern gegen NB-Marker und überexprimierte Transgene zur weiteren Bestätigung der Ausbreitung des Tumors und ihrer sympathoadrenalen Abstammungseigenschaft

1. Färben mit vollautomatischem Färbesystem
   1. Um das IHC-Ergebnis besser mit dem der H&E-Färbung zu vergleichen, wählen Sie benachbarte Objektträger aus Schritt 5.12 für die IHC-Färbung aus.
      HINWEIS: Obwohl ein automatisiertes Färbesystem schnellere und weniger mühsame Ergebnisse ermöglicht, kann ein manuelles Protokoll für die IHC-Färbung in Ermangelung eines solchen verwendet werden, indem auf die Schritte von Unterabschnitt 7.2 verwiesen wird.
   2. Verdünnen Sie den primären Antikörper gegen Tyrosinhydroxylase (TH) (1:500), einen Neuroblastom-Marker, basierend auf der gewünschten Konzentration und der benötigten Gesamtmenge mit dem entsprechenden primären Antikörperverdünnungsmittel des automatisierten Systems.
      HINWEIS: Optimale Antikörperkonzentrationen können je nach Antikörper und Gewebe variieren.
   3. Da das automatisierte System den wärmeinduzierten Antigenabruf an Bord mit Epitop-Retrieval-Lösung für 20 minuten und das entsprechende Detektionsreagenz des Systems verwendet, stellen Sie sicher, dass die Parameter für die Maschine wie folgt eingestellt sind: Peroxidase-Blockierung, 5 min; Primärer Antikörper mit gewünschter Konzentration, 15 min; biotinylierter Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper (1:500), 8 min; Streptavidin HRP, 8 min; gemischtes DAB-Intensivsubstrat, 5 min; und Hematoxylin, 5 Min.
   4. Sobald die Einstellungen festgelegt sind, legen Sie das Antikörperfach in die Maschine. Richten Sie die Folien ein, indem Sie einen neuen Fall erstellen, der die Folien beschriftet. Die Maschine ist nun beladen und betriebsbereit (Entwachsen, Färben und Gegenschmutzen).
   5. Sobald die Objektträger mit der automatisierten Maschine entwachst, gebeizt und gegengefärbt sind, dehydrieren Sie die Objektträger in Ethanolgradienten von 70%, 95% und 100% für jeweils 5 Minuten. Rutschen von Abschnitten für 5 min wieder in 100% frisches Ethanol tauchen.
   6. Reinigen Sie die Abschnitte in Xylol für 5 min, zweimal, oder lassen Sie Folien in Xylol über Nacht, um überschüssiges Wasser besser zu reinigen.
   7. Lassen Sie die Schlitten im Chemikalienabzug an der Luft trocknen und montieren Sie dann einen Abdeckschluck mit einem Montagemedium. Visualisieren und bilden Sie die gefärbten Gewebeschnitte mit Mikroskopie ab.
   8. Um die Metastasierung im Fischmodell fest zu bestätigen, vergleichen Sie die Objektträger, die mit Antikörpern gegen Neuroblastommarker aus Schritt 7 gefärbt wurden, mit denen, die von H & E aus Schritt 6 gefärbt wurden.
      HINWEIS: Erwarten Sie eine positive Färbung für den Neuroblastom-Marker, TH, in allen Tumorzellen, die durch H & E-Färbung identifiziert wurden. Erwarten Sie auch keine positive Färbung für TH in benachbarten Geweben, in denen die metastasierenden Tumoren in LMO1 identifiziert wurden; MYCN Fisch. Stellen Sie sicher, dass Sie WT- und MYCN-only-Fische auswählen, die ein ähnliches Alter wie MYCN haben. LMO1 fischt für diese Analyse, um die Möglichkeit auszuschließen, dass es sich bei den metastasierten Tumoren um multifokale Primärtumoren handelt.
2. Manuelles Färben ohne automatisiertes IHC-Färbesystem
   1. Nachdem die Objektträger gebacken wurden, wählen Sie benachbarte Objektträger aus Schritt 5.12 aus, um einen besseren Vergleich zwischen H & E- und IHC-Färbung zu ermöglichen, um sie zu entparaffinisieren. In einem chemischen Abzug entwachsen und rehydrieren Sie die Objektträger mit Xylol unter Verwendung der vorherigen Schritte 6.1 bzw. 6.2.
   2. Nach der Deparaffinisierung und Rehydratation die Folien in endogener Peroxid-Blockierlösung (1x PBS mit 0,1% Natriumazid und 0,3% Wasserstoffperoxid) für 5 min bei Raumtemperatur einweichen. Folien in frischer 1x PBS für 3 min waschen und zweimal insgesamt 3 Mal wiederholen.
      VORSICHT: Natriumazid ist akut toxisch. Stellen Sie sicher, dass Sie Vorsorgeverfahren und eine ordnungsgemäße Entsorgung des Reagenzes in Abhängigkeit von den Vorschriften Ihrer Institution anwenden.
   3. Gewinnen Sie das Antigen durch Inkubation von Objektträgern in Lösung mit Proteinase K (1:500 in 1x PBS) für 10 min bei Raumtemperatur. Wäscherutschen 3 mal mit 1x PBS für jeweils 3 min.
   4. Blockieren Sie Objektträger durch Inkubation mit 5% Ziegenserum in 1x PBS für 30 min bei Raumtemperatur auf der Wippe. Folien mit frischer 1x PBS zweimal für jeweils 3 min waschen.
   5. 4 Tropfen Avidin-Blockierlösung direkt auf den Objektträger geben und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Nachdem Sie die Folien zweimal für jeweils 3 min mit frischen 1x PBS gewaschen haben, fügen Sie 4 Tropfen Biotin-Blocklösung hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 15 min.
   6. Nach dem Blockieren von Objektträgern 45-60 min bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C im primären Antikörper der Tyrosinhydroxylase (TH) (1:500) inkubieren.
      HINWEIS: Färbung mit zusätzlichen Antikörpern gegen Transgene und andere relevante Marker zur Behandlung der Physiologie und Aktivität von Primärtumoren und anderen metastasierenden Stellen. Die optimalen Antikörperkonzentrationen können je nach Antikörper und Gewebe variieren.
   7. Waschen Sie die Folien mit frischen 1x PBS für 3 min und wiederholen Sie sie zweimal mit insgesamt 3 Mal.
   8. Inkubation objektträger in sekundären Antikörpern von biotinyliertem Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper (1:500), verdünnt in Blocklösung für 45-60 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie den vorherigen Waschschritt 7.2.7.
   9. Fügen Sie HRP konjugiertes Avidin (1:300 in 1x PBS) hinzu und inkubieren Sie für 20 min bei Raumtemperatur. Folien 3 mal mit frischen 1x PBS für je 5 min waschen.
   10. Bereiten Sie 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) -Lösung (2,5 ml destilliertes Wasser, 1 Tropfen Kit-Puffer, 1 Tropfen Wasserstoffperoxid und 2 Tropfen DAB aus dem Kit) vor und geben Sie DAB-Tropfen direkt auf Objektträger in der Nähe eines Mikroskops. Beobachten Sie nach dem Hinzufügen von DAB die Farbänderungsreaktion auf den Objektträgern unter dem Mikroskop. Sobald die gewünschte Färbeintensität erreicht ist, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Schieberabschnitte in kaltes destilliertes Wasser legen.
   11. Halten Sie die Objektträger mit frischem 50% Hämatoxylin auf, indem Sie proben für einige Sekunden eintauchen oder tauchen und wieder in destilliertes Wasser geben. Wiederholen Sie dies nach Belieben, aber normalerweise sollte einmal ausreichen, da die Gewebeabschnitte dünn sind.
   12. Dehydrieren Sie Gewebeproben auf Objektträgern im Alkoholgradienten, wie zuvor in Schritt 7.1.5 beschrieben, und fahren Sie mit den verbleibenden Schritten fort (mit dem letzten Schritt als 7.1.8), um die IHC-Analyse abzuschließen.

8. Picrosirius-Rotfärbung von Paraffin-Objektträgern zur Kollagenakkumulation in Tumoren als Mechanismusstudie

1. Wiederholen Sie die Schritte 6.1-6.3, um Paraffinabschnitte auf Objektträgern zu entwachsen, zu hydratisieren und zu waschen.
2. Nachdem Sie das überschüssige Wasser aus dem Objektträgerhalter mit professionellen fusselfreien Tüchern abgewischt haben, färben Sie 50% Hämatoxylin für 10 Minuten ein. Spülen Sie die Rutschen mit fließendem Leitungswasser für 10 min ab.
3. Die Objektträger in Picrosirius Red überführen und bei Raumtemperatur 1 h inkubieren.
4. Waschen Sie die Objektträger zweimal in angesäuertem Wasser (5 ml Eisessig in 1 l Leitungswasser oder destilliertem Wasser) und inkubieren Sie 5 minuten lang auf dem Shaker.
5. Dekantieren Sie zuerst das meiste Wasser von den Objektträgern, bevor Sie die Abschnitte auf den Objektträgern physisch schütteln und abtupfen, um so viel Wasser wie möglich zu entfernen.
6. Legen Sie die Folien schnell in drei Änderungen aus 100% Ethanol, um Paraffinabschnitte zu dehydrieren.
7. Wiederholen Sie die Schritte 6.10 und 6.11, um die Objektträger in Xylol zu löschen und die Probe zu montieren. Als nächstes bilden Sie mit einem zusammengesetzten Mikroskop, das mit einer Kamera ausgestattet ist.
8. Zählen Sie mit ImageJ die rot-positiven Kollagenfasern des Picrosirius in mindestens drei zufälligen Feldern für jeden Abschnitt. Vergleichen Sie zwischen Folien von MYCN und MYCN; LMO1 Fischabschnitte.

Ergebnisse

Um festzustellen, ob LMO1 mit MYCN synergisiert, um die NB-Pathogenese zu beeinflussen, wurden transgene Konstrukte, die die Expression von entweder LMO1 (dβh:LMO1 und dβh:mCherry) oder MYCN (dβh:EGFP-MYCN) in den PSNS-Zellen unter Kontrolle des dβh-Promotors steuern, in Zebrafischembryonen ^injiziert13. Wie in Abbildung 1A dargestellt, wurden nach der Entwicklung stabiler transgener Linien und...

Diskussion

Zebrafisch wurde in den letzten Jahrzehnten häufig in der Forschung verwendet, insbesondere in der Krebsforschung, aus offensichtlichen Gründen, wie z.B. seiner Wartungsfreundlichkeit, robusten Reproduktion und klaren Vorteilen für die In-vivo-Bildgebung1,28. Das Zebrafischmodell kann aufgrund seiner äußeren Befruchtung und Entwicklung leicht embryonal manipuliert werden, was sich gut zu Säugetiermodellorganismen wie Ratten und Mäusen für groß a...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit	Vector	SK-4100
Acetic Acid	Fisher Scientific / Acros Organic	64-19-7
Agarose GP2	Midwest Scientific	009012-36-6
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody	Pel-Freez	P40101
Avidin/Biotin Blocking Kit	Vector	SP-2001
BOND Intense R Detection	Leica Biosystems	DS9263
BOND primary antibody diluent	Leica Biosystems Newcastle, Ltd.	AR9352
BOND-MAX IHC instrument	Leica Biosystems Newcastle, Ltd.	N/A	fully automated IHC staining system
CH211-270H11 BAC clone	BACPAC resources center (BRFC)	N/A
Compound microscope equipped with DP71 camera	Olympus	AX70
Cytoseal XYL (xylene based mounting medium)	Richard-Allan Scientific	8312-4
Eosin	Leica	3801601	ready-to-use (no preparation needed)
Ethanol	Carolina	86-1263
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
Gateway BP Clonase II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
Gateway LR Clonase II enzyme mix	Invitrogen, CA	11791-100
Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated)	Dako	E0432
Hematoxylin Solution, Harris Modified	Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC	HHS-32-1L
HRP Avidin D	Vector	A-2004
Hydrochloric Acid	Aqua Solutions	4360-1L
Hydrogen Peroxide, 3%	Fisher Scientific	H324-500
I-SceI enzyme	New England Biolabs, MA	R0694L
Kanamycin sulfate	Teknova, Inc.	K2150
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes	Fisher Scientific	34133
Lithium Carbonate	Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC	554-13-2
Microtome for sectioning	Leica Biosystems	RM2255
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404006
p3E-polyA	Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah	N/A	a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)
Parafin wax	Surgipath Paraplast	39603002	Parrafin to parafin
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	A11313
pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites)	Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany	N/A	a generous gift
pDONR 221 gateway donor vector	Thermo Fisher Scientific	12536-017
pDONRP4-P1R donor vector	Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah	N/A	a generous gift
Phenol red, 0.5%	Sigma Aldrich	P0290
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X	BioRad	1610780
Picrosirrius red stain kit	Polysciences	24901-250
pME-mCherry	Addgene	26028
Proteinase K, recombinant, PCR Grade	Roche	21712520
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
RDO Rapid Decalcifier	Apex Enginerring	RDO04
Sodium Azide (NaN3)	Sigma Aldrich	26628-22-8
Stereo fluorescence microscope	Leica	MZ10F
Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging	Nikon	SMZ-1500
Taq DNA Polymerase	New England Biolabs, MA	M0273L
Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor	Sakura	N/A	Model #: VIP-6-A1
Tricaine-S	Western Chemical Incorporated	20513
Xylene	Thermo Fisher Scientific	X3P1GAL