斑马鱼神经母细胞瘤转移模型

摘要

本文介绍了实时开发、表征和跟踪斑马鱼神经母细胞瘤模型肿瘤转移的方法，特别是在 MYCN 和 LMO1过表达的转基因斑马鱼品系中，该谱系自发地发生转移。

摘要

斑马鱼已成为研究人类疾病，特别是癌症的重要动物模型。除了应用于斑马鱼建模的强大转基因和基因组编辑技术外，易于维护，高产量生产力和强大的实时成像功能使斑马鱼成为研究转移以及体内该过程背后的细胞和分子基础的有价值的模型系统。第一个斑马鱼神经母细胞瘤（NB）转移模型是通过在多巴胺-β-羟化酶（dβh）启动子的控制下过度表达两个癌基因MYCN和LMO1而开发的。共过表达的MYCN和LMO1导致神经母细胞发生率降低和外显率增加，以及肿瘤细胞的加速远处转移。这种新模型可靠地重申了人类转移性NB的许多关键特征，包括临床相关和转移相关遗传改变的参与;体内转移的自然和自发发展;和转移的保守部位。因此，斑马鱼模型具有剖析体内肿瘤转移复杂过程的独特优势。

引言

斑马鱼已被广泛使用并应用于多个研究领域，特别是在癌症方面。该模型提供了许多优点 - 例如其强大的繁殖，经济高效的维护以及肿瘤生长和转移的多功能可视化 - 所有这些都使斑马鱼成为研究和研究肿瘤发生和转移的细胞和分子基础的强大工具。用于大规模基因组图谱、转基因、基因过表达或敲除、细胞移植和化学筛选的新技术极大地增强了斑马鱼模型的力量¹。在过去的几年中，已经开发了许多斑马鱼系来研究各种人类癌症的肿瘤发生和转移，包括但不限于白血病，黑色素瘤，横纹肌肉瘤和肝细胞癌^{2，3，4，5}。此外，第一个斑马鱼神经母细胞瘤（NB）模型是通过在多巴胺-β-羟化酶（dβh）启动子的控制下在外周交感神经系统（PSNS）中过度表达MYCN（一种癌基因）而产生的。通过该模型，进一步证明激活的ALK可以与MYCN协同作用，以加速肿瘤发作并增加体内肿瘤外显率⁶。

NB源自神经嵴细胞的交感肾上腺谱系，是儿童中高度转移的癌症⁷。它占儿科癌症相关死亡的10%⁸。NB在诊断时广泛转移，临床上可表现为主要起源于交感神经节链和^PSNS9，10的肾上腺髓链的肿瘤。 MYCN 扩增通常与 NB 患者的不良结局相关^11，12。此外， LMO1 已被确定为高风险病例中的关键NB易感基因^13，14。研究发现，在斑马鱼模型的PSNS中 ，MYCN 和 LMO1 的转基因共表达不仅促进了NB的早期发作，而且还诱导了与高危^NB13患者常见的相似部位的组织和器官的广泛转移。最近，在较新的NB斑马鱼模型中也观察到了NB的另一种转移表型，其中编码RNA结合蛋白的 MYCN 和 Lin28B 在 dβh 启动子的控制下都过度表达¹⁶。

斑马鱼的稳定转基因方法通常用于研究目的基因的过表达是否有助于正常发育和疾病发病机制^14，15。该技术已成功用于证明多个基因和途径对NB肿瘤发生的重要性^{6，16，17，18，19，20}。本文将介绍如何在PSNS中产生过表达MYCN和LMO1的转基因鱼系，以及如何证明这两种癌基因的合作加速了NB肿瘤发生和转移的发生¹³。首先，通过将dβh-EGFP-MYCN构建体注射到野生型（WT）AB胚胎的单细胞阶段，开发了在dβh-EGFP-MYCN（指定为MYCN系）控制下过表达EGFP-MYCN的转基因系^{，如前所述6，17}。通过将两个DNA构建体dβh-LMO1和dβh-mCherry在单细胞阶段¹³中共注射到WT胚胎中，开发了一种在PSNS（指定的LMO1系）中过表达LMO1的单独转基因系。先前已经证明，共注射的双DNA构建体可以共同整合到鱼类基因组中;因此，LMO1和mCherry在转基因动物的PSNS细胞中共表达。一旦注射的F0胚胎达到性成熟，它们就会与WT鱼杂交，以鉴定具有转基因整合的阳性鱼。简而言之，F1后代首先通过荧光显微镜筛选PSNS细胞中的mCherry表达。通过基因组PCR和测序进一步证实了MCherry阳性鱼中LMO1的种系整合。在成功鉴定各转基因品系后，将杂合MYCN和LMO1转基因鱼的后代杂交，生成表达MYCN和LMO1的复合鱼系（指定MYCN;改性活生物体1系）。含肿瘤的MYCN;通过荧光显微镜每两周监测一次LMO1鱼，以寻找远离原发部位的区域，即腺间区域（IRG，相当于人类肾上腺的斑马鱼）转移性肿瘤的证据¹³。确认MYCN中肿瘤的转移;应用改性活生物体1鱼组织学和免疫组化分析。

研究方案

所有使用斑马鱼和动物护理/维护的研究方法均按照梅奥诊所的机构指南进行。

1. PSNS中过表达的转基因构建体开发 转基因 构建体的制备和显微注射

1. 为了开发 LMO1-pDONR221 进入克隆，使用PCR扩增从人细胞系获得的cDNA中人类 LMO1 的编码区域。
   1. 制作25μL反应，详见:2.5μL1标准Taq反应缓冲液，0.125μLTaq DNA聚合酶，0.5μL10mM dNTPs，2μLcDNA模板，0.5μL1前向LMO1 ATTB1引物，0.5μL1逆转录MO1 ATTB2引物和18.875μL水。
      注意:使用前向LMO1 ATTB1引物:5'-GGGGACAAGTTGTACAAAAAAGCAGGCTACAC-3'。
      CATGATGGTGCTGGACAAGGAGGA-3' 和反向 LMO1 ATTB2 引物: 5'-GGGGACCACTTTACAAGAAAGCTGGTTTTACT
      GAACTTGGGATTCAAAGGT-3'
   2. 使用以下程序放大:94°C循环1次，2分钟;随后进行30次循环（94°C，30秒，55°C，30秒，72°C，1分钟）和72°C，7分钟。
2. 通过BP重组酶反应将 LMO1 PCR产物克隆到 pDONR221 网关供体载体^中6，13 （PCR片段+供体载体=进入克隆）。
   1. 对于10μL反应，将1μL纯化的 LMO1 PCR产物（150ng / μL），1μL（150ng / μL） pDONR221 供体载体和6μL TE缓冲液（pH 8.0）与2μLBP酶混合物混合，在25°C下孵育1小时，并使用制造商的方案转化为TOP10合格的 大肠杆菌 。
   2. 接下来，将50-200μL从转化小瓶中铺展到含有50μg/ mL卡那霉素的Luria肉汤（LB）琼脂平板上，并在37°C下孵育过夜。
   3. 通过将单个菌落接种到2-5mLLB中，加入50μg/ mL卡那霉素并在37°C下培养过夜（16-18小时）来选择克隆。
   4. 根据制造商的协议，使用2 mL过夜细菌培养物进行质粒分离。为了验证LMO1质粒，将质粒样品送出用M13-F引物（5-GTAAAACGGGCCAG-3'）进行测序。
3. 要生成dβh-pDONRP4-P1R进入克隆，通过使用CH211-270H11 BAC克隆作为模板扩增5.2 kb启动子区域来制备20μL反应，如步骤1.1.1所述，获得dβh PCR产物⁶，¹³。使用以下PCR程序参数:94°C，2分钟;10 次循环 94 °C， 15 s， 50 °C， 30 s， 68 °C， 8 min;30 次循环 94 °C， 15 s， 53 °C， 30 s， 68 °C， 8 min;68 °C，4 分钟（使用前期引物 5'GGGGACAACTTTATAGAAAAGTTGGCGTACTC
   CCCCTTTTTAGG-3' 和反向引物 5'-GGGGACTGCTTTTTTTACAAACTTGTGTGTTGCTTTG
   TCGTCTTTTGA-3'）。
   注意:由于此步骤中的DNA模板很长，请确保使用适当的PCR系统进行准确的PCR扩增。
4. 通过BP重组酶反应将 dβh PCR产物克隆到 pDONRP4-P1R 网关供体载体^中6，13 （PCR片段+供体载体=进入克隆）。
   1. 将1μL纯化的 dβh PCR产物（172ng / uL），1μL（150ng / μL）pDONRP4-P1R供体载体和6μL TE缓冲液（pH 8.0）与2μLBP酶混合物混合在总共10μL反应中混合，在25°C下孵育1小时。
   2. 根据制造商的协议转换为TOP10合格的 大肠杆菌 。按照步骤1.2.2-1.2.4中所述分离质粒，并通过用M13-F（5'-GTAAAACGCCAG-3'）和M13-R（5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'）引物进行测序来验证质粒。
5. 生成 dβh:LMO1 表达式构造。
   1. 将每个进入克隆（dβh-pDONRP4-P1R，LMO1-pDONR221和p3E-polyA11）（每个20 fmole），1μL（60ng / μL）的修饰目标载体与I-SceI识别位点和4μL含有2μLLR重组酶混合物的TE缓冲液（pH 8.0）混合。将该混合物在25°C下孵育1小时。
   2. 在遵循制造商协议的同时，将细菌转化为化学能力强的TOP10 大肠杆菌。按照步骤1.2.2-1.2.4中所述分离质粒，并通过使用DBH Forward（5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTG-3'）和LMO1（5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA-3'）引物进行测序来验证质粒。
6. 通过将5.2-kb dβh启动子，pME-mCherry和p3E-polyA的入口克隆组合到包含I-SceI识别位点的修饰目标载体中，使用网关系统生成dβh:mCherry DNA构建体，如前所述，在步骤1.5.16中提到。按照步骤1.2.2-1.2.4中所述分离质粒，并通过使用DBH前向引物（5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTG-3'）进行测序来验证质粒。
7. 用 1μL I-SceI 酶（5 U / μL）和0.75μL缓冲液（10x）在总共15μL反应体积中线性化 dβh: LMO1 DNA构建体和dβh:mCherry DNA构建体（分别以3:1的比例），并在室温下孵育至少4小时或过夜。确保反应中的DNA浓度不超过750 ng。
8. 第二天和构建物线性化后，将0.5μL新鲜I-SceI酶（5 U / μL）和0.5μL0.5%酚红加入5μL总DNA混合物中，来自上一步1.7。如前所述，使用直径为1.0 mm的玻璃微量移液管针将整个溶液（50-80pg的线性DNA）微注射到单细胞阶段的野生型AB胚胎（以及多达500个胚胎）^中17。将剩余的DNA混合物储存在-20°C以备将来注射。

2. 筛选和验证改性活生物体1转基因鱼品系对改性活生物体1和mCherry种系传播的影响

1. 在受精后3-4天（dpf）处，用0.02%三卡因麻醉注射的胚胎，并筛选它们是否有荧光mCherry表达，由于镶嵌转基因，这种表达出现在鱼体内的任何地方。将mCherry阳性胚胎转移到装有新鲜卵子水的培养皿中，并根据斑马鱼书²¹将胚胎提高到性成熟。
   注意:预计阳性鱼的比例会根据研究人员的专业知识和经验而有所不同。例如，新手业余爱好者的整合率可能低至10%，而专家的整合率≥50%。
2. 为了确定将 dβh:LMO1 和 dβh:mCherry 转基因整合到生殖细胞中的创始人鱼，将上一步（2.1）中注射的mCherry阳性F0性成熟鱼的单对与WT AB鱼杂交。筛选F1代中3-4 dpf的mCherry阳性胚胎。
3. 为了确认mCherry阳性鱼携带 LMO1 转基因，使用gDNA提取缓冲液从F1 mCherry阳性单胚胎中分离gDNA，该缓冲液含有:12.5μL4x裂解缓冲液（500μL1M Tris，pH值为8.4，2.5mL1M氯化钾和47mL纯化水），35μL纯化水， 和2.5μL蛋白酶K在10mg / mL。将样品在55°C孵育16小时，然后在98°C下孵育10分钟。
4. 使用提取的gDNA（2μL）作为使用引物进行基因分型PCR的模板: LMO1 FW:5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA -3'和 LMO1 RV:5'-CGAAGGCTGGCAGCTTG -3'，以及以下PCR程序:1个94°C循环，10分钟;35 次循环 （94 °C 持续 30 秒，60 °C 持续 30 秒;68 °C，30 s）;并在68°C下7分钟。通过测序确认扩增的182 bp片段。
5. 在确认基因型后，根据斑马鱼书的标准指南将剩余的mCherry阳性F1胚胎提高到成熟²¹。在2-3个月大时使用上述方案中的步骤2.3-2.4对它们进行鳍夹和基因分型，以进一步确认 改性活生物体1 转基因在鱼体内的整合。
   注: 改性活生物体1阳性的F1鱼将是稳定的转基因鱼[Tg（dβh:LMO1），Tg（dβh:mCherry）]（指定为 LMO1 品系）。
6. 用WT鱼繁殖 F1 LMO1 稳定的转基因鱼，并根据需要重复繁殖该品系。

3. 改性活生物体1 和 MYCN 转基因品系的外杂交，创建转移模型

1. 一旦改 性活体1 转基因斑马鱼品系生成，与 MYCN 品系^6，17 杂交，开发杂合转基因鱼品系，过度表达 MYCN 和 LMO1。
2. 在1 dpf时，用立体荧光显微镜对EGFP表达的外杂交后代进行排序，其表现为后脑区域的EGFP阳性点。
   注意:或者，如果不是所有胚胎都以1 dpf的速度进行 MYCN 分类，则通过鳍夹并将胚胎提高到成年期和基因型，并使用 先前声明的步骤2.3-2.4 中的指南进行gDNA分离和PCR基因分型，引物: MYCN-F（5'-ATT CAC CAT CAC TGT GCG TCC-3'）; MYCN-R （5'-TGC ATC CTC ACT CTC CAC GTA-3'，以及以下标准 Taq 聚合酶程序:1个循环94°C持续3分钟，35个循环（94°C持续30秒，60°C持续30秒，68°C持续3分钟），68°C持续7分钟，预期扩增子大小为145 bp。
3. 在以1 dpf分选EGFP后，将筛选的胚胎分离到单独的培养皿中，并将培养皿标记为: MYCN +（EGFP阳性）或 MYCN-（EGFP阴性）。
4. 在3-4 dpf下，用立体荧光显微镜对两组的胚胎进行可视化和分类（步骤3.3）以进行 LMO1 表达。寻找头部区域上颈神经节和非PSNS多巴胺能神经元细胞中的红色荧光蛋白表达作为斑点，特别是在后脑的长方形髓中^6，13。
   注意:在胚胎达到5 dpf之前筛选mCherry / LMO1，因为到那时充满空气的游泳膀胱完全发育并会导致胚胎漂浮，导致在分选过程中PSNS细胞难以微观聚焦。
5. 分拣完成后，将分拣的鱼分离成四组不同的基因型，并标记如下。根据斑马鱼书²¹中的标准协议，在相同的条件下饲养分类的鱼。
   1. 仅 MYCN（EGFP 阳性），
   2. 仅LMO1（mCherry阳性），
   3. 迈克; LMO1 （EGFP和mCherry双阳性），
   4. WT（EGFP和mCherry双阴性）。

4. 转基因斑马鱼品系肿瘤负荷的可视化

1. 在受精后4周（wpf）处，在培养皿中用0.02%的三卡因麻醉步骤3.5中的分类鱼。
2. 用立体荧光显微镜将鱼用金属刮刀轻轻翻转到两侧以查看肿瘤，从而可视化肿瘤。预计肿瘤表现为单个EGFP-，单个mCherry或双重EGFP和mCherry阳性肿块，这些肿块来自腺间区域（靠近头部和肾脏）。
   注意:最初的肿瘤发病通常可能在腺体间的一侧呈现出更亮，更大的荧光阳性肿块，这就是为什么可视化鱼的两侧以避免错过早期肿瘤发作至关重要的原因。
3. 在鉴定出可能的肿瘤鱼后，将鱼分离到具有适当标签的单独水箱中，其中包括出生日期，肿瘤筛查日期和基因型。
4. 在6 wpf处，重复先前的步骤4.1-4.3以再次筛选含肿瘤鱼和非肿瘤鱼，以确认先前筛查的含瘤鱼是否存在肿瘤或识别新的可能的荷瘤鱼。在确诊的含肿瘤鱼类中寻找持续或增加的荧光阳性肿块大小。
5. 在识别出含肿瘤的鱼后，每两周监测一次它们以寻找肿瘤细胞迁移的证据，其表现为远离肿瘤发生原发部位（腺体间区域）的微小EGFP和/或mCherry阳性肿瘤肿块。根据需要将这些鱼隔离到单独的水箱中，并适当标记以指示可能的转移。
6. 为了进一步确认转移，继续定期（每两周）跟踪这些鱼，直到远处荧光阳性肿瘤肿块明显增加，表明转移部位肿瘤的生长。

5. 肿瘤鱼的组织处理和石蜡切片

注意:执行此步骤以表征MYCN和MYCN中自发发展的原发性和/或转移性肿瘤 ;改性活生物体转基因 鱼。

1. 在鉴定和验证含肿瘤的鱼后，将鱼浸没在0.02%的三卡因中，首先麻醉，然后增加三卡因的剂量，直到鱼不再呼吸，从而在培养皿中牺牲从步骤4.6开始的鱼。将鱼切成两块 - 一块包含头部和身体中间部分（包括肿瘤）的一部分，另一块包含鱼的中间部分和尾巴的其余部分。
2. 在摇臂上用4%多聚甲醛（PFA）在室温下在1x PBS中固定两个鱼段1小时。为了提高固定效率，用新鲜的4%PFA代替缓冲液，以有效和快速地增加对内脏器官的外显率。将鱼留在摇臂上，在4°C下过夜或48小时。
   注意:PFA是有毒的。由于预防性程序和试剂的正确处置取决于您所在机构的规定，因此在使用和处置试剂之前寻求适当的指南。
3. 在处理之前，将样品置于室温下100%快速脱钙剂溶液中15-20分钟。确保使用非金属容器，并在整个孵育过程中检查样品，以防止过度脱钙。如果样品组织看起来严重降解，请将样品置于水中或4°C以减缓脱钙过程。
4. 固定并脱钙后，用流动的自来水清洗鱼样品1小时，然后将其放入处理器盒中。如果有多个样品，请将每个样品分离到自己的暗盒中。
5. 将带有鱼的盒放入组织处理器中，将样品分别浸没在各种溶液中，如下:70%乙醇（60分钟，40°C），85%乙醇（50分钟，40°C），95%乙醇（40分钟，40°C）两次，100%乙醇（30分钟，40°C），另一种100%乙醇（50分钟，50分钟， 40°C）两次，二甲苯（30分钟，40°C），另一种新鲜二甲苯溶液（50分钟，40°C），另一种新鲜二甲苯（50分钟，45°C），石蜡（30分钟，45°C），石蜡（20分钟，58°C）三次。
6. 处理完组织后，从处理器机器上卸下盒，同时保持每个盒的组织并确保防止鱼样品混淆。
7. 根据鱼的大小选择合适尺寸的模具，确保模具适合整个盒式磁带和鱼样品。在60°C下用液体石蜡覆盖模具底部。
8. 立即将装有鱼的盒放在模具顶部（确保鱼放在其平坦的侧面，用于矢状部分），并用液体石蜡完成填充到模具顶部以完全嵌入鱼。
9. 将完成的模具放在切片机的冷板上，直到石蜡硬化。
10. 一旦石蜡块变硬，可以通过视觉观察更高的不透明度和对块的牢固触摸来判断，轻轻地将块从模具中取出。小心地从盒的侧面刮掉任何多余的石蜡。
11. 将石蜡包埋的鱼块以4微米的距离在切片机上以4微米的速度进行切片，并将切片漂浮在含有蒸馏水的40°C温水浴上。
12. 小心地将切片转移到带正电荷的载玻片上，并在染色前在60°C的烤箱中烘烤30分钟，然后继续步骤6，7或8。

6. 石蜡切片的血红素和曙红（H&E）染色，用于病理学审查

1. 将包含步骤5.12中石蜡截面的载玻片放入载玻片支架中。在化学通风橱内，用二甲苯脱蜡3次，每次5分钟。每次使用后丢弃溶液。
2. 用100%乙醇再水合切片3分钟，并用新鲜的100%乙醇重复两次。用95%乙醇代替100%乙醇3分钟，然后用80%乙醇代替3分钟。
3. 用蒸馏水冲洗各部分5分钟。当切片在水中洗涤时，确保通过过滤或脱脂苏木精表面用无绒毛擦拭来去除苏木精中的氧化颗粒。
4. 用不起毛的专业级湿巾将载玻片支架中的多余水分印迹，并根据所需的染色偏好和试剂劣化，在50%苏木精（用蒸馏水1:1稀释）中染色载玻片2-5分钟。当溶液颜色从李子色变为蓝色/棕色或染色时间过长时，丢弃苏木精。用自来水冲洗载玻片20分钟。
5. 通过多次快速浸渍载玻片，在1%酸乙醇（3.3mL盐酸与50 mL 70%乙醇）中使切片脱色。载玻片可以浸渍到3秒，但载玻片浸渍的时间越长，部分就越轻。
6. 用自来水冲洗载玻片两次，每次1分钟，用去离子水冲洗一次。作为一种选择，滑梯可以在这个阶段过夜，浸泡在水中。
7. 将切片浸入1.36%碳酸锂溶液（47克碳酸锂，3500毫升水）中3秒。确保不要过度孵育切片，因为碳酸锂溶液中的时间越长，组织漂浮的可能性就越大。
8. 在自来水中冲洗切片5分钟，然后用不起毛的专业级湿巾擦拭载玻片支架上的多余水分。
9. 将载玻片在100%即用型曙红中复染15-30秒，并立即用95%乙醇脱水两次，每次5分钟。用100%乙醇替换两次，每次5分钟，每次使用后丢弃溶液。
10. 在二甲苯中清除切片15分钟，并重复两次，共3次。或者，载玻片可以在室温下在二甲苯中放置过夜，以更好地清除多余的水。
11. 让载玻片在化学通风橱中风干，然后使用安装介质安装盖玻片以密封组织样品。
12. 在显微镜下观察和成像染色的组织切片。仔细检查原发部位（头肾腺间区域）的肿瘤和鱼的其他组织和器官中的远处散发性转移。发送染色的载玻片，供病理学家检查组织切片。基于鱼类模型与人类神经母细胞瘤相似的病理特征，预计仅在 MYCN或MYCN中出现的肿瘤 ;LMO1 鱼首先被病理学家诊断为神经母细胞瘤。

7. 免疫组化分析（IHC）与针对NB标志物和过表达的转基因的抗体，进一步证实肿瘤的扩散及其交感肾上腺谱系特性

1. 使用全自动染色系统进行染色
   1. 为了更好地将IHC结果与H&E染色的结果进行比较，请从步骤5.12中选择相邻的载玻片进行IHC染色。
      注意:虽然自动染色系统可以更快，更省力地获得结果，但在没有IHC染色的情况下，可以通过参考第7.2小节的步骤使用手动协议进行IHC染色。
   2. 使用自动化系统的相应一抗稀释剂，根据所需浓度和所需总量稀释针对神经母细胞瘤标志物酪氨酸羟化酶 （TH） （1:500） 的一抗稀释。
      注意:最佳抗体浓度可能因抗体和组织而异。
   3. 由于自动化系统使用机载热诱导抗原检索与表位检索溶液和系统相应的检测试剂20分钟，确保机器的参数设置为:过氧化物酶阻断，5分钟;具有所需浓度的一抗，15分钟;生物素化抗兔IgG二抗（1:500），8分钟;链霉亲和素HRP，8分钟;混合DAB强底物，5分钟;和苏木精，5分钟。
   4. 设置设置后，将抗体托盘放入机器中。通过创建新案例来设置幻灯片，该案例将标记幻灯片。机器现在已加载并准备运行（脱蜡，染色和复染）。
   5. 使用自动机器对载玻片进行脱蜡，染色和复染后，以70%，95%和100%的乙醇梯度对载玻片进行脱水，每次5分钟。将切片的载玻片再次浸入100%新鲜乙醇中5分钟。
   6. 在二甲苯中清除切片5分钟，两次，或将载玻片在二甲苯中过夜，以更好地清除多余的水。
   7. 让载玻片在化学通风橱中风干，然后使用安装介质安装盖玻片。用显微镜观察和成像染色的组织切片。
   8. 为了坚定地确认鱼类模型中的转移，将步骤7中用针对神经母细胞瘤标志物的抗体染色的载玻片与步骤6中H&E染色的载玻片进行比较。
      注意:期望在H&E染色鉴定的所有肿瘤细胞中看到神经母细胞瘤标志物TH的阳性染色。预计在LMO1中鉴定出转移性肿瘤的邻近组织中，TH不会出现阳性染色 ;霉菌 毒素。确保选择与 MYCN年龄相似的控制WT和仅 MYCN鱼;LMO1 鱼进行这种分析，以排除转移性肿瘤是多灶性原发性肿瘤的可能性。
2. 手动染色，无需自动 IHC 染色系统
   1. 烘焙载玻片后，从步骤5.12中选择相邻载玻片，以便更好地比较H&E和IHC染色以脱蜡。在化学通风橱内，分别使用前面的步骤6.1和6.2.用二甲苯对载玻片进行脱蜡和再水化。
   2. 脱蜡和再水化后，将载玻片浸泡在内源性过氧化物封闭溶液（1x含有0.1%叠氮化钠和0.3%过氧化氢的PBS）中，在室温下浸泡5分钟。用新鲜的1x PBS洗涤载玻片3分钟，重复两次，共3次。
      注意:叠氮化钠具有急性毒性。确保根据您所在机构的规定，采取预防措施并正确处置试剂。
   3. 通过在室温下将载玻片与蛋白酶K（1:500在1x PBS中）在溶液中孵育10分钟来检索抗原。用 1 次 PBS 洗涤载玻片 3 次，每次 3 分钟。
   4. 在室温下在摇杆上用5%山羊血清在1x PBS中孵育30分钟来阻断载玻片。用新鲜的1x PBS洗涤载玻片两次，每次3分钟。
   5. 将4滴Avidin阻断溶液直接加入载玻片上，并在室温下孵育15分钟。用新鲜的1x PBS洗涤载玻片后，每次3分钟，加入4滴生物素阻断溶液，并在室温下孵育15分钟。
   6. 阻塞载玻片后，在室温下孵育酪氨酸羟化酶（TH）（1:500）的一抗45-60分钟，或在4°C下过夜。
      注意:用针对转基因和其他相关标志物的附加抗体染色，以解决原发肿瘤和其他转移部位的生理学和活性。最佳抗体浓度可能因抗体和组织而异。
   7. 用新鲜的1x PBS洗涤载玻片3分钟，重复两次，总共3次。
   8. 将载玻片孵育在生物素化的抗兔IgG二抗（1:500）中，在室温下在封闭溶液中稀释45-60分钟。重复上一个洗涤步骤7.2.7。
   9. 加入HRP偶联的Avidin（1x PBS中为1:300），并在室温下孵育20分钟。用新鲜的1x PBS清洗载玻片3次，每次5分钟。
   10. 准备3，3'-二氨基联苯胺（DAB）溶液（2.5毫升蒸馏水，1滴试剂盒缓冲液，1滴过氧化氢和2滴DAB），并将DAB滴剂直接滴在显微镜附近的载玻片上。加入DAB后，观察显微镜下载玻片上的颜色变化反应。一旦达到所需的染色强度，通过将玻片部分置于冷蒸馏水中来停止反应。
   11. 用新鲜的50%苏木精将样品浸没或浸渍短短几秒钟，然后放回蒸馏水中，用新鲜的50%苏木精复染载玻片。根据需要重复，但通常，一次应该足够了，因为组织切片很薄。
   12. 如前所述在步骤7.1.5中以酒精梯度对载玻片上的组织样品进行脱水，并继续完成其余步骤（最后一步为7.1.8）以完成IHC分析。

8. 石蜡载玻片红染色对肿瘤胶原蛋白积累的机制研究

1. 重复步骤6.1-6.3以脱蜡，水合和洗涤载玻片上的石蜡部分。
2. 用专业级无绒湿巾擦拭载玻片支架上的多余水分后，在50%苏木精中染色10分钟。用流动的自来水冲洗载玻片10分钟。
3. 将载玻片转移到Picrosirius Red中并在室温下孵育1小时。
4. 将载玻片在酸化水（5 mL冰醋酸在1L自来水或蒸馏水中）洗涤两次，在摇摇杯上孵育5分钟。
5. 首先从载玻片中倒出大部分水，然后物理摇晃并吸走载玻片上的部分，以尽可能多地除去水。
6. 快速将载玻片放入三个变化的100%乙醇中以脱水石蜡部分。
7. 重复步骤6.10和6.11以清除二甲苯中的载玻片并安装样品。接下来，使用配备相机的复合显微镜进行成像。
8. 使用ImageJ，在每个部分的至少三个随机字段中计算picrosirius红阳性胶原纤维。比较MYCN和MYCN的幻灯片;改性活生物体鱼类切片。

结果

为了确定LMO1是否与MYCN协同作用以影响NB发病机制，将驱动在dβh启动子控制的PSNS细胞中表达LMO1（dβh:LMO1和dβh:mCherry）或MYCN（dβh:EGFP-MYCN）表达的转基因构建体注射到斑马鱼胚胎^中13。如图1A所示，在开发稳定的转基因品系并验证其基因型后，杂合MYCN和LMO1鱼进行了杂交。他们的后代分别在1 d...

讨论

在过去的几十年里，斑马鱼一直被普遍用于研究，特别是在癌症研究中，原因显而易见，例如其易于维护，强大的繁殖以及 体内成像的 明显优势^1，28。由于斑马鱼模型的外部受精和发育，它们可以很容易地在胚胎上纵，这与哺乳动物模式生物（如大鼠和小鼠）相辅相成，用于大规模的遗传研究 ^{1 ， 2}

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit	Vector	SK-4100
Acetic Acid	Fisher Scientific / Acros Organic	64-19-7
Agarose GP2	Midwest Scientific	009012-36-6
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody	Pel-Freez	P40101
Avidin/Biotin Blocking Kit	Vector	SP-2001
BOND Intense R Detection	Leica Biosystems	DS9263
BOND primary antibody diluent	Leica Biosystems Newcastle, Ltd.	AR9352
BOND-MAX IHC instrument	Leica Biosystems Newcastle, Ltd.	N/A	fully automated IHC staining system
CH211-270H11 BAC clone	BACPAC resources center (BRFC)	N/A
Compound microscope equipped with DP71 camera	Olympus	AX70
Cytoseal XYL (xylene based mounting medium)	Richard-Allan Scientific	8312-4
Eosin	Leica	3801601	ready-to-use (no preparation needed)
Ethanol	Carolina	86-1263
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
Gateway BP Clonase II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
Gateway LR Clonase II enzyme mix	Invitrogen, CA	11791-100
Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated)	Dako	E0432
Hematoxylin Solution, Harris Modified	Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC	HHS-32-1L
HRP Avidin D	Vector	A-2004
Hydrochloric Acid	Aqua Solutions	4360-1L
Hydrogen Peroxide, 3%	Fisher Scientific	H324-500
I-SceI enzyme	New England Biolabs, MA	R0694L
Kanamycin sulfate	Teknova, Inc.	K2150
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes	Fisher Scientific	34133
Lithium Carbonate	Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC	554-13-2
Microtome for sectioning	Leica Biosystems	RM2255
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404006
p3E-polyA	Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah	N/A	a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)
Parafin wax	Surgipath Paraplast	39603002	Parrafin to parafin
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	A11313
pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites)	Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany	N/A	a generous gift
pDONR 221 gateway donor vector	Thermo Fisher Scientific	12536-017
pDONRP4-P1R donor vector	Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah	N/A	a generous gift
Phenol red, 0.5%	Sigma Aldrich	P0290
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X	BioRad	1610780
Picrosirrius red stain kit	Polysciences	24901-250
pME-mCherry	Addgene	26028
Proteinase K, recombinant, PCR Grade	Roche	21712520
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
RDO Rapid Decalcifier	Apex Enginerring	RDO04
Sodium Azide (NaN3)	Sigma Aldrich	26628-22-8
Stereo fluorescence microscope	Leica	MZ10F
Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging	Nikon	SMZ-1500
Taq DNA Polymerase	New England Biolabs, MA	M0273L
Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor	Sakura	N/A	Model #: VIP-6-A1
Tricaine-S	Western Chemical Incorporated	20513
Xylene	Thermo Fisher Scientific	X3P1GAL