신경 모세포종 전이의 제브라피시 모델

요약

본 논문은 신경모세포종의 제브라피시 모델에서 종양 전이를 실시간으로 개발, 특성화 및 추적하는 방법을 소개하며, 특히 MYCN 및 LMO1의 과발현을 가진 형질형 제브라피시 라인에서 자발적으로 전이를 발생시합니다.

초록

Zebrafish는 인간 질병, 특히 암을 연구하는 중요한 동물 모델로 부상했습니다. Zebrafish 모델링에 적용된 강력한 형질 전환 및 게놈 편집 기술과 함께 유지 보수의 용이성, 고수량 생산성 및 강력한 라이브 이미징은 모두 제브라피쉬를 생체 내에서 이 공정의 기초에 기초한 전이 및 세포 및 분자 기지를 연구하는 귀중한 모델 시스템으로 만듭니다. 전이의 첫번째 제1 제브라피시 신경모세포종 (NB) 모형은 도파민 베타-하이드록실라제 (dβh) 프로모터의 통제하에, 2개의 종양유전자, MYCN 및 LMO1를 과보로 해서 개발되었습니다. CO-표현 된 MYCN 및 LMO1 신경 모세포종 발생의 감소 된 대기 시간 및 증가 침투뿐만 아니라 종양 세포의 가속 먼 전이로 이어졌다. 이 새로운 모델은 임상적으로 관련되고 전이 연관된 유전 적 변경의 참여를 포함하여 인간 전이성 NB의 많은 주요 특징을 안정적으로 반복합니다. 생체 내에서 전이의 자연적이고 자발적인 발달; 전이의 보존 사이트. 따라서, 제브라피쉬 모델은 생체내에서 종양 전이의 복잡한 과정을 해부하는 독특한 장점을 갖는다.

서문

Zebrafish는 널리 사용되고 연구의 여러 영역에 적용되었습니다, 특히 암에서. 이 모델은 강력한 생식, 비용 효율적인 유지 보수 및 종양 성장 및 전이의 다목적 시각화와 같은 많은 이점을 제공하며, 이 중 제브라피쉬는 종양 발생 및 전이의 세포 및 분자 기지를 연구하고 조사할 수 있는 강력한 도구로 만듭니다. 대규모 게놈 매핑, 전염, 유전자 과발성 또는 녹아웃, 세포 이식 및 화학 스크린을 위한 새로운 기술은 제브라피시 모델¹의 힘을 대단히 증강시켰습니다. 지난 몇 년 동안, 많은 얼룩말 물고기 라인은 백혈병, 흑색종, rhabdomyosarcoma, 및 간세포 암에 국한되지 않는 다양한 인간 암의 종양 발생 및 전이를 연구하기 위하여 개발되었습니다^2,3,4,5. 또한, 신경모세포종(NB)의 제1 제1 제1 제보브라시모델은 도파민-베타-하이드록실라제(dβh) 프로모터를 통제하에 있는 말초 교감 신경계(PSNS)에서 종양유전자인 MYCN을 과발현함으로써 생성되었다. 이 모델로, 활성화된 ALK가 MYCN과 시너지 효과를 발휘하여 종양 발병을 가속화하고 생체내에서 종양 침투를 증가시킬 수 있음을 더욱 입증^되었다.

NB는 신경 문장 세포의 동감 계보에서 파생되고, 어린이의 고이성암^이다7. 그것은 소아암 관련 죽음의 10%를 책임집니다⁸. 진단에서 널리 전이되는, NB는 PSNS9,10의 교감 심정 및 부신 수질의 사슬을 따라 주로 유래하는 종양으로 임상적으로 제시될 수 있습니다. MYCN 증폭은 일반적으로 NB 환자에서 가난한 결과와 연관^11,12. 더욱이, LMO1은 고위험 케이스^13,14에서 중요한 NB 감수성 유전자로 확인되었습니다. 연구 결과는 제브라피시 모형의 PSNS에 있는 MYCN및 LMO1의 형질전환이 NB의 초기 개시를 승진시킬 뿐 아니라, 또한 고위험 NB13를 가진 환자에서 일반적으로 보인 사이트에 유사한 조직 및 기관에 광범위하게 전이를 유도한다는 것을 것을을 발견했습니다. 아주 최근에, NB의 또 다른 전이성 표현형은 또한 NB의 새로운 제브라피시 모형에서 관찰되고, MYCN과 Lin28B, RNA 결합 단백질을 인코딩하는, dβh ^promoter16의 통제하에 과발현되는.

제브라피시에 있는 안정한 형질 전환 접근법은 관심있는 유전자의 과발현이 일반적인 발달 및 질병 병인에 기여할 수 있었다는 것을 연구하기 위하여 수시로 이용됩니다^14,15. 이 기술은 성공적으로 NB 종양 발생에 여러 유전자와 경로의 중요성을 입증하기 위해 사용되었습니다6,16,17,18,19,20. 이 논문에서는 PSNS에서 MYCN과 LMO1을 과도하게 표현하는 형질전환선이 어떻게 만들어졌는지, 그리고 이 두 종양발생의 협력이 NB 종양발생과 전이의 발병을 가속화한다는 것이 어떻게 입증되었는지소개^합니다. 첫째, dβh 프로모터(지정된 MYCN 라인)의 제어하에 EGFP-MYCN을 과발현하는 형질전환선은 dβh-EGFP-MYCN 구조를 야생형(WT) AB 배아의 1세포 단계로 주입하여 개발하였으며, 이는 이전에 설명된 바와 같이 ^6,17이다. PSNS(지정된 LMO1 라인)에서 LMO1을 과발현하는 별도의 형질전환선은 1세포 ¹³단계에서 WT 배아에 2개의 DNA 구조, dβh-LMO1 및 dβh-mCherry를 주입하여 개발되었다. 이전에는 이중 DNA 구조를 생성하여 물고기 게놈으로 통합될 수 있음을 입증했습니다. 따라서, LMO1 및 mCherry는 형질전환 동물의 PSNS 세포에서 공동 발현된다. 주입 된 F0 배아가 성숙에 도달하면, 그들은 트랜스 진 (들) 통합을 가진 긍정적인 물고기의 식별을 위해 WT 물고기와 교차했습니다. 간단히, F1 자손은 PSNS 세포에서 mCherry 발현에 대한 형광 현미경 검사법에 의해 처음으로 검열되었다. mCherry 양성 물고기에서 LMO1의 세균성 통합은 게놈 PCR 및 시퀀싱에 의해 더 확인되었다. 각 형질전환선의 성공적인 식별 후, 이종구스 MYCN 및 LMO1 형질형 물고기의 자손은 MYCN과 LMO1을 모두 표현하는 복합 어류 라인을 생성하기 위해 교배되었다 (지정된 MYCN; LMO1 라인). 종양 베어링 MYCN; LMO1 물고기는 1 차 부위, 인터신장 영역 (IRG, 인간 부신의 얼룩말 물고기 에 상응하는)에 먼 지역에서 전이성 종양의 증거를 위해 주중 형광 현미경 검사법에 의해 모니터링^되었다. MYCN에서 종양의 전이를 확인하려면; LMO1 물고기, 조직학적 및 면역 조직화학 적 분석이 적용되었다.

프로토콜

제브라피시와 동물 관리/유지관리를 이용한 모든 연구 방법은 메이요 클리닉의 제도적 가이드라인에 따라 수행되었습니다.

1. PSNS에서 과발현을 가진 LMO1 형질전환 제브라피시 라인의 개발을 위한 트랜스진 구조의 제조 및 미세 주입

1. LMO1-pDONR221 항목 클론을 개발하기 위해, PCR을 사용하여 인간 세포주로부터 얻은 cDNA로부터 인간 LMO1의 코딩 영역을 증폭시한다.
   1. 여기에 자세히 설명된 대로 25 μL 반응을 확인하십시오: 10x 표준 Taq 반응 버퍼의 2.5 μL, Taq DNA 폴리머라제0.125 μL, 10mm dNTPs의 0.5 μL, cDNA 템플릿 2μL, 10 μM 포워드 LMO1 ATTB1 프라이머의 0.5 μL, 10 μM 역 LMO1 ATTB2 프라이머, 물 18.875 μL.
      참고: 앞으로 LMO1 ATTB1 프라이머 사용: 5'GGGGACAAGTAAAAAGCAGGCTACAC-3'.
      CATGATGGGTGCTGGACAAGAGA-3' 및 역 LMO1 ATTB2 프라이머: 5'-GGGGACCACTTTGTAAAGAGGTTTTTACT
      가액트게가트카아그-3'
   2. 다음 프로그램을 사용하여 증폭 : 94 °C의 1 주기, 2 분; 그 다음으로 30°C(94°C, 30초, 55°C, 30초, 72°C, 1분) 및 72°C, 7분, 7분.
2. CLONE LMO1 PCR 제품은 BP 재조합 반응^6,13에 의해 pDONR221 게이트웨이 기증자 벡터로 (PCR 단편 + 기증자 벡터 = 엔트리 클론).
   1. 10 μL 반응의 경우 정제된 LMO1 PCR 제품(150 ng/μL), 1 μL(150 ng/μL) pDONR221 기증자 벡터, 6 μL(pH 8.0) 및 BP 효소 혼합2μL, 25°C에서 1시간 동안 배양, TOP1의 유능한 프로토콜을 사용하여 TOP1로 변환한다.
   2. 다음으로, 루리아 국물(LB) 한천판에 50-200 μL을 확산시키고 하룻밤 사이에 37°C에서 배양하였다.
   3. 50 μg/mL 카나마이신으로 단일 콜로니를 LB 2-5mL로 접종하고 37°C에서 하룻밤(16-18h)을 배양하여 클론을 선택합니다.
   4. 제조 업체의 프로토콜에 따라 플라스미드 절연에 대 한 하룻밤 세균 문화의 2 mL를 사용 하 여. LMO1 플라스미드를 확인하려면 M13-F 프라이머(5-GTAAAAAACGAGGGAG-3')로 시퀀싱을 위해 플라스미드 샘플을 보내주십시오.
3. dβh-pDONRP4-P1R 엔트리 클론을 생성하기 위해, dβh PCR 생성물^6,13을 얻어 CH211-270H11 BAC 클론을 사용하여 5.2kb 프로모터 영역을 증폭시킴으로써 이전에 설명된 바와 같이 20 μL 반응을 준비하는 템플릿으로 1.1.1을 한다. 다음 PCR 프로그램 매개 변수를 사용하십시오: 94°C, 2분; 94°C, 15초, 50°C, 30초, 68°C, 8분의 10사이클; 94°C, 15초, 53°C, 30초, 68°C, 8분의 30사이클; 68 °C, 4 분 (앞으로 프라이머 5'GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTCGTACTC
   CCCCTTTAGG-3' 및 역 프라이머 5'-GGGGACTGCTTTTGTAACTTGTTGTTGCTTTG
   TCGTCTTTTGA-3').
   참고: 이 단계에서 긴 DNA 템플릿으로 인해 정확한 PCR 증폭을 위해 적절한 PCR 시스템을 사용할 수 있습니다.
4. BP 재조합 반응^6,13에 의해 pDONRP4-P1R 게이트웨이 기증자 벡터로 클론 dβh PCR 생성물 (PCR 단편 + 기증자 벡터 = 엔트리 클론).
   1. 정제 된 dβh PCR 제품(172 ng/uL), pDONRP4-P1R 기증자 벡터의 1 μL(150 ng/μL), TE 버퍼(pH 8.0)의 6μL을 총 10μL 반응으로 혼합하고, 25°C에서 1시간 동안 1시간 동안 인큐베이트하였다.
   2. 제조업체의 프로토콜에 따라 TOP10 유능한 대장균 으로 변환합니다. 1.2.2-1.2.4 단계에 설명된 바와 같이 플라스미드를 분리하고 M13-F(5'-GTAAAAAAACGACCCAG-3') 및 M13-R(5'-CAGGAAACAGCATGAC-3') 프라이머로 시퀀싱하여 플라스미드를 검증한다.
5. dβh:LMO1 식 구조를 생성합니다.
   1. 각 엔트리 클론(dβh-pDONRP4-P1R, LMO1-pDONR221 및 p3E-polyA11)(각각 20fmole), I-SceI 인식 사이트와 수정된 대상 벡터의 1 μL(60 ng/μL) 및 4 μL의 TE 버퍼(pH 8.0)를 결합하여 2μl의 재조합 효소를 함유하고 있습니다. 25°C에서 1h로 이 혼합물을 배양한다.
   2. 제조 업체의 프로토콜을 따르는 동안, 화학적으로 유능한 TOP10 대장균에 박테리아를 변환. 1.2.2-1.2.4 단계에 설명된 플라스미드를 분리하고 DBH 포워드(5'-GAAGCTGTCACAGGTTGTGG-3') 및 LMO1(5'GGCATTGGACAAGTGGCA-3') 프라이머로 시퀀싱하여 플라스미드를 검증한다.
6. dβh:mCherry DNA 구조는 5.2kb dβh 프로모터, pME-mCherry 및 p3E-polyA의 엔트리 클론을 I-SceI 인식 부위를 포함하는 수정된 대상 벡터로 결합하여 게이트웨이 시스템과 함께 1.5.16단계를 생성한다. 1.2.2-1.2.4 단계에 설명된 플라스미드를 분리하고 DBH 포워드 프라이머(5'-GAAGCTGTCACAGGTTGTGG-3')로 시퀀싱하여 플라스미드를 검증한다.
7. dβh:LMO1 DNA 구조 및 dβh:mCherry DNA 구조(각각 3:1 비율)는 I-SceI 효소(5U/μL)와 0.75 μL의 1μL을 가진 총 15μL 반응 부피(10x)로, 실내 온도에서 최소 4h 또는 하룻밤 동안 배양한다. DNA 농도가 반응에서 750 ng를 초과하지 않는지 확인합니다.
8. 다음날 및 분재의 선형화 후, 신선한 I-SceI 효소(5U/μL)의 0.5 μL과 0.5 μL의 0.5%의 페놀 레드를 이전 단계의 총 DNA 혼합물 5μL에 1.7의 이전 단계로부터 추가한다. 1.0mm 직경 유리 마이크로파이펫 바늘을 사용하여 1세포 단계 야생형 AB 배아(및 500배아)에 1세포 단계 야생형 AB 배아(및 500개의 배아)에 1.0mm 직경의 유리 마이크로파이펫 바늘을 마이크로젝트하여 ¹⁷⁷. 향후 주사를 위해 나머지 DNA 혼합물을 -20°C에 저장합니다.

2. LMO1 및 mCherry의 생식선 전송을 위한 LMO1 형질전환 어항을 화면및 확인

1. 3-4일 후 수정(dpf)에서 주입된 배아를 0.02% 트리카인으로 마취하고 모자이크 트랜스제네시스로 인해 어신 전체의 모든 곳에 제시하는 형광 mCherry 발현을 검사합니다. mCherry 양성 배아를 신선한 달걀 물을 곁들인 페트리 접시에 옮기고 제브라피쉬 북²¹에 따라 배아를 성숙으로 키울 수 있습니다.
   참고: 긍정적인 어류의 비율은 연구 인력의 전문 지식과 경험에 따라 달라질 것으로 예상됩니다. 예를 들어, 아마추어를 시작하는 것은 전문가의 ≥50%에 비해 10%의 낮은 통합률을 가질 수 있습니다.
2. dβh:LMO1 및 dβh:mCherry 트랜스게네스를 가진 창시자 물고기를 결정하기 위해, WT AB 물고기와 이전 단계 (2.1)에서 주사된 mCherry 양성 F0 성적으로 성숙한 물고기의 단일 쌍을 능가합니다. 3-4 dpf에서 mCherry 양성 배아에 대한 F1 세대를 선별합니다.
3. mCherry 양성 어류가 LMO1 트랜스진을 운반하는지 확인하기 위해, GDNA 추출 버퍼를 사용하여 F1 mCherry 양성 단일 배아로부터 gDNA를 분리합니다: 4x 리시스 버퍼의 12.5 μL (500 μL 의 1 M Tris 의 8.4, 2.5 mL) 1 M 칼륨 염화물, 정제 및 47 m의 정제 및 단백질 제 K의 2.5 μL 에서 10 mg/mL. 55°C에서 16h의 시료를 배양한 다음 98°C에서 10분 동안 배양합니다.
4. 추출된 gDNA(2 μL)를 프라이머가 함유한 지노티핑 PCR의 템플릿으로 사용하십시오: LMO1 FW: 5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA -3' 및 LMO1 RV: 5'-CGAAGGGGATCAGCTTG -3', 및 다음 PCR 프로그램: 94°C, 10분 35 사이클 (30 s94 °C, 30 s용 60 °C; 68 °C, 30 s); 및 7 분 동안 68 °C. 시퀀싱하여 증폭된 182 bp 조각을 확인합니다.
5. 유전자형확인 후, 제브라피쉬 북²¹의 표준 지침에 따라 나머지 mCherry 양성 F1 배아를 성숙으로 올립니다. 상기 프로토콜에서 2.3-2.4단계를 사용하여 2-3개월에 지느러미 클립및 유전자형이 어류에 LMO1 트랜스진의 통합을 더욱 확인한다.
   참고: LMO1 양성 F1 물고기는 안정적인 형질전환물고기[Tg(dβh:LMO1), Tg(dβh:mCherry)] ( LMO1 라인으로 지정됨)이 될 것이다.
6. WT 물고기와 함께 F1 LMO1 안정적인 형질 전환 물고기를 품종이 라인을 전파하는 데 필요한 대로 반복.

3. 전이성 모델을 만들기 위해 LMO1 및 MYCN 형질전환 선의 아웃 크로스

1. LMO1 형질전환 제브라피쉬 라인이 생성되면 MYCN 라인^6,17과 교배하여 MYCN과 LMO1을 모두 과발현하는 이종화구균 형질전환어선을 개발합니다.
2. 1 dpf에서, 힌드뇌 영역에서 EGFP 양성 점으로 제시 입체 형광 현미경으로 EGFP 발현에 대한 아웃 크로스의 자성을 정렬합니다.
   참고: 또는, 모든 배아가 1dpf에서 MYCN 을 위해 분류되는 것은 아니더라도, gDNA 격리를 위한 2.3-2.4 단계 에서 이전에 명시된 가이드라인을 사용하여 성인과 유전자형으로 배아를 올리고, 프라이머와 함께 PCR 유전자를 사용하십시오: MYCN-F (5'ATT CAC CAT CAC TGT TGT TCG TCC-3'); MYCN-R(5'TGC ATC ATC ACT CTC CAC GTA-3', 표준 Taq 폴리머라제와 함께 다음 프로그램: 3분 동안 94°C, 30초동안 60°C, 68°C 3분, 68°C) 및 68°C를 15암으로 예상하였다.
3. EGFP를 1dpf에서 정렬한 후, 선별된 배아를 별도의 페트리 접시로 분리하고 MYCN+(EGFP-Positive) 또는 MYCN-(EGFP-negative)로 라벨 접시를 표시합니다.
4. 3-4 dpf에서, 입체 형광 현미경으로 LMO1 발현을 위한 두 그룹(step 3.3)의 배아를 시각화하고 정렬한다. 특히 ^힌드브레인6,13의 직사각형에서 우수한 자궁 경부 신경절과 비 PSNS 도파민성 뉴런 세포 모두에서 반점으로 적색 형광 단백질 발현을 찾습니다^6,13.
   참고: 공기가 채워진 수영 방광이 그때까지 완전히 발달하고 배아가 떠다니기 때문에 배아가 5dpf에 도달하기 전에 mCherry/LMO1의 화면이 분류 과정에서 PSNS 세포의 어려운 현미경 초점으로 이어질 수 있습니다.
5. 정렬이 완료되면 정렬된 물고기를 아래와 같이 다른 유전자형 및 라벨의 4개 그룹으로 분리합니다. 제브라피쉬 북²¹의 표준 프로토콜에 따라 동일한 조건에서 정렬된 물고기를 올립니다.
   1. MYCN 전용(EGFP 양성),
   2. LMO1 전용(mCherry-positive),
   3. MYCN; LMO1 (EGFP 및 mCherry 이중 양성),
   4. WT (EGFP와 mCherry 더블 네거티브).

4. 형질전환 제브라피시 라인의 종양 부담을 시각화

1. 4주 후 수정(wpf)에서 페트리 접시에 0.02% 트리카인으로 3.5단계에서 선별된 생선을 마취합니다.
2. 종양을 보기 위해 금속 주걱으로 물고기를 양쪽 측면에 부드럽게 뒤집어 입체 형광 현미경으로 종양을 시각화합니다. 종양은 단일 EGFP-, 단일 mCherry-, 또는 이중 EGFP-mCherry 양성 질량으로 나타나게 될 것으로 예상하며, 이는 인터신장 부위(머리와 신장 근처)에서 발생합니다.
   참고: 초기 종양 발병은 전형적으로 인터신장의 한쪽에 더 밝고 더 큰 형광 양성 질량으로 제시될 수 있으며, 이는 초기 종양 발병을 피하기 위해 물고기의 양면을 시각화하는 것이 중요합니다.
3. 가능한 종양 베어링 물고기를 식별 한 후, 생년월일, 종양이 검사 된 날짜 및 유전자형을 포함하는 적절한 라벨이있는 별도의 탱크로 물고기를 분리합니다.
4. 6 wpf에서, 종양 베어링 물고기와 비 종양 베어링 물고기를 다시 검사하기 위해 4.1-4.3 단계를 반복하여 이전에 선별된 종양 베어링 물고기에 대한 종양의 존재를 확인하거나 각각 새로운 가능한 종양 베어링 물고기를 식별한다. 확인된 종양 베어링 물고기에서 형광 양성 질량의 지속 또는 증가한 크기를 찾아보십시오.
5. 종양 을 베어링 물고기를 확인 한 후, 종양 세포 이동의 증거를 위해 격주 모니터링, 이는 종양 발생의 기본 부위에서 멀리 작은 EGFP- 및 /또는 mCherry 양성 종양 질량으로 제시 (인터 신장 영역). 필요에 따라 이러한 물고기를 별도의 탱크로 분리하고 가능한 전이를 나타내기 위해 적절하게 라벨을 부착합니다.
6. 전이를 더 확인하기 위해, 먼 형광 양성 종양 질량이 명확하게 증가 된 크기를 보여 줄 때까지 정기적으로 (2 주마다) 이러한 물고기를 추적, 전이성 부위에서 종양의 성장을 나타내는.

5. 종양 베어링 물고기의 조직 처리 및 파라핀 단면

참고: MYCN 및 MYCN에서 자발적으로 개발된 1차 및/또는 전이성 종양을 특성화하기 위해 이 단계를 수행 합니다. LMO1 형질전환 물고기.

1. 종양을 낳는 물고기를 식별하고 확인한 후, 0.02% 트리카인으로 생선을 침수하여 페트리 접시에서 4.6단계에서 물고기를 희생한 다음, 생선이 더 이상 다시 약해지고 있지 않을 때까지 트리카인 복용량을 증가시십시오. 물고기를 머리와 신체의 중간 부분(종양 포함)과 물고기의 중간 부분과 꼬리가 있는 다른 조각으로 잘라냅니다.
2. 로커의 실온에서 1시간 동안 1x PBS에서 4%의 파라포름알데히드(PFA)로 두 어류 섹션을 모두 수정합니다. 고정 효율성을 향상시키기 위해 버퍼를 신선한 4% PFA로 교체하여 내부 장기에 대한 침투를 효과적이고 신속하게 증가시킵니다. 하룻밤 사이에 4 °C 또는 48 h에 대한 로커에 신선한 고정 버퍼와 생선을 둡니다.
   주의: PFA는 독성이 있습니다. 예방 절차와 시약의 적절한 폐기는 기관의 규정에 따라 다르므로 시약을 사용하고 폐기하기 전에 적절한 지침을 구하십시오.
3. 처리에 앞서 실온에서 15-20분 동안 시료를 100% 급속데칼시피어 용액에 배치합니다. 비금속 용기를 사용하고 배양 전반에 걸쳐 샘플(들)을 확인하여 과잉 탈화를 방지해야 합니다. 샘플 조직이 심하게 저하된 것처럼 보이는 경우, 시료를 물 이나 4°C에 배치하여 탈화 과정을 늦출 수 있습니다.
4. 일단 고정되고 탈화되면, 생선 샘플을 1 시간 동안 흐르는 수돗물로 씻고 프로세서 카세트에 넣습니다. 샘플이 두 개 이상인 경우 각각을 자체 카세트로 분리합니다.
5. 시료가 다양한 솔루션에 잠긴 티슈 프로세서에 생선을 넣은 카세트(들)를 배치하여 파라핀 을 포함시키는 조직을 탈수하고, 각각 다음과 같이 70% 에탄올(60분, 40°C), 85% 에탄올(50분, 40°C), 95% 에탄올(40분, 40°C) 두 번, 100% 에탄올(30분, 40°C), 100% 에탄올(30분, 40°C), 또 다른 신선한 용액 100% 에탄올(50분, 40°C) 40°C) 두 번, 자일렌 (30 분, 40 °C), 또 다른 신선한 자일렌 (50 분, 40 ° C), 또 다른 신선한 자일렌 (50 분, 45 ° C), 파라핀 (30 분, 45 ° C), 파라핀 (20 분, 58 °C) 세 번.
6. 조직이 처리된 후 각 카세트의 조직을 유지하면서 프로세서 기계에서 카세트(들)를 내리고 생선 샘플을 혼합하지 않도록 하십시오.
7. 물고기의 크기에 따라 적절한 크기의 금형을 선택하여 곰팡이가 생선 샘플과 전체 카세트에 맞는지 확인합니다. 60°C에서 액체 파라핀으로 금형의 바닥을 덮습니다.
8. 즉시 생선 위에 생선을 얹고(물고기가 수축구간의 평평한 측면위에 놓여 있는지 확인)와 액체 파라핀을 바르고, 물고기를 완전히 포함시키기 위해 곰팡이 의 상단에 파라핀으로 채우는 것을 마무리합니다.
9. 파라핀이 경화될 때까지 절개 마이크로토메의 찬판에 완성된 금형을 놓습니다.
10. 파라핀 블록이 단단해지면 시각적으로 더 높은 불투명성과 블록에 대한 단단한 터치를 관찰하여 판단할 수 있으며, 금형에서 블록을 부드럽게 제거합니다. 카세트 의 측면에서 여분의 파라핀을 조심스럽게 긁어 냅니다.
11. 파라핀임베디드 어류 블록은 마이크로톤4미크론에서 적당히 하며 증류수를 함유한 40°C의 따뜻한 수조에 섹션을 띄워보냅니다.
12. 조심스럽게 양전하 슬라이드에 섹션을 전송하고 6 단계, 7 또는 8 단계로 진행하기 전에 염색하기 전에 30 분 동안 60 °C에서 오븐에서 구워.

6. 헤마톡클린과 에오신 (H&E) 병리학 검토를위한 파라핀 섹션의 염색

1. 5.12 단계에서 파라핀 섹션이 포함된 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣습니다. 화학 연기 후드 안에, 자일렌3 번, 5 분 각각으로 deparaffinize. 각 사용 후 용액을 폐기합니다.
2. 100% 에탄올로 3분 동안 섹션을 재수화하고 신선한 100% 에탄올로 두 번 반복합니다. 100% 에탄올을 95% 에탄올로 교체한 후 3분 동안 80% 에탄올을 교체합니다.
3. 증류수로 단면을 5분 동안 헹구는 다. 섹션이 물로 세척하는 동안, 보풀이없는 닦아 헤마톡시린의 표면을 필터링하거나 스키밍하여 헤마톡시린에서 산화 된 입자를 제거해야합니다.
4. 미끄럼 방지 전문 등급 물티슈로 슬라이드 홀더의 과도한 물을 블롯하고, 원하는 염색 선호도 및 시약 악화에 따라 2-5분 동안 50% 헤마톡시린(증류수1:1 희석)으로 스테인 슬라이드를 블롯합니다. 매화에서 파란색/갈색으로 용액 색상이 바뀌거나 염색 시간이 과도해지면 헤마톡슬린을 버리십시오. 슬라이드를 흐르는 수돗물로 20분 동안 헹구십시오.
5. 슬라이드를 여러 번 빠르게 찍어 1% 산에 탄올(3.3mL의 염산 70%로 염색)으로 변색합니다. 슬라이드를 최대 3s까지 담그수 있지만 슬라이드를 더 오래 담그면 섹션이 가벼워집니다.
6. 슬라이드를 수돗물로 두 번 헹구고 각각 1분, 탈온화된 물로 한 번 헹구십시오. 옵션으로, 슬라이드는 물에 담그고, 이 단계에서 하룻밤 동안 남아있을 수 있습니다.
7. 1.36% 탄산염 용액(탄산리튬 47g, 3500mL 물)에 3s로 섹션을 담급니다. 리튬 탄산염 용액의 시간이 길어질수록 조직이 떠있을 가능성이 높기 때문에 섹션을 오버 배양하지 않도록하십시오.
8. 5 분 동안 수돗물에 섹션을 헹구고, 보풀이없는 전문 급성 물티슈로 슬라이드 홀더에서 여분의 물을 얼룩.
9. 15-30초 동안 100% 즉시 사용할 수 있는 에신으로 슬라이드를 카운터스테인하고, 각각 5분 동안 95%의 에탄올로 즉시 탈수합니다. 각각 5분 동안 100% 에탄올로 교체하고, 사용 후 솔루션을 폐기합니다.
10. 자일렌의 섹션을 15분 동안 지우고 총 3회 동안 두 번 반복합니다. 선택적으로, 슬라이드는 더 나은 여분의 물을 취소하기 위해 실온에서 하룻밤 자일렌에 남아있을 수 있습니다.
11. 슬라이드가 화학 연기 후드에서 공기 건조하도록 허용한 다음 장착 매체를 사용하여 커버 슬립을 장착하여 조직 샘플을 밀봉합니다.
12. 현미경 검사의 밑에 얼룩진 조직 단면도를 시각화하고 심상화합니다. 1 차 적인 사이트에 종양을 주의 깊게 검사 (머리 신장에 있는 interinnal 선 지역) 및 물고기의 그밖 조직 그리고 기관에 있는 먼 산발적인 전이. 병리학자가 검토할 조직 섹션에 얼룩진 슬라이드를 보냅니다. 인간 신경 아세포종에 물고기 모형의 유사한 병리학적인 특징에 근거하여, MYCN 전용 또는 MYCN에서 일어난 종양을 기대 합니다; LMO1 물고기는 병리학자에 의해 신경 모세포종으로 처음 진단될 수 있습니다.

7. NB 마커및 과잉 발현 된 전염된 유전자에 대한 항체를 가진 면역 히스토케미컬 분석 (IHC)은 종양과 그들의 동문 혈통 특성의 확산을 더욱 확인합니다.

1. 완전 자동 염색 시스템으로 염색
   1. IHC 결과를 H&E 염색 결과와 더 잘 비교하려면 IHC 염색을 위해 5.12 단계에서 인접한 슬라이드를 선택합니다.
      참고: 자동화된 염색 시스템은 더 빠르고 덜 힘든 결과를 허용하지만, IHC 염색을 위한 수동 프로토콜은 7.2 절의 단계를 참조하여 이러한 경우 사용할 수 있습니다.
   2. 자동화 된 시스템의 해당 1 차 항체 딜루언트와 필요한 원하는 농도 및 총 양을 기준으로 신경 모세포종 마커 인 티로신 하이드록실라제 (TH)(TH)(1:500)에 대한 1 차 항체를 희석시하십시오.
      참고: 최적의 항체 농도는 항체 와 조직에 따라 다를 수 있습니다.
   3. 자동화된 시스템은 에피토프 검색 용액을 20분 동안 온보드 열 유도 항원 검색을 사용하고 시스템의 해당 검출 시약을 사용하기 때문에, 기계의 매개 변수가 다음과 같이 설정되어 있는지 확인: Peroxidase 차단, 5분; 원하는 농도를 가진 1 차적인 항체, 15 분; 생체화 항토끼 IgG 이차 항체 (1:500), 8 분; 스트렙타비딘 HRP, 8분; 혼합 DAB 강렬한 기판, 5 분; 그리고 헤마톡시린, 5분.
   4. 설정이 설정되면 항체 트레이를 기계에 넣습니다. 슬라이드에 레이블이 지정되는 새 케이스를 만들어 슬라이드를 설정합니다. 이제 기기가 로드되어 실행될 준비가 되었습니다(탈밀, 염색 및 카운터스테인링).
   5. 슬라이드가 자동화 된 기계를 사용하여 탈밀, 염색 및 카운터 스테인드되면 각각 70 %, 95 %, 100 %의 에탄올 그라데이션에서 슬라이드를 탈수합니다. 섹션의 슬라이드를 100% 신선한 에탄올로 다시 5분 동안 잠급니다.
   6. 자일렌의 섹션을 5분, 두 번 또는 두 번 치우거나, 밤새 자일렌에 슬라이드를 두드려 여분의 물을 더 잘 치웁니다.
   7. 미끄럼틀을 화학 연기 후드에서 공기 건조하게 한 다음 장착 매체를 사용하여 커버 슬립을 장착합니다. 미세 검사로 염색 된 조직 섹션을 시각화하고 이미지화합니다.
   8. 물고기 모델의 전이를 확실하게 확인하려면 7단계에서 H&E에 의해 염색된 슬라이드와 6단계에서 H&E에 의해 염색된 신경모세포종 마커에 대한 항체로 염색된 슬라이드를 비교합니다.
      참고: H&E 염색에 의해 확인된 모든 종양 세포에서 신경 모세포종 마커, TH를 위한 긍정적인 염색을 볼 것으로 예상합니다. 또한 전이성 종양이 LMO1에서 확인된 인접한 조직에서 TH에 대한 긍정적 인 염색을 기대하지 않습니다 . MYCN 물고기. MYCN과 비슷한 나이의 제어 WT 및 MYCN 전용 물고기를 선택해야 합니다 . 이 분석을 위한 LMO1 물고기는 전이성 종양이 다초점 1차 종양일 가능성을 배제합니다.
2. 자동화된 IHC 염색 시스템 없이 수동으로 염색
   1. 슬라이드를 구울 후 5.12 단계에서 인접한 슬라이드를 선택하여 H&E와 IHC 염색을 더 잘 비교하여 분리합니다. 화학 연기 후드 내부, 탈밀 및 이전 단계를 사용하여 자일렌으로 슬라이드를 수분 6.1 과 6.2., 각각.
   2. 탈파라피화 및 재수화 후 내생 과산화수소 차단 용액(1x PBS)에서 실온에서 5분간 내생과산화수소 차단 용액(0.1% 아지드 나트륨 및 0.3%의 과산화수소 함유)에 슬라이드를 담그십시오. 신선한 1x PBS로 슬라이드를 3분 동안 세척하고 총 3회 동안 두 번 반복합니다.
      주의: 아지드 나트륨은 심각하게 독성이 있습니다. 교육기관의 규정에 따라 예방 절차와 적절한 시약 처분을 실천해야 합니다.
   3. 실온에서 10분 동안 단백질제 K(1x PBS1:500)를 통해 용액으로 슬라이드를 배양하여 항원들을 회수합니다. 세면 슬라이드3회 1x PBS로 3분 씩 3분.
   4. 로커의 실온에서 30분 동안 1x PBS에서 5% 염소 세럼으로 인큐베이팅하여 슬라이드를 차단합니다. 신선한 1x PBS로 슬라이드를 3분 동안 두 번 씻으십시오.
   5. 아비딘 블로킹 용액 4방울을 슬라이드에 직접 넣고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 신선한 1x PBS로 슬라이드를 3분 동안 두 번 세척한 후, 비오틴 블로킹 용액 4방울을 넣고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
   6. 슬라이드를 차단한 후, 티로신 하이드록실라제(TH)의 1차 항체에서 실온에서 45-60분, 또는 4°C에서 하룻밤동안 배양한다.
      참고: 1차 종양 및 기타 전이성 부위의 생리학 및 활성을 해결하기 위해 트랜스게네및 기타 관련 마커에 대한 추가 항체를 가진 얼룩. 최적의 항체 농도는 항체 및 조직에 따라 다를 수 있습니다.
   7. 신선한 1x PBS로 슬라이드를 3분 동안 세척하고 총 3회 반복합니다.
   8. 생체화 된 안티 래빗 IgG 이차 항체 (1:500)의 이차 항체에서 인큐베이션 슬라이드는 실온에서 45-60 분 동안 차단 용액으로 희석됩니다. 이전 세탁 단계 7.2.7을 반복합니다.
   9. HRP 컨쥬게이드 아비딘(1x PBS1:300)을 추가하고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 신선한 1x PBS로 3회 슬라이드를 5분 씩 세탁합니다.
   10. 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) 용액 (2.5 mL 증류수, 키트 버퍼 1 방울, 과산화수소 1 방울, 키트에서 DAB 2 방울)을 준비하고 DAB방울을 현미경 근처의 슬라이드에 직접 놓습니다. DAB를 추가한 후 현미경 아래 슬라이드의 색상 변화 반응을 관찰하십시오. 원하는 염색 강도에 도달하면 슬라이드 섹션을 차가운 증류수에 배치하여 반응을 중지하십시오.
   11. 몇 초 동안 샘플을 잠그거나 찍어 증류수로 다시 배치하여 신선한 50 % 헤마톡시린슬라이드를 카운터스테인하십시오. 원하는대로 반복하지만 일반적으로 조직 섹션이 얇기 때문에 한 번 충분해야합니다.
   12. 이전에 설명된 바와 같이 알코올 그라데이션의 슬라이드에 대한 탈수 조직 샘플을 7.1.5단계로 정하고 IHC 분석을 완료하기 위해 나머지 단계(7.1.8로 마지막 단계)를 계속합니다.

8. 메커니즘 연구로 종양에 콜라겐 축적파라핀 슬라이드의 피크로시리우스 붉은 염색

1. 6.1-6.3 단계를 반복하여 슬라이드에서 파라핀 섹션을 탈밀, 수화 및 세척합니다.
2. 슬라이드 홀더에서 프로급 보풀이 없는 물티슈로 여분의 물을 블롯한 후, 10분 동안 50% 헤마톡클린에 얼룩을 남습니다. 슬라이드를 흐르는 수돗물로 헹구고 10분 동안 헹구십시오.
3. 슬라이드를 피그리리우스 레드로 옮기고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
4. 슬라이드를 산성 수분(5mL 빙하 아세트산 1L의 수돗물 또는 증류수로 세척)을 두 번 세척하여 셰이커에서 5분 동안 배양합니다.
5. 슬라이드에서 먼저 대부분의 물을 늘림에 떨어뜨리고 슬라이드의 섹션을 흔들며 가능한 한 많은 물을 제거합니다.
6. 슬라이드를 100% 에탄올의 세 가지 변경으로 빠르게 배치하여 파라핀 섹션을 탈수합니다.
7. 6.10 및 6.11 단계를 반복하여 자일렌의 슬라이드를 지우고 샘플을 마운트합니다. 다음으로, 카메라가 장착된 복합 현미경이 있는 이미지.
8. ImageJ를 사용하여 각 섹션에 대해 적어도 세 개의 무작위 필드에 피그리리우스 적양성 콜라겐 섬유를 계산합니다. MYCN과 MYCN의 슬라이드 사이 비교; LMO1 물고기 섹션.

결과

LMO1이 MYCN과 시너지 효과를 발휘하여 NB 병원체에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해, dβh 프로모터의 통제하에 있는 PSNS 세포에서 LMO1(dβh:LMO1 및 dβh:mCherry) 또는 MYCN(dβh:EGFP-MYCN)의 발현을 구동하는 형질형성생성이 얼룩말피 배아배아로 주입^되었다. 도 1A에 도시된 바와 같이, 안정된 형질전환선의 발...

토론

Zebrafish는 지난 수십 년 동안 연구에서 일반적으로 사용되어 왔으며, 특히 암 연구에서는 유지 보수의 용이성, 견고한 재생산 및 생체 내 이미징^1,28에 대한 명확한 이점과 같은 명백한 이유로 사용되었습니다. 제브라피시 모델은 대규모 유전 연구를 위해 쥐와 마우스와 같은 포유류 모형 유기체에 잘 보완하는 그들의 외부 풍부하게 함 및 발달 때?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit	Vector	SK-4100
Acetic Acid	Fisher Scientific / Acros Organic	64-19-7
Agarose GP2	Midwest Scientific	009012-36-6
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody	Pel-Freez	P40101
Avidin/Biotin Blocking Kit	Vector	SP-2001
BOND Intense R Detection	Leica Biosystems	DS9263
BOND primary antibody diluent	Leica Biosystems Newcastle, Ltd.	AR9352
BOND-MAX IHC instrument	Leica Biosystems Newcastle, Ltd.	N/A	fully automated IHC staining system
CH211-270H11 BAC clone	BACPAC resources center (BRFC)	N/A
Compound microscope equipped with DP71 camera	Olympus	AX70
Cytoseal XYL (xylene based mounting medium)	Richard-Allan Scientific	8312-4
Eosin	Leica	3801601	ready-to-use (no preparation needed)
Ethanol	Carolina	86-1263
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
Gateway BP Clonase II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
Gateway LR Clonase II enzyme mix	Invitrogen, CA	11791-100
Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated)	Dako	E0432
Hematoxylin Solution, Harris Modified	Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC	HHS-32-1L
HRP Avidin D	Vector	A-2004
Hydrochloric Acid	Aqua Solutions	4360-1L
Hydrogen Peroxide, 3%	Fisher Scientific	H324-500
I-SceI enzyme	New England Biolabs, MA	R0694L
Kanamycin sulfate	Teknova, Inc.	K2150
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes	Fisher Scientific	34133
Lithium Carbonate	Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC	554-13-2
Microtome for sectioning	Leica Biosystems	RM2255
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404006
p3E-polyA	Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah	N/A	a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)
Parafin wax	Surgipath Paraplast	39603002	Parrafin to parafin
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	A11313
pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites)	Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany	N/A	a generous gift
pDONR 221 gateway donor vector	Thermo Fisher Scientific	12536-017
pDONRP4-P1R donor vector	Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah	N/A	a generous gift
Phenol red, 0.5%	Sigma Aldrich	P0290
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X	BioRad	1610780
Picrosirrius red stain kit	Polysciences	24901-250
pME-mCherry	Addgene	26028
Proteinase K, recombinant, PCR Grade	Roche	21712520
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
RDO Rapid Decalcifier	Apex Enginerring	RDO04
Sodium Azide (NaN3)	Sigma Aldrich	26628-22-8
Stereo fluorescence microscope	Leica	MZ10F
Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging	Nikon	SMZ-1500
Taq DNA Polymerase	New England Biolabs, MA	M0273L
Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor	Sakura	N/A	Model #: VIP-6-A1
Tricaine-S	Western Chemical Incorporated	20513
Xylene	Thermo Fisher Scientific	X3P1GAL