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要約

本稿では、神経芽細胞腫のゼブラフィッシュモデル、特に自発的に転移を発症する MYCN および LMO1の過剰発現を伴うトランスジェニックゼブラフィッシュ系統における腫瘍転移をリアルタイムで発生、特徴付け、および追跡する方法を紹介する。

要約

ゼブラフィッシュは、ヒトの疾患、特に癌を研究するための重要な動物モデルとして浮上している。ゼブラフィッシュのモデリングに適用される堅牢なトランスジェニックおよびゲノム編集技術に加えて、メンテナンスの容易さ、高収率の生産性、および強力なライブイメージングにより、ゼブラフィッシュは、このプロセスの根底にある転移および細胞および分子基盤をインビボで研究するための貴重なモデルシステムとなっています。転移の最初のゼブラフィッシュ神経芽細胞腫(NB)モデルは、ドーパミン-β-ヒドロキシラーゼ(dβh)プロモーターの制御下で、2つの癌遺伝子、MYCNおよびLMO1を過剰発現させることによって開発された。MYCNおよびLMO1を共発現させることは、神経芽細胞腫形成の潜伏期間の減少および浸透度の増加、ならびに腫瘍細胞の遠隔転移の加速をもたらした。この新しいモデルは、臨床的に関連する遺伝子改変および転移関連遺伝子改変の関与を含む、ヒト転移性NBの多くの重要な特徴を確実に繰り返している。インビボでの転移の自然および自発的な発生;転移の保存された部位。したがって、ゼブラフィッシュモデルは、インビボでの腫瘍転移の複雑なプロセスを解剖するユニークな利点を有する。

概要

ゼブラフィッシュは広く使用されており、特に癌において、いくつかの研究分野に適用されています。このモデルは、堅牢な再生、費用対効果の高いメンテナンス、腫瘍の成長と転移の汎用性の高い視覚化など、多くの利点を提供し、ゼブラフィッシュを腫瘍形成と転移の細胞および分子基盤を研究および調査するための強力なツールにします。大規模なゲノムマッピング、トランスジェネシス、遺伝子の過剰発現またはノックアウト、細胞移植、および化学スクリーニングのための新しい技術は、ゼブラフィッシュモデルの力を非常に増強しました1。過去数年間、白血病、黒色腫、横紋筋肉腫、肝細胞癌を含むがこれらに限定されない様々なヒト癌の腫瘍形成および転移を研究するために、多くのゼブラフィッシュ系統が開発されてきた2,3,4,5。さらに、神経芽細胞腫(NB)の最初のゼブラフィッシュモデルは、ドーパミン-β-ヒドロキシラーゼ(dβh)プロモーターの制御下で末梢交感神経系(PSNS)において癌遺伝子であるMYCNを過剰発現させることによって生成された。このモデルでは、活性化ALKがMYCNと相乗作用して腫瘍発症を加速し、vivoでの腫瘍浸透度を高めることができることがさらに実証されました6。

NBは神経堤細胞の交感神経副腎系譜に由来し、小児において転移性の高い癌である7。小児がん関連死の10%を占めています8。診断時に広く転移したNBは、主にPSNS9,10の交感神経節および副腎髄質の鎖に沿って起源とする腫瘍として臨床的に提示され得る。MYCN増幅は、NB患者における転帰不良と一般的に関連している11、12。さらに、LMO1は高リスク症例において重要なNB感受性遺伝子として同定されている13,14。ゼブラフィッシュモデルのPSNSにおけるMYCNとLMO1のトランスジェニック共発現は、NBの早期発症を促進するだけでなく、高リスクNB13患者で一般的に見られる部位に類似した組織および器官への広範な転移を誘導することも研究によって見出された。ごく最近、NBの新しいゼブラフィッシュモデルでもNBの別の転移表現型が観察されており、RNA結合タンパク質をコードするMYCNとLin28Bの両方がdβhプロモーターの制御下で過剰発現している16。

ゼブラフィッシュにおける安定したトランスジェニックアプローチは、目的の遺伝子の過剰発現が正常な発育および疾患の病因に寄与するかどうかを研究するためによく使用されます14,15。この技術は、NB腫瘍形成に対する複数の遺伝子および経路の重要性を実証するために首尾よく使用されている6、16、17、18、19、20。本稿では、PSNSにおいてMYCNとLMO1の両方を過剰発現するトランスジェニックフィッシュラインがどのように作られたのか、そしてこれら2つのがん遺伝子の協力がNB腫瘍形成と転移の発症を加速させることがどのように実証されたかを紹介します13。まず、dβhプロモーターの制御下でEGFP-MYCNを過剰発現するトランスジェニック株(MYCN株と命名)を、先に説明したように、dβh-EGFP-MYCN構築物を野生型(WT)AB胚の1細胞段階に注入することによって開発した6,17。PSNSでLMO1を過剰発現する別のトランスジェニック株(LMO1株と命名)は、2つのDNA構築物dβh-LMO1と dβh-mCherryをWT胚に1細胞段階で同時注入することによって開発された13。共注入された二重DNA構築物が魚のゲノムに共統合され得ることが以前に実証されている。したがって、LMO1およびmCherryは、トランスジェニック動物のPSNS細胞において共発現される。注入されたF0胚が性的成熟に達すると、それらはWT魚と交配され、導入遺伝子が組み込まれた陽性魚の同定が行われた。簡単に説明すると、F1の子孫を、PSNS細胞におけるmCherry発現について蛍光顕微鏡によって最初にスクリーニングした。mCherry陽性魚類におけるLMO1の生殖細胞系列の組み込みを、ゲノムPCRおよびシーケンシングによってさらに確認した。各トランスジェニック系統の同定に成功した後、ヘテロ接合型MYCNおよびLMO1トランスジェニック魚の子孫を交配して、MYCNおよびLMO1の両方を発現する複合魚系統(MYCNと命名;LMO1 行)。担癌性MYCN;LMO1魚類を隔週で蛍光顕微鏡によりモニターし、原発部位から離れた領域、腎間領域(IRG、ヒト副腎のゼブラフィッシュと同等)における転移性腫瘍の証拠について13。MYCNにおける腫瘍の転移を確認するために;LMO1魚類、組織学的および免疫組織化学的分析を適用した。

プロトコル

ゼブラフィッシュと動物のケア/メンテナンスを使用したすべての研究方法は、メイヨークリニックの施設ガイドラインに準拠して実施されました。

1. PSNSにおいて過剰発現を有する LMO1 トランスジェニックゼブラフィッシュ系統の開発のための導入遺伝子構築物の調製およびマイクロインジェクション

  1. LMO1-pDONR221エントリークローンを開発するには、PCRを用いてヒト細胞株から得られたcDNAからヒトLMO1のコード領域を増幅する。
    1. 10 標準 Taq 反応バッファー 2.5 μL、 Taq DNA ポリ メラーゼ 0.125 μL、10 mM dNTP 0.5 μL、cDNA テンプレート 2 μL、10 μM フォワード LMO1 ATTB1 プライマー 0.5 μL、10 μM 逆 LMO1 ATTB2 プライマー 0.5 μL 、および水 18.875 μL です。
      注: 前方 LMO1 ATTB1 プライマーを使用してください: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACAC-3'.
      CATGATGGTGCTGGACAAGGAGGA-3' および逆 LMO1 ATTB2 プライマー: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACT
      GAACTTGGGATTCAAAGGT-3'
    2. 以下のプログラムを用いて増幅する:94°Cの1サイクル、2分間;続いて(94°C、30秒、55°C、30秒、72°C、1分)および72°C、7分の30サイクルを行った。
  2. BPリコンビナーゼ反応6、13によりLMO1 PCR産物をpDONR221ゲートウェイドナーベクターにクローンする(PCRフラグメント+ドナーベクター=エントリークローン)。
    1. 10 μL の反応の場合、精製 LMO1 PCR 産物 (150 ng/μL)、1 μL (150 ng/μL) pDONR221 ドナーベクター、および 6 μL の TE バッファー (pH 8.0) と 2 μL の BP 酵素ミックスを混合し、25 °C で 1 時間インキュベートし、メーカーのプロトコールを使用して TOP10 コンピテント 大腸菌 に形質転換します。
    2. 次に、形質転換バイアルから50 μg/mLカナマイシンを含むルリアブロス(LB)寒天プレートに50〜200 μLを広げ、37°Cで一晩インキュベートします。
    3. 単一コロニーを2~5 mLのLBに50 μg/mLカナマイシンで接種し、37°Cで一晩(16~18時間)培養することによりクローンを選択します。
    4. メーカーのプロトコールに従ってプラスミド単離のために2mLの一晩細菌培養物を使用してください。LMO1プラスミドを検証するために、M13-Fプライマー(5-GTAAAAACGACGGCCAG-3')によるシークエンシングのためにプラスミドサンプルを送り出す。
  3. dβh-pDONRP4-P1Rエントリークローンを生成するには、CH211-270H11 BACクローンを鋳型として5.2-kbプロモータ領域を増幅してdβh PCR産物6,13を取得し、工程1.1.1で前述したように20 μL反応物を調製した。以下のPCRプログラムパラメータを使用してください:94°C、2分;94°C、15秒、50°C、30秒、68°C、8分間の10サイクル;94°C、15秒、53°C、30秒、68°C、8分間の30サイクル;68°C、4分間(フォワードプライマー5'GGGGACAACTTTATATAGAAAAGTTGGCGTACTCと併用)
    CCCCTTTTTAGG-3' および reverse primer 5'-GGGGACTGCTTTTTTTTACAAACTTGTGTTGCTTTG
    TCGTCTTTTGA-3')。
    注: このステップでは DNA テンプレートが長いため、正確な PCR 増幅のために適切な PCR システムを使用してください。
  4. BPリコンビナーゼ反応6,13によりdβhPCR産物をpDONRP4-P1Rゲートウェイドナーベクターにクローン化(PCRフラグメント+ドナーベクター=エントリークローン)する。
    1. 精製 dβh PCR 産物 (172 ng/uL) 1 μL、pDONRP4-P1R ドナーベクター 1 μL (150 ng/μL)、および 6 μL の TE バッファー (pH 8.0) と 2 μL の BP 酵素ミックスを合計 10 μL の反応で混合し、25 °C で 1 時間インキュベートします。
    2. 製造業者のプロトコールに従ってTOP10有能な 大腸菌 に変換する。ステップ1.2.2-1.2.4に記載されるようにプラスミドを単離し、M13-F(5'-GTAAAAACGACGGCCAG-3')およびM13-R(5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3')プライマーでシーケンシングすることによりプラスミドを検証します。
  5. dβh:LMO1 式コンストラクトを生成します。
    1. 各エントリークローン(dβh-pDONRP4-P1R、LMO1-pDONR221およびp3E-polyA11)(それぞれ20 fmole)、I-SceI認識部位を有する改変デスティネーションベクター1 μL(60 ng/μL)、および2 μLのLRリコンビナーゼ酵素ミックスを含む4 μLのTEバッファー(pH 8.0)を組み合わせる。この混合物を25°Cで1時間インキュベートする。
    2. 製造業者のプロトコールに従いながら、細菌を化学的に有能なTOP10大 腸菌に変換する。ステップ1.2.2-1.2.4に記載されるようにプラスミドを単離し、DBHフォワード(5'-GAAGCTGTCAGGGTTGTG-3')およびLMO1(5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA-3')プライマーでシーケンシングすることによりプラスミドを検証します。
  6. ステップ1.5.16で前述したように、I-SceI認識部位を含む修飾デスティネーションベクターに5.2kb dβhプロモーター、pME-mCherry、およびp3E-polyAのエントリークローンを組み合わせることにより、ゲートウェイシステムを使用してdβh:mCherry DNA構築物を生成します。ステップ1.2.2~1.2.4に記載のようにプラスミドを単離し、DBHフォワードプライマー(5'-GAAGCTGTCAGGGTTGTG-3')でシークエンシングすることによりプラスミドを検証します。
  7. dβh: LMO1 DNAコンストラクトおよび dβh:mCherry DNAコンストラクトを、1 μLのI-SceI酵素(5 U/μL)および0.75 μLの緩衝液(10倍)と共に合計15 μLの反応容量で(それぞれ3:1の比率で)線形化し、室温で最低4時間または一晩インキュベートする。反応においてDNA濃度が750ngを超えないようにしてください。
  8. 構築物の翌日および線状化後、0.5 μL の新鮮な I-SceI 酵素 (5 U/μL) および 0.5 μL の 0.5% フェノールレッドを、1.7 の前工程からの全 DNA 混合物 5 μL に加えます。前述のように直径1.0mmのガラス製マイクロピペット針を使用して、全溶液(50〜80pgの線状化DNAの)を1細胞段階の野生型AB胚(および最大500個の胚)にマイクロインジェクションする17。残りのDNA混合物を-20°Cで保存し、将来の注射に役立てる。

2. LMO1およびmCherryの生殖細胞系伝播のためのLMO1トランスジェニック魚系統をスクリーニングおよび検証する

  1. 受精後3〜4日(dpf)で、注入された胚に0.02%トリカインを麻酔し、モザイクトランスジェネシスのために魚の体全体のどこにでも現れる蛍光mCherry発現についてスクリーニングする。mCherry陽性胚を新鮮な卵水を入れたシャーレに移し、ゼブラフィッシュの本21に従って胚を性的成熟に引き上げる。
    注:陽性魚の割合は、研究担当者の専門知識と経験によって異なると予想されます。たとえば、初心者のアマチュアは、専門家の≥50%と比較して、10%の低統合率を持つことができます。
  2. 生殖細胞に組み込まれたdβh:LMO1およびdβh:mCherry導入遺伝子を有する創始魚を決定するために、前のステップ(2.1)から注入されたmCherry陽性F0性成熟魚の単一対をWT AB魚と交配する。mCherry陽性胚のF1世代を3〜4dpfでスクリーニングする。
  3. mCherry陽性魚が LMO1 導入遺伝子を保有していることを確認するために、12.5μLの4倍溶解緩衝液(pH8.4の1Mトリス500μL、1M塩化カリウム2.5mL、精製水47mL)、35μLの精製水を含むgDNA抽出緩衝液を用いて、F1 mCherry陽性単一胚からgDNAを単離し、 2.5 μLのプロテイナーゼKを10 mg/mLで投与した。サンプルを55°Cで16時間インキュベートし、続いて98°Cで10分間インキュベートした。
  4. 抽出したgDNA(2 μL)をプライマーを用いたジェノタイピングPCRの鋳型として用い、 LMO1 FW:5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA -3'および LMO1 RV:5'-CGAAGGCTGGGATCAGCTTG -3'、および以下のPCRプログラムを1サイクル、94°C、10分間;(30秒間に94°C、30秒間で60°C;68°C、30秒間);68°Cで7分間とした。増幅された182 bp断片をシーケンシングにより確認する。
  5. 遺伝子型の確認後、ゼブラフィッシュブック21の標準ガイドラインに従って残りのmCherry陽性F1胚を成熟まで上昇させる。上記のプロトコルのステップ2.3〜2.4を使用して、生後2〜3ヶ月でそれらをフィンクリップして遺伝子型決定し、魚における LMO1 導入遺伝子の統合をさらに確認する。
    注:LMO1陽性のF1魚は、安定したトランスジェニック魚[Tg(dβh:LMO1),Tg(dβh:mCherry)](LMO1ラインとして指定)となる。
  6. F1 LMO1 安定トランスジェニック魚をWT魚と交配させ、必要に応じてこの系統を繁殖させるために繰り返す。

3. 転移モデルを作成するための LMO1 および MYCN トランスジェニックラインのアウトクロス

  1. LMO1トランスジェニックゼブラフィッシュ系統が生成されると、MYCNライン6、17と交配して、MYCNおよびLMO1の両方を過剰発現するヘテロ接合型トランスジェニック魚系統を発達させる。
  2. 1dpfで、後脳領域にEGFP陽性点として提示する実体蛍光顕微鏡を用いてEGFP発現のためのアウトクロスの子孫をソートする。
    注:あるいは、すべての胚が1 dpfでMYCN用に選別されていない場合は、フィンクリッピングによって胚を成体および遺伝子型に引き上げ、プライマー:MYCN-F(5'-ATT CAC CAT CAC TGT GCG TCC-3')を用いて、gDNA単離およびPCR遺伝子型のためのステップ2.3〜2.4から以前に述べられたガイドラインを使用する。MYCN−R(5'−TGC ATC CTCアクトCTC CAC GTA−3'、および標準Taqポリメラーゼによる以下のプログラム:94°Cで3分間の1サイクル、30秒間の94°C、30秒間の60°C、および3分間の68°Cの3分間)、および145bpの予想アンプリコンサイズを有する68°Cの7分間の35サイクル。
  3. 1dpfでEGFPを選別した後、スクリーニングした胚を別々のペトリ皿に単離し、ディッシュをMYCN+(EGFP陽性)またはMYCN-(EGFP陰性)としてラベル付けする。
  4. 3~4dpfで、両群の胚を可視化し、LMO1発現について実体蛍光顕微鏡で可視化する(ステップ3.3)。頭部領域、特に後脳の延髄質における上頸部神経節および非PSNSドーパミン作動性神経細胞の両方の斑点として赤色蛍光タンパク質発現を探してください6,13。
    注:胚が5 dpfに達する前にmCherry / LMO1のスクリーニングは、空気で満たされた水泳膀胱がそれまでに完全に発達し、胚を浮遊させ、選別プロセス中にPSNS細胞の顕微鏡的焦点を合わせることが困難になるためである。
  5. 選別が完了したら、選別した魚を遺伝子型の異なる4つのグループに分離し、以下のようにラベルを付けます。ゼブラフィッシュの本21からの標準的なプロトコルに従って、同じ条件で選別された魚を育てます。
    1. MYCNのみ(EGFP陽性)、
    2. LMO1のみ(mチェリー陽性)、
    3. MYCN; LMO1( EGFPとmCherryのダブルポジティブ)、
    4. WT(EGFPおよびmCherryダブルネガティブ)。

4. トランスジェニックゼブラフィッシュ系統における腫瘍量の可視化

  1. 受精後4週間(wpf)で、ステップ3.5から選別した魚をシャーレ中の0.02%トリカインで麻酔する。
  2. 金属ヘラの入った魚を両側にそっとひっくり返して実体蛍光顕微鏡で腫瘍を可視化し、腫瘍を表示します。腫瘍は、腎間領域(頭部および腎臓の近く)から生じる単一のEGFP-、単一のmCherry-、または二重のEGFPおよびmCherry陽性塊として存在すると予想される。
    注:初期腫瘍発症は、通常、腎間腺の片側に明るくより大きな蛍光陽性塊を提示する可能性があるため、早期腫瘍発症を見逃さないようにするために、魚の両側を視覚化することが極めて重要である。
  3. 可能性のある担癌魚を同定した後、生年月日、腫瘍スクリーニング日、および遺伝子型を含む適切なラベルで魚を別のタンクに分離する。
  4. 6 wpfで、前のステップ4.1〜4.3を繰り返して、担がん魚および非担がん魚を再度スクリーニングし、以前にスクリーニングした担がん魚の腫瘍の存在を確認するか、または新しい担がん魚を同定する。確認された担癌魚の蛍光陽性塊の持続的または増加したサイズを探します。
  5. 担癌魚を同定した後、腫瘍発生の原発部位(腎間領域)から遠く離れた小さなEGFPおよび/またはmCherry陽性腫瘍塊として現れる腫瘍細胞遊走の証拠について隔週でそれらを監視します。必要に応じてこれらの魚を別々のタンクに隔離し、転移の可能性を示すために適切にラベルを付けます。
  6. 転移をさらに確認するために、遠隔の蛍光陽性腫瘍塊が明らかに増加したサイズを示し、転移部位における腫瘍の成長を示すまで、これらの魚を定期的に(2週間ごとに)追跡し続ける。

5. 担癌魚の組織処理とパラフィン切片化

注: MYCNおよびMYCNにおける自発的に発達した原発性および/または転移性腫瘍を特徴付けるためにこのステップを実行する。LMO1 トランスジェニック魚。

  1. 担癌魚の同定および検証後、ペトリ皿のステップ4.6から魚を犠牲にして、魚を0.02%トリカインに沈めて最初に麻酔し、次に魚が呼吸しなくなるまでトリカイン投与量を増加させる。魚を2つに切る - 1つの部分が頭と体の中央部分(腫瘍を含む)を含み、もう1つの部分が魚の中央部分と尾の残りの部分を含む。
  2. ロッカー上で室温で1時間、1x PBS中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)で両方の魚のセクションを固定します。固定効率を高めるには、バッファーを新鮮な4%PFAに置き換えて、内臓への浸透度を効果的かつ迅速に高めます。新鮮な固定バッファーで魚をロッカーに一晩または48時間放置する。
    注意: PFA は有毒です。試薬の予防措置や適切な廃棄方法は、所属機関の規制により異なるため、試薬の使用や廃棄を行う前に、適切なガイドラインを求めてください。
  3. 処理の前に、サンプルを100%急速脱灰器溶液に室温で15〜20分間入れます。必ず非金属容器を使用し、インキュベーション中にサンプルをチェックして、過度の脱灰を防止してください。サンプル組織がひどく劣化しているように見える場合は、サンプルを水または4°Cに置いて脱灰プロセスを遅くします。
  4. 固定して脱灰したら、魚のサンプルを水道水で1時間洗浄し、プロセッサカセットに入れます。複数のサンプルがある場合は、それぞれを独自のカセットに分けます。
  5. 70%エタノール(60分、40°C)、85%エタノール(50分、40°C)、95%エタノール(40分、40°C)を2回、100%エタノール(30分、40°C)、100%エタノール(30分、40°C)、100%エタノール(50分、50分、50分、 40°C)を2回、キシレン(30分、40°C)、別の新鮮なキシレンの溶液(50分、40°C)、別の新鮮なキシレン(50分、45°C)、パラフィン(30分、45°C)、パラフィン(20分、58°C)を3回。
  6. 組織が処理されたら、各カセットの組織を維持し、魚のサンプルが混ざらないようにしながら、プロセッサマシンからカセットをアンロードします。
  7. 魚のサイズに基づいて適切なサイズの型を選択し、カセット全体が魚のサンプルに収まることを確認します。金型の底部を60°Cで流動パラフィンで覆う。
  8. すぐに流動パラフィンで魚をカビの上に置き(矢状部のために魚が平らな横側に置かれていることを確認してください)、そしてパラフィンで型の上部に詰め終えて魚を完全に埋めます。
  9. 完成した金型を、パラフィンが硬化するまで切片ミクロトームのコールドプレート上に置きます。
  10. パラフィンブロックが硬くなったら、不透明度が高く、ブロックにしっかりと触れていることを目視で観察することで判断できますが、ブロックを金型から静かに取り外します。カセットの側面から余分なパラフィンを慎重にこすり落とします。
  11. パラフィン包埋魚をミクロトーム上で4ミクロンで射手方向にブロックして切片化し、その切片を蒸留水を含む40°Cの温水浴上に浮かべる。
  12. 切片を正に帯電したスライドに慎重に移し、染色する前に60°Cのオーブンで30分間焼いてから、ステップ6、7、または8に進みます。

6. 病理レビューのためのパラフィン切片のヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色

  1. 手順 5.12 で説明したパラフィンセクションを含むスライドをスライドホルダーに入れます。化学ヒュームフードの内側で、キシレンで3回、それぞれ5分間脱パラフィンする。使用後は溶液を廃棄してください。
  2. 切片を100%エタノールで3分間リハイドレートし、新鮮な100%エタノールで2回繰り返す。100%エタノールを95%エタノールで3分間交換し、次いで80%エタノールを3分間交換する。
  3. 切片を蒸留水で5分間すすいでください。切片を水で洗浄している間、ヘマトキシリンの表面をろ過またはスキミングして、糸くずの出ない拭き取りでヘマトキシリンから酸化粒子を除去してください。
  4. スライドホルダーから余分な水を糸くずの出ないプロフェッショナルグレードのワイプで拭き取り、所望の染色の好みと試薬の劣化に応じて、スライドを50%ヘマトキシリン(蒸留水で1:1希釈)で2〜5分間染色します。ヘマトキシリンは、溶液の色が梅色から青褐色に変化した場合や、染色時間が長引く場合は廃棄してください。スライドを水道水の流水で20分間すすいでください。
  5. スライドを素早く複数回浸漬することにより、切片を1%酸性エタノール(3.3mL塩酸と50mLの70%エタノール)に脱色する。スライドは最大 3 秒まで浸漬できますが、スライドを長く浸漬するほど、セクションは明るくなります。
  6. スライドを水道水で2回ずつ1分間、脱イオン水で1回すすいでください。オプションとして、スライドはこの段階で一晩放置し、水に浸すことができます。
  7. 切片を1.36%炭酸リチウム溶液(炭酸リチウム47g、水3500mL)に3秒間浸漬する。炭酸リチウム溶液中での時間が長ければ長いほど、組織が浮遊する可能性が高くなるため、切片を過剰にインキュベートしないようにしてください。
  8. 水道水で5分間セクションをすすぎ、スライドホルダーから余分な水を糸くずの出ないプロフェッショナルグレードのワイプで拭き取ります。
  9. スライドを100%すぐに使用できるエオジンで15〜30秒間対比染色し、直ちに95%エタノールで2回ずつ5分間脱水する。100%エタノールと交換し、それぞれ5分間ずつ2回、各使用後に溶液を廃棄する。
  10. キシレンで切片を15分間クリアし、合計3回2回繰り返します。任意選択で、スライドを室温で一晩キシレン中に放置して、過剰な水をよりよく透明にすることができます。
  11. スライドを化学ヒュームフード内で風乾させ、マウント媒体を使用してカバースリップを取り付けて組織サンプルを密封します。
  12. 顕微鏡下で染色された組織切片を視覚化および画像化する。原発部位(頭部腎臓の腎間領域)の腫瘍と、魚の他の組織や器官の遠くの散発的な転移を注意深く調べてください。病理学者がレビューする組織切片のために染色されたスライドを送ってください。ヒト神経芽細胞腫に対する魚モデルの類似の病理学的特徴に基づいて、MYCNのみまたは MYCNで生じた腫瘍を期待する 。LMO1 魚は病理学者によって最初に神経芽細胞腫と診断される。

7. NBマーカーおよび過剰発現導入遺伝子に対する抗体を用いた免疫組織化学的解析(IHC)により、腫瘍の広がりとその交感神経副腎系譜特性をさらに確認

  1. 全自動染色システムによる染色
    1. IHCの結果をH&E染色の結果とよりよく比較するには、ステップ5.12からIHC染色の隣接するスライドを選択します。
      注:自動染色システムは、より迅速で手間のかからない結果を可能にしますが、IHC染色のための手動プロトコルは、サブセクション7.2のステップを参照することによって、そのようなものがない場合は使用することができます。
    2. 神経芽細胞腫マーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ(TH)に対する一次抗体(1:500)を、所望の濃度および必要な総量に基づいて、自動化システムの対応する一次抗体希釈剤で希釈する。
      注:最適な抗体濃度は、抗体および組織によって異なる場合があります。
    3. 自動システムは、エピトープ検索溶液とシステムの対応する検出試薬を備えたオンボード熱誘導抗原検索を20分間使用するため、機械のパラメータが次のように設定されていることを確認してください。所望の濃度の一次抗体、15分;ビオチン化抗ウサギIgG二次抗体(1:500)、8分;ストレプトアビジンHRP、8分;混合DAB強烈な基質、5分;ヘマトキシリン、5分間。
    4. 設定が完了したら、抗体トレイをマシンに入れます。スライドにラベルを付ける新しいケースを作成して、スライドを設定します。これで機械がロードされ、実行する準備が整いました(脱ろう、染色、およびカウンター染色)。
    5. 自動機械を使用してスライドを脱ろう、染色、および対比染色したら、スライドを70%、95%、および100%のエタノール勾配でそれぞれ5分間脱水します。切片のスライドを100%新鮮なエタノールに再び5分間沈める。
    6. 切片をキシレンで5分間、2回クリアするか、スライドをキシレン中に一晩放置して、余分な水をよりよくクリアします。
    7. スライドを化学ヒュームフード内で風乾させてから、マウント媒体を使用してカバースリップを取り付けます。顕微鏡で染色された組織切片を視覚化および画像化する。
    8. 魚類モデルにおける転移をしっかりと確認するために、ステップ7から神経芽細胞腫マーカーに対する抗体で染色されたスライドと、ステップ6からH&Eによって染色されたスライドを比較する。
      注:H&E染色によって同定されたすべての腫瘍細胞において、神経芽細胞腫マーカーTHの陽性染色が見られることを期待してください。また、転移性腫瘍がLMO1で同定された隣接組織におけるTHの陽性染色は期待されない 。MYCNの 魚。MYCNと年齢が似ているコントロールWTと MYCNのみの魚を選択してください 。LMO1 魚は、転移性腫瘍が多巣性原発巣腫瘍である可能性を排除するためにこの分析を行った。
  2. 自動IHC染色システムなしでの手動染色
    1. スライドをベイクした後、ステップ5.12から隣接するスライドを選択して、H&E染色とIHC染色を比較してパラフィン除去できるようにします。化学ヒュームフード内で、スライドを脱ろうし、前のステップ6.1および6.2をそれぞれ使用してキシレンで再水和する。
    2. 脱パラフィンおよび再水和後、内因性過酸化物遮断溶液(0.1%アジ化ナトリウムおよび0.3%過酸化水素を含む1x PBS)に室温で5分間スライドを浸す。スライドを新鮮な1x PBSで3分間洗浄し、合計3回2回繰り返します。
      警告:アジ化ナトリウムは急性毒性があります。予防措置と試薬の適切な廃棄は、教育機関の規制に応じて必ず実践してください。
    3. 溶液中のスライドをプロテイナーゼK(1x PBS中で1:500)と共に室温で10分間インキュベートすることによって抗原を取り出す。スライドを1x PBSで3回、それぞれ3分間洗浄します。
    4. ブロックスライドは、1x PBS中の5%ヤギ血清とともにロッカー上で室温で30分間インキュベートすることによって行われる。スライドを新鮮な1x PBSで2回、それぞれ3分間洗浄します。
    5. 4滴のアビジンブロッキング溶液をスライド上に直接加え、室温で15分間インキュベートする。新鮮な1x PBSでスライドをそれぞれ3分間2回洗浄した後、4滴のビオチンブロッキング溶液を加え、室温で15分間インキュベートする。
    6. スライドをブロッキングした後、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)の一次抗体(1:500)中で室温で45〜60分間、または4°Cで一晩インキュベートする。
      注:原発性腫瘍および他の転移部位の生理機能および活性に対処するために、導入遺伝子および他の関連マーカーに対する追加の抗体で染色する。最適な抗体濃度は、抗体および組織によって異なり得る。
    7. スライドを新鮮な1x PBSで3分間洗浄し、合計3回で2回繰り返します。
    8. ブロッキング溶液で希釈したビオチン化抗ウサギIgG二次抗体(1:500)の二次抗体中のスライドを室温で45〜60分間インキュベートする。前の洗浄手順7.2.7を繰り返します。
    9. HRP結合アビジン(1x PBS中で1:300)を加え、室温で20分間インキュベートした。スライドを新鮮な1x PBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。
    10. 3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)溶液(蒸留水2.5mL、キットバッファー1滴、過酸化水素1滴、およびキットからのDAB2滴)を調製し、顕微鏡近くのスライド上にDAB滴を直接置きます。DABを添加した後、顕微鏡下でスライド上の変色反応を観察した。所望の染色強度に達したら、スライド切片を冷蒸留水に入れて反応を停止させる。
    11. 新鮮な50%ヘマトキシリンでスライドを対比染色するには、サンプルを数秒間浸漬または浸漬し、蒸留水に戻します。必要に応じて繰り返すが、通常は、組織切片が薄いので1回で十分であるべきである。
    12. ステップ7.1.5で前述したように、スライド上の組織サンプルをアルコール勾配で脱水し、残りのステップ(最後のステップを7.1.8として)を続行してIHC分析を終了します。

8. 腫瘍におけるコラーゲン蓄積のためのパラフィンスライドのピクロシリウス赤色染色をメカニズム研究として

  1. 手順6.1~6.3を繰り返して、スライド上のパラフィン部分を脱ろう、水和、洗浄します。
  2. スライドホルダーからの余分な水をプログレードの糸くずの出ないワイプで吸い取った後、50%ヘマトキシリンで10分間染めます。スライドを水道水の流し水で10分間すすいでください。
  3. スライドをピクロシリウスレッドに移し、室温で1時間インキュベートする。
  4. スライドを酸性水(1Lの蛇口または蒸留水に5mLの氷酢酸)で2回洗浄し、シェーカーで5分間インキュベートする。
  5. スライドからほとんどの水を最初にデカントしてから、スライド上の部分を物理的に振って吸い取り、できるだけ多くの水を除去します。
  6. スライドを100%エタノールの3つの変化に素早く入れて、パラフィンセクションを脱水します。
  7. 手順6.10と6.11を繰り返して、スライドをキシレンでクリアし、サンプルをマウントします。次に、カメラを搭載した複合顕微鏡による画像。
  8. ImageJを用いて、各切片について少なくとも3つのランダム視野におけるピクロシリウス赤陽性コラーゲン線維をカウントする。MYCNとMYCNのスライドを比較します;LMO1魚のセクション。

結果

LMO1がMYCNと相乗作用してNBの病因に影響を及ぼすかどうかを決定するために、dβhプロモーターの制御下にあるPSNS細胞におけるLMO1(dβh:LMO1およびdβh:mCherry)またはMYCN(dβh:EGFP-MYCN)のいずれかの発現を駆動するトランスジェニック構築物をゼブラフィッシュ胚に注入した13。 図1Aに例示されるように、安定...

ディスカッション

ゼブラフィッシュは、メンテナンスの容易さ、堅牢な再生、in vivoイメージングの明確な利点などの明白な理由から、過去数十年間、特にがん研究で一般的に使用されてきました1,28。ゼブラフィッシュモデルは、大規模な遺伝学的研究のために、ラットやマウスなどの哺乳類モデル生物をうまく補完する外部受精および発達のために、胚的に...

開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

この研究は、国立がん研究所からの助成金R01 CA240323(S.Z.)によって支援された。米国国防総省(DoD)からの助成金W81XWH-17-1-0498(S.Z.)。V Foundation for Cancer Research(S.Z.)のV奨学生賞とMayo Center for Biomedical Discovery(S.Z.)のプラットフォーム助成金。メイヨークリニックがんセンターと個別化医療センター(S.Z.)からの支援。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector KitVectorSK-4100
Acetic AcidFisher Scientific / Acros Organic64-19-7
Agarose GP2Midwest Scientific009012-36-6
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) AntibodyPel-FreezP40101
Avidin/Biotin Blocking KitVectorSP-2001
BOND Intense R DetectionLeica BiosystemsDS9263
BOND primary antibody diluentLeica Biosystems Newcastle, Ltd.AR9352
BOND-MAX IHC instrumentLeica Biosystems Newcastle, Ltd.N/Afully automated IHC staining system
CH211-270H11 BAC cloneBACPAC resources center (BRFC)N/A
Compound microscope equipped with DP71 cameraOlympusAX70
Cytoseal XYL (xylene based mounting medium)Richard-Allan Scientific8312-4
EosinLeica3801601ready-to-use (no preparation needed)
EthanolCarolina86-1263
Expand Long Template PCR SystemRoche Applied Science, IN11681834001
Gateway BP Clonase II enzyme mixInvitrogen, CA11789-020
Gateway LR Clonase II enzyme mixInvitrogen, CA11791-100
Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated)DakoE0432
Hematoxylin Solution, Harris ModifiedSigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFCHHS-32-1L
HRP Avidin DVectorA-2004
Hydrochloric AcidAqua Solutions4360-1L
Hydrogen Peroxide, 3%Fisher ScientificH324-500
I-SceI enzymeNew England Biolabs, MAR0694L
Kanamycin sulfateTeknova, Inc.K2150
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science KimwipesFisher Scientific34133
Lithium CarbonateSigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC554-13-2
Microtome for sectioningLeica BiosystemsRM2255
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coliInvitrogenC404006
p3E-polyA Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of UtahN/Aa generous gift
(Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)
Parafin waxSurgipath Paraplast39603002Parrafin to parafin
ParaformaldehydeAlfa AesarA11313
pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites)Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, GermanyN/Aa generous gift
pDONR 221 gateway donor vectorThermo Fisher Scientific12536-017
pDONRP4-P1R donor vector Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of UtahN/Aa generous gift
Phenol red, 0.5%Sigma Aldrich P0290
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10XBioRad1610780
Picrosirrius red stain kitPolysciences24901-250
pME-mCherryAddgene26028
Proteinase K, recombinant, PCR GradeRoche21712520
QIAprep Spin MiniPrep KitQiagen27104
RDO Rapid DecalcifierApex EnginerringRDO04
Sodium Azide (NaN3)Sigma Aldrich26628-22-8
Stereo fluorescence microscopeLeicaMZ10F
Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imagingNikonSMZ-1500
Taq DNA PolymeraseNew England Biolabs, MAM0273L
Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration ProcessorSakuraN/AModel #: VIP-6-A1
Tricaine-SWestern Chemical Incorporated20513
XyleneThermo Fisher ScientificX3P1GAL

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