Nöroblastom Metastaz Zebra Balığı Modeli

Özet

Bu makale, nöroblastom zebra balığı modelinde, özellikle kendiliğinden metastaz geliştiren MYCN ve LMO1'in aşırı ifade edilmesiyle transgenik zebra balığı hattında tümör metastazını gerçek zamanlı olarak geliştirme, karakterize etme ve izleme yöntemini tanıtır.

Özet

Zebra balığı, başta kanser olmak üzere insan hastalıklarını incelemek için önemli bir hayvan modeli olarak ortaya çıkmıştır. Zebra balığı modellemesinde uygulanan sağlam transgenik ve genom düzenleme teknolojilerinin yanı sıra, bakım kolaylığı, yüksek verimli üretkenlik ve güçlü canlı görüntüleme, zebra balığını metastaz ve bu sürecin altında bulunan hücresel ve moleküler temelleri vivo olarak incelemek için değerli bir model sistemi haline getirir. Metastazın ilk zebra balığı nöroblastom (NB) modeli, dopamin-beta-hidroksilyaz (dβh) promotörünün kontrolü altında iki onkogen, MYCN ve LMO1 aşırı ifade ederek geliştirilmiştir. Birlikte ifade edilen MYCN ve LMO1, nöroblastomagenezisin gecikmesinin azalmasına ve penetrancesinin artmasına ve tümör hücrelerinin uzak metastazlarının hızlanmasına yol açtı. Bu yeni model, klinik olarak ilgili ve metastazla ilişkili genetik değişikliklerin katılımı da dahil olmak üzere insan metastatik NB'nin birçok temel özelliklerini güvenilir bir şekilde yineler; metastaz in vivo doğal ve spontan gelişimi; ve metastaz sitelerini korumuş. Bu nedenle, zebra balığı modeli, tümör metastazının karmaşık sürecini in vivo olarak parçalamak için benzersiz avantajlara sahiptir.

Giriş

Zebra balığı, özellikle kanserde çeşitli araştırma alanlarına yaygın olarak kullanılmış ve uygulanmıştır. Bu model, sağlam üremesi, uygun maliyetli bakımı ve tümör büyümesi ve metastazının çok yönlü görselleştirilmesi gibi birçok avantaj sağlar- bunların hepsi zebra balığını tümöregenez ve metastazın hücresel ve moleküler bazlarını incelemek ve araştırmak için güçlü bir araç haline getirir. Büyük ölçekli genom haritalama, transgenez, genlerin aşırı ifade edilmesi veya nakavt edilmesi, hücre nakli ve kimyasal ekranlar için yeni teknikler zebra balığı modelinin gücünü son derece ^{artırmıştır1}. Son birkaç yıl içinde, lösemi, melanom, rabdomyosarkom ve hepatosellüler karsinom2,3,4,5 dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli insan kanserlerinin tümörjenezi ve metastazını incelemek için birçok zebra balığı hattı geliştirilmiştir. Ek olarak, nöroblastom (NB) ilk zebra balığı modeli, dopamin-beta-hidroksilaz (dβh) promotörünün kontrolü altındaki periferik sempatik sinir sisteminde (PSNS) bir onkogen olan MYCN'nin aşırı ifade edilmesiyle üretildi. Bu model ile aktif ALK'nın tümör başlangıcını hızlandırmak ve in ^vivo6'daki tümör penetrance'ını artırmak için MYCN ile sinerjiye sahip olabileceği daha da gösterilmiştir.

NB, nöral kret hücrelerinin sympathoadrenal soyundan türetilmiştir ve çocuklarda oldukça metastatik bir ^kanserdir7. Pediatrik kansere bağlı ölümlerin %10'undan ^sorumludur8. Tanıda yaygın olarak metastaz yapılan NB, klinik olarak öncelikle sempatik gangliyon zinciri ve PSNS9,10'un adrenal medullası boyunca ortaya çıkan tümörler olarak sunulabilir. MYCN amplifikasyonu genellikle NB hastalarında kötü sonuçlarla ^{ilişkilidir11,12}. Ayrıca LMO1, yüksek riskli olgularda kritik NB duyarlılık geni olarak ^{tanımlanmıştır13,14}. Çalışmalar, zebra balığı modelinin PSNS'sinde MYCN ve LMO1'in transgenik koexpressasyonunun sadece NB'nin daha erken başlamasını teşvik etmekle kalmayıp, aynı zamanda yüksek riskli ^NB13 hastalarında yaygın olarak görülen bölgelere benzeyen doku ve organlara yaygın metastaz yaptığını buldu. Çok yakın zamanda, bir RNA bağlayıcı proteini kodlayan MYCN ve Lin28B'nin dβh ^{promotörü16'nın} kontrolü altında aşırı ifade edildiği daha yeni bir zebra balığı NB modelinde NB'nin başka bir metastatik fenotipi de gözlenmiştir.

Zebra balıklarındaki kararlı transgenik yaklaşım genellikle ilgi çekici bir genin aşırı ekspresyonunun normal gelişime ve hastalık patogenezine katkıda bulunup bulunamayacağını incelemek için ^{kullanılır14,15}. Bu teknik, NB tümörjenezis6,16,17,18,19,20'ye giden birden fazla gen ve yolun önemini göstermek için başarıyla kullanılmıştır. Bu makale, PSNS'de hem MYCN hem de LMO1'i aşırı ifade eden transgenik balık hattının nasıl oluşturulduğunu ve bu iki onkogenin işbirliğinin NB tümörjenezi ve metastaz13'ün başlangıcını nasıl hızlandırdığının nasıl gösterildiğini tanıtacaktır. İlk olarak, dβh promotörünün (mycn hattı olarak belirlenmiş) kontrolü altındaki EGFP-MYCN'yi aşırı ifade eden transgenik hat, dβh-EGFP-MYCN yapısı daha önce açıklandığı gibi vahşi tip (WT) AB embriyolarının tek hücreli aşamasına enjekte ederek ^{geliştirilmiştir6,17}. PSNS'de LMO1'i (LMO1 hattı olarak belirlenmiş) aşırı ifade eden ayrı bir transgenik hat, dβh-LMO1 ve dβh-mCherry olmak üzere iki DNA yapısı tek hücreli aşamada WT embriyolarına dönüştürülerek ^{geliştirilmiştir13}. Daha önce, sikkelenmiş çift DNA yapılarının balık genomuna kazınabileceği gösterilmiştir; bu nedenle, LMO1 ve mCherry transgenik hayvanların PSNS hücrelerinde birlikte ifade edilir. Enjekte edilen F0 embriyoları cinsel olgunluğa ulaştığında, transgene(ler) entegrasyonu ile pozitif balıkların tanımlanması için WT balıklarıyla aşıldılar. Kısaca, F1 yavruları ilk olarak PSNS hücrelerinde mCherry ekspresyolü için floresan mikroskopi ile tarandı. LMO1'in mCherry pozitif balıklara germline entegrasyonu genomik PCR ve dizileme ile daha da doğrulandı. Her transgenik hattın başarılı bir şekilde tanımlanmasından sonra, heterozipöz MYCN ve LMO1 transgenik balıklarının soyu, hem MYCN hem de LMO1'i ifade eden bileşik bir balık hattı oluşturmak için iç içe geçti (MYCN olarak belirlenmiştir; LMO1 hattı). Tümör taşıyan MYCN; LMO1 balıkları, birincil bölgeye uzak bölgelerde metastatik tümörlerin, interrenal bez bölgesinin (IRG, insan adrenal bezine eşdeğer zebra balığı eşdeğeri) kanıtı için iki haftada bir floresan mikroskopi ile izlendi ¹³. MYCN'deki tümörlerin metastazını doğrulamak için; LMO1 balıkları, histolojik ve immünohistokimyasal analizler uygulandı.

Protokol

Zebra balığı ve hayvan bakımı/bakımı kullanılarak yapılan tüm araştırma yöntemleri Mayo Clinic'teki kurumsal yönergelere uygun olarak gerçek gerçekleştirildi.

1. PSNS'de aşırı ifade ile LMO1 transgenik zebra balığı hattının geliştirilmesi için transgene yapılarının hazırlanması ve mikroenjeksiyonu

1. LMO1-pDONR221 giriş klonunu geliştirmek için, pcr kullanarak insan hücre hattından elde edilen cDNA'dan insan LMO1'in kodlama bölgesini güçlendirin.
   1. Burada ayrıntılı olarak açık olarak 25 μL reaksiyon yapın: 2,5 μL 10x standart Taq Reaksiyon Tamponu, 0,125 μL Taq DNA Polimeraz, 0,5 μL 10 mM dNTP, 2 μL cDNA şablonu, 0,5 μL 10 μM ileri LMO1 ATTB1 astar, 0,5 μL 10 μM ters LMO1 ATTB2 astar ve 18,875 μL su.
      NOT: İleri LMO1 ATTB1 astarı kullanın: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAGCAGGCTACAC-3'.
      CATGATGGTGCTGGACAAGGAGGA-3' ve ters LMO1 ATTB2 astar: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGTTTACT
      GAACTTGGGATTCAAAGGT-3'
   2. Aşağıdaki programı kullanarak güçlendirin: 1 döngü 94 °C, 2 dk; ardından 30 döngü (94 °C, 30 s, 55 °C, 30 s, 72 °C, 1 dk) ve 72 °C, 7 dk.
2. BP rekombinaz reaksiyonu6,13 (PCR fragment + Donor vektör = Entry Clone) tarafından PDONR221 ağ geçidi donör vektörüne LMO1 PCR ürününü klonla.
   1. 10 μL reaksiyon için, 1 μL saflaştırılmış LMO1 PCR ürünü (150 ng/μL), 1 μL (150 ng/μL) pDONR221 donör vektörünü karıştırın, ve 2 μL BP enzim karışımı ile 6 μL TE tamponu (pH 8.0), 25 °C'de 1 saat kuluçkaya yatar ve üreticinin protokolünü kullanarak TOP10 yetkin E. coli'ye dönüşür.
   2. Daha sonra, 50 μg / mL kanamycin içeren bir Luria Suyu (LB) agar plakası üzerindeki dönüşüm şişesinden 50-200 μL yayın ve bir gecede 37 ° C'de kuluçkaya yayın.
   3. Tek bir koloniyi 50 μg/mL kanamycin ile 2-5 mL LB'ye aşılayarak ve 37 °C'de bir gecede (16-18 saat) kültleme yaparak klonları seçin.
   4. Üreticinin protokolüne göre plazmid izolasyonu için 2 mL gece bakteri kültürü kullanın. LMO1 plazmidini doğrulamak için, M13-F astarı (5- GTAAAACGACGGCCAG-3') ile sıralama için plazmid örneği gönderin.
3. Bir dβh-pDONRP4-P1R giriş klonu oluşturmak için, daha önce adım ^1.1.1'de açıklandığı gibi 20 μL reaksiyon hazırlamak için şablon olarak CH211-270H11 BAC klonunu kullanarak 5.2 kb promotör bölgesini güçlendirerek dβh PCR ^{ürününü6,13} edinin. Aşağıdaki PCR program parametrelerini kullanın: 94 °C, 2 dk; 94 °C, 15 s, 50 °C, 30 s, 68 °C, 8 dk 10 döngü; 94 °C, 15 s, 53 °C, 30 s, 68 °C, 8 dk 30 döngü; 68 °C, 4 dk (ileri astarlı 5'GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTC
   CCCCTTTTTAGG-3' ve ters astar 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTTTGTTGCTTTTTG
   TCGTCTTTTGA-3').
   NOT: Bu adımdaki uzun DNA şablonları nedeniyle, doğru PCR amplifikasyonu için uygun bir PCR sisteminin kullanımını sağlayın.
4. Clone dβh PCR ürünü pDONRP4-P1R ağ geçidi donör vektörüne BP rekombinoz ^{reaksiyonu6,13} (PCR parçası + Donör vektörü = Giriş Klonu).
   1. Toplam 10 μL reaksiyonda 1 μL saflaştırılmış dβh PCR ürünü (172 ng/uL), 1 μL (150 ng/μL) pDONRP4-P1R donör vektörü ve 6 μL TE tamponu (pH 8.0) 2 μL BP enzim karışımı ile karıştırın, 25 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
   2. Üreticinin protokolüne göre TOP10 yetkin E. coli'ye dönüştürün. Plazmidi 1.2.2-1.2.4 adımlarında açıklandığı gibi izole edin ve M13-F (5'-GTAAAACGACGGCCAG-3') ve M13-R (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3') astarları ile sıralayarak plazmidi doğrulayın.
5. dβh:LMO1 ifade yapısını oluşturun.
   1. Her giriş klonunun 1 μL'sini birleştirin (dβh-pDONRP4-P1R, LMO1-pDONR221 ve p3E-polyA11) (her biri 20 fmole), I-SceI tanıma alanlarına sahip 1 μL (60 ng/μL) modifiye hedef vektör ve 2 μL LR rekombinaz enzim karışımını içeren 4 μL TE tamponu (pH 8.0). Bu karışımı 25 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
   2. Üreticinin protokolünü takip ederken, bakterileri kimyasal olarak yetkin TOP10 E. coli'ye dönüştürün. Plazmidi 1.2.2-1.2.4 adımlarında açıklandığı gibi izole edin ve plazmidi DBH Forward (5'-GAAGCTGTCAGGGGGTG-3') ve LMO1 (5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA-3') astarları ile sıralayarak doğrulayın.
6. 5,2 kb dβh promotörü, pME-mCherry ve p3E-polyA'nın giriş klonlarını, adım 1.5.16'da daha önce belirtildiği gibi I-SceI tanıma sitelerini içeren değiştirilmiş hedef vektörde birleştirerek bir ağ geçidi sistemiyle dβh:mCherry DNA yapısı oluşturun. Plazmidi 1.2.2-1.2.4 adımlarında açıklandığı gibi izole edin ve plazmidi DBH Forward astarı (5'-GAAGCTGTCAGGGGGGGTG-3') ile sıralayarak doğrulayın.
7. Dβh:LMO1 DNA yapısı ve dβh:mCherry DNA konstrüktüyü (sırasıyla 3:1 oranında) 1 μL I-SceI enzimi (5 U/μL) ve 0,75 μL tampon (10x) ile toplam 15 μL reaksiyon hacminde doğrusallaştırın ve oda sıcaklığında en az 4 saat veya gece boyunca kuluçkaya yatırın. DNA konsantrasyonu reaksiyonda 750 ng'yi aşmamasını sağlayın.
8. Ertesi gün ve yapıların doğrusallaştırılmasından sonra, önceki adım olan 1,7'den 5 μL toplam DNA karışımına 0,5 μL taze I-SceI enzimi (5 U / μL) ve 0,5 μL% 0,5 fenol kırmızısı ekleyin. Daha ^{önce açıklandığı} gibi 1,0 mm çapında cam mikropipette iğne kullanarak toplam çözeltiyi (50-80 pg doğrusallaştırılmış DNA) tek hücreli yabani tip AB embriyolarına (ve 500 kadar embriyoya) mikroenjan. Kalan DNA karışımını gelecekteki enjeksiyonlar için -20 °C'de saklayın.

2. LMO1 ve mCherry'nin germline iletimi için LMO1 transgenik balık hattını tarayın ve doğrulayın

1. Döllenme sonrası 3-4 gün (dpf) sırasında, enjekte edilen embriyoları% 0.02 trikain ile uyuşturun ve mozaik transgenez nedeniyle balık gövdesinin her yerinde herhangi bir yerde bulunan floresan mCherry ekspresyolü için tarayın. mCherry pozitif embriyoları taze yumurta suyu içeren bir Petri kabına aktarın ve embriyoları zebra balığı kitabına uygun olarak cinsel olgunluğa ^yükseltin21.
   NOT: Pozitif balık oranının araştırma personelinin uzmanlığına ve deneyimine bağlı olarak değişmesini bekleyin. Örneğin, yeni başlayan amatörler% 50'≥ bir uzmana kıyasla% 10'luk düşük bir entegrasyon oranına sahip olabilir.
2. Dβh:LMO1 ve dβh:mCherry transgenes ile kurucu balıkları belirlemek için, enjekte edilmiş mCherry pozitif F0 çiftlerini WT AB balığı ile önceki adımdan (2.1) cinsel olarak olgunlaşmış balıkların dışında. MCherry pozitif embriyolar için F1 neslini 3-4 dpf olarak tarayın.
3. mCherry pozitif balığın LMO1 transgene taşıdığını doğrulamak için, aşağıdakileri içeren gDNA ekstraksiyon tamponunu kullanarak gDNA pozitif tek embriyodan izole edin: 12,5 μL 4x lizis tamponu (8,4 pH'lı 1 M Tris'in 500 μL'si, 1 M potasyum klorürün 2,5 mL'si ve 47 mL arıtılmış su), 35 μL arıtılmış su, ve 10 mg/mL'de 2,5 μL proteinaz K. Numuneyi 55 °C'de 16 saat kuluçkaya yatırın, ardından 98 °C'de 10 dk.
4. Çıkarılan gDNA'yı (2 μL) astarlı genotipleme PCR için bir şablon olarak kullanın: LMO1 FW: 5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA -3' ve LMO1 RV: 5'-CGAAGGGGGATCAGCTTG -3' ve aşağıdaki PCR programı: 94 °C, 10 dk 1 döngü; 35 döngü (30 s için 94 °C, 30 sn için 60 °C; 68 °C, 30 s); ve 7 dakika için 68 °C. Yükseltilmiş 182 bp parçasını sıralayarak onaylayın.
5. Genotipin onaylanmasından sonra, kalan mCherry pozitif F1 embriyolarını zebra balığı kitabının standart yönergelerine uygun olarak olgunluğa ^yükseltin21. LMO1 transgenesinin balıklara entegrasyonunu daha da onaylamak için yukarıdaki protokolden 2.3-2.4 adımlarını kullanarak 2-3 aylıkken bunları klipsle ve genotiple.
   NOT: LMO1 pozitif F1 balığı kararlı transgenik balık [Tg(dβh:LMO1),Tg(dβh:mCherry)] ( LMO1 hattı olarak belirlenmiştir) olacaktır.
6. F1 LMO1 stabil transgenik balıkları WT balığı ile yetiştirin ve bu hattı yaymak için gerektiği gibi tekrarlayın.

3. Metastatik model oluşturmak için LMO1 ve MYCN transgenik çizgilerin aşrımı

1. LMO1 transgenik zebra balığı hattı oluşturulduktan sonra, hem MYCN hem de LMO1'i aşırı ifade eden heterozipöz transgenik balık hattı geliştirmek için MYCN ^hattı6,17 ile melezlenmiştir.
2. 1 dpf'de, arka beyin bölgesinde EGFP pozitif noktalar olarak sunulan stereoskopik floresan mikroskop ile EGFP ekspresyözü için outcross soylarını sıralayın.
   NOT: Alternatif olarak, tüm embriyolar MYCN için 1 dpf'de sıralanmazsa, embriyoları yüzgeç kırpması ile yetişkinliğe ve genotipe yükseltin ve gDNA izolasyonu ve PCR genotipleme için 2.3-2.4 adımlarından daha önce belirtilen yönergeleri kullanarak, astarlarla: MYCN-F (5'-ATT CAC CAT CAC TGT GCG TCC-3'); MYCN-R (5'-TGC ATC CTC ACT CTC CAC GTA-3', ve standart Taq polimeraz ile aşağıdaki program: 3 dakika için 94 °C 1 döngü, 35 döngü (30 s için 94 °C, 30 s için 60 °C ve 3 dakika için 68 °C) ve 7 dakika boyunca 145 bp beklenen amplicon boyutu ile 68 °C.
3. EGFP için 1 dpf'de sıraladıktan sonra, taranmış embriyoları ayrı Petri kaplarına izole edin ve bulaşıkları şu şekilde etiketlendir: MYCN+ (EGFP pozitif) veya MYCN- (EGFP-negatif).
4. 3-4 dpf'de, stereoskopik floresan mikroskop ile LMO1 ekspresyasyonu için her iki grubun embriyolarını (adım 3.3) görselleştirin ve sıralayın. Kırmızı floresan protein ekspresyonunun hem üstün servikal ganglion hem de psns dışı dopaminerjik nöronal hücrelerde, özellikle arka beynin oblongata medullasında lekeler olarak ^arayın6,13.
   NOT: Embriyolar 5 dpf'ye ulaşmadan önce mCherry/LMO1 taraması, çünkü hava dolu yüzme mesaneleri o zamana kadar tamamen gelişir ve embriyoların yüzmesine neden olur ve bu da sıralama işlemi sırasında PSNS hücrelerinin zor mikroskobik odaklanmasına neden olur.
5. Sıralama tamamlandıktan sonra, sıralanmış balıkları farklı genotiplerden oluşan dört gruba ayırın ve aşağıdaki gibi etiketlendirin. Sıralanmış balıkları zebra balığı kitabından standart protokollere göre aynı koşullarda ^kaldırın21.
   1. Yalnızca MYCN (EGFP pozitif),
   2. Yalnızca LMO1 (mCherry-pozitif),
   3. MYCN; LMO1 (EGFP ve mCherry çift pozitif),
   4. WT (EGFP ve mCherry çift negatif).

4. Transgenik zebra balığı hatlarında tümör yükünü görselleştirme

1. Döllenme sonrası 4 hafta (wpf) sırasında, sıralanmış balıkları bir petri kabında% 0.02 trikain ile 3.5 adımından uyuşturun.
2. Tümörü görüntülemek için her iki yan tarafa metal spatula ile balıkları hafifçe çevirerek stereoskopik floresan mikroskopla tümörleri görselleştirin. Tümörlerin interrenal bez bölgesinden (baş ve böbreğe yakın) kaynaklanan tek EGFP, tek mCherry veya çift EGFP ve-mCherry pozitif kitleler olarak sunulmasını bekleyin.
   NOT: İlk tümör başlangıcının tipik olarak interrenal bezin bir tarafında daha parlak ve daha büyük bir floresan pozitif kütle ile sunulması mümkündür, bu nedenle erken tümör başlangıcını kaçırmamak için balığın her iki tarafını da görselleştirmek çok önemlidir.
3. Olası tümör taşıyan balıkların tanımlanmasından sonra, balıkları doğum tarihini, tümörün tarandığı tarihi ve genotipi içeren uygun etiketlerle ayrı bir tanka izole edin.
4. 6 wpf'de, tümör taşıyan balıkları ve tümör olmayan balıkları taramak için önceki 4.1-4.3 adımlarını tekrarlayın, daha önce taranmış tümör taşıyan balıklar için tümörlerin varlığını doğrulamak veya sırasıyla yeni olası tümör taşıyan balıkları tanımlamak için. Doğrulanmış tümör taşıyan balıklarda floresan pozitif kütlenin sürekli veya artan boyutunu arayın.
5. Tümör taşıyan balıkları tanımladıktan sonra, tümörgenezi (interrenal bez bölgesi) birincil bölgesinden uzakta küçük EGFP ve/veya mCherry pozitif tümör kitleleri olarak ortaya çıkan tümör hücre göçü kanıtı için onları iki haftada bir izleyin. Bu balıkları gerektiğinde ayrı tanklara izole edin ve olası metastazları belirtmek için uygun şekilde etiketlenin.
6. Metastazı daha da doğrulamak için, uzak floresan pozitif tümör kitleleri metastatik bölgelerde tümörlerin büyümesini gösteren açıkça artan boyut gösterene kadar bu balıkları düzenli olarak (iki haftada bir) izlemeye devam edin.

5. Tümör taşıyan balıkların doku işleme ve parafin kesitleri

NOT: MYCN ve MYCN'de kendiliğinden gelişen primer ve/veya metastatik tümörleri karakterize etmek için bu adımı gerçekleştirin ; LMO1 transgenik balık.

1. Tümör taşıyan balıkların tanımlanması ve doğrulanmasından sonra, balıkları% 0.02 trikain içinde batırarak petri kabındaki 4.6 adımından önce anesteziye kurban edin ve daha sonra balıklar artık solmayınceye kadar trikain dozajını artırın. Balığı, başı ve vücudun orta bölümünün bir kısmını (tümör dahil) içeren bir parça ve balığın orta bölümünün ve kuyruğunun geri kalanıyla başka bir parçaya bölün.
2. Her iki balık bölümünü de 1x PBS'de %4 paraformaldehit (PFA) ile bir rocker'da oda sıcaklığında 1 saat sabitlayın. Fiksasyon verimliliğini artırmak için, iç organlara penetrance'ı etkili ve hızlı bir şekilde artırmak için tamponu taze% 4 PFA ile değiştirin. Balıkları bir gecede 4 °C'de veya 48 saat boyunca bir rocker üzerinde taze sabitleme tamponu ile bırakın.
   DİkKAT: PFA toksiktir. Reaktifin ihtiyati prosedürleri ve uygun şekilde bertaraf edilmesi kurumunuzun düzenlemelerine bağlı olduğundan, reaktifi kullanmadan ve elden çıkarmadan önce uygun yönergeleri arayın.
3. İşlemeden önce, numuneleri oda sıcaklığında 15-20 dakika boyunca% 100 hızlı kireç çözücü çözeltisine yerleştirin. Aşırı kireçten arındırma önlemek için bir ametal kapsayıcı kullandığınızdan ve inkübasyon boyunca örnekleri kontrol etmeyi unutmayın. Örnek doku ağır bir şekilde bozulmuş görünüyorsa, kireç çözme işlemini yavaşlatmak için numuneyi suya veya 4 °C'ye yerleştirin.
4. Sabitlendikten ve kireçsizleştirildikten sonra, balık örneklerini 1 saat boyunca akan musluk suyuyla yıkayın ve işlemci kasetlerine yerleştirin. Birden fazla örnek varsa, her birini kendi kasetine ayırin.
5. Numunelerin çeşitli çözeltilere batırıldığı doku işlemcisine balıklı kasetler yerleştirerek dokuyu susuz bırakıp parafin gömmeye hazırlamak, sırasıyla, aşağıdaki gibi: %70 etanol (60 dk, 40 °C), %85 etanol (50 dk, 40 °C), %95 etanol (40 dk, 40 °C) iki kez, %100 etanol (30 dk, 40 °C), %100 etanol (50 dk, 40 °C) iki kez, ksilen (30 dk, 40 °C), başka bir taze ksilen çözeltisi (50 dk, 40 °C), başka bir taze ksilen (50 dk, 45 °C), parafin (30 dk, 45 °C), parafin (20 dk, 58 °C) üç kez.
6. Doku işlendikten sonra, her kasetin organizasyonunu sürdürürken ve balık örneklerinin karıştırılmasını önlediğinizden emin olurken kasetleri işlemci makinesinden boşaltın.
7. Balığın büyüklüğüne göre uygun boyuttaki kalıbı seçin, kalıbın tüm kaseti balık örneğine sığdıracağından emin olun. Kalıbın altını 60 °C'de sıvı parafin ile örtün.
8. Hemen balığın üzerine sıvı parafin ile balıklı kaseti (balığın sagittal bölümler için düz yanal tarafına yerleştirildiğından emin olarak) yerleştirin ve balığı tamamen gömmek için kalıbın üstüne parafinle doldurmayı bitirin.
9. Tamamlanan kalıbı, parafin sertleşene kadar kesit mikrotomunun soğuk plakasına yerleştirin.
10. Parafin bloğu sert olduğunda, görsel olarak daha yüksek opaklık ve bloğa sıkı bir dokunuş gözlemleyerek değerlendirilebilir, bloğu kalıptan hafifçe çıkarın. Kasetin yanlarından fazla parafinleri dikkatlice kazıyın.
11. Parafin gömülü balık bloğunu mikrotom üzerinde 4 mikronda sagittally olarak bölümlendirin ve bölümleri damıtılmış su içeren 40 °C'de ılık bir su banyosunda yüzdürün.
12. Bölümleri pozitif yüklü slaytlara dikkatlice aktarın ve 6, 7 veya 8.

6. Patoloji incelemesi için parafin bölümlerinin hematoksilin ve eozin (H&E) boyanma

1. Parafin bölümleri içeren slaytları adım 5.12'den slayt tutucusuna yerleştirin. Kimyasal bir duman kaputunun içinde, her biri 5 dakika olmak üzere 3 kez ksilen ile deparaffinize edin. Her kullanımdan sonra çözümü atın.
2. Bölümleri 3 dakika boyunca% 100 etanol ile yeniden sulayın ve taze% 100 etanol ile iki kez tekrarlayın. 3 dakika boyunca% 100 etanol% 95 etanol ve ardından 3 dakika boyunca% 80 etanol değiştirin.
3. Bölümleri damıtılmış suyla 5 dakika durulayın. Bölümler suda yıkanırken, hematoksilin yüzeyini tüy bırakmayan bir mendille filtreleyarak veya sıyırarak oksitlenmiş parçacıkları hematoksilinden çıkardığınızdan emin olun.
4. Slayt tutucusundan gelen fazla suyu tüy bırakmayan profesyonel sınıf mendillerle ve leke slaytlarını istenen boyama tercihlerine ve reaktif bozulmasına bağlı olarak 2-5 dakika boyunca% 50 hematoksilin (damıtılmış su ile 1:1 seyreltme) ile lekeleyin. Çözelti rengi erikten mavi/kahverengiye değiştiğinde veya lekeleme süresi aşırı hale geldiğinde hematoksilin atın. Slaytları akan musluk suyuyla 20 dakika durulayın.
5. Slaytları birden fazla kez hızlı bir şekilde batırarak bölümleri % 1 asit etanol (3,3 mL% 70 etanol 50 mL hidroklorik asit) içinde renksizleştirin. Slaytlar 3 sn'ye kadar daldırılabilir, ancak slaytlar ne kadar uzun süre batırıldıysa, bölümler o kadar hafif olur.
6. Slaytları musluk suyunda iki kez 1 dakika ve bir kez deiyonize su ile durulayın. Bir seçenek olarak, slaytlar bu aşamada bir gecede suya batırılarak bırakılabilir.
7. Bölümleri 3 sn için %1,36 lityum karbonat çözeltisi (47 g lityum karbonat, 3500 mL su) içine daldırın. Lityum karbonat çözeltisinde süre ne kadar uzun olursa, dokunun yüzme olasılığı o kadar fazla olduğundan bölümleri aşırı kuluçkaya yatırmamaya dikkat edin.
8. Bölümleri musluk suyunda 5 dakika durulayın ve slayt tutucusundan gelen fazla suyu tüy bırakmayan profesyonel sınıf mendillerle lekeleyin.
9. Slaytları 15-30 s için% 100 kullanıma hazır eozin içinde karşıt olarak kullanın ve her biri 5 dakika boyunca iki kez% 95 etanol ile hemen susuz kalın. Her kullanımdan sonra çözeltileri atarak her biri 5 dakika boyunca iki kez% 100 etanol ile değiştirin.
10. Ksilendeki bölümleri 15 dakika temizleyin ve toplamda 3 kez iki kez tekrarlayın. İsteğe bağlı olarak, fazla suyu daha iyi temizlemek için slaytlar oda sıcaklığında gece boyunca ksilen olarak bırakılabilir.
11. Slaytların kimyasal duman kaputunda havayla kurumasını bekleyin ve ardından doku örneğini sızdırmazlık için montaj ortamını kullanarak bir kapak kayması monte edin.
12. Mikroskopi altında lekeli doku bölümlerini görselleştirin ve görüntüleyin. Birincil bölgedeki tümörleri (baş böbrekteki interrenal bez bölgesi) ve balığın diğer doku ve organlarındaki uzak sporadik metastazları dikkatlice inceleyin. Patologlar tarafından incelenecek doku bölümleri için lekeli slaytlar gönderin. Balık modelinin insan nöroblastom ile benzer patolojik özelliklerine dayanarak, yalnızca MYCN veya MYCN'de ortaya çıkan tümörleri bekleyin ; LMO1 balıkları ilk olarak patologlar tarafından nöroblastom olarak teşhis edilecektir.

7. Tümörün yayılmasını ve sempatizanal soy özelliğini daha da doğrulamak için NB işaretleyicisine ve aşırı ifade edilen transgenelere karşı antikorlarla immünohistokimyasal Analiz (IHC)

1. Tam otomatik boyama sistemi ile boyama
   1. IHC sonucunu H&E boyama ile daha iyi karşılaştırmak için, IHC boyama için adım 5.12'den bitişik slaytları seçin.
      NOT: Otomatik boyama sistemi daha hızlı ve daha az zahmetli sonuçlara izin verse de, 7.2 alt bölümünün adımlarına atıfta bulunarak bunun yokluğunda IHC boyama için manuel bir protokol kullanılabilir.
   2. İstenilen konsantrasyona ve otomatik sistemin karşılık gelen Birincil Antikor Seyrelticisi ile gereken toplam miktara bağlı olarak bir nöroblastom belirteci olan tirozin hidroksilaz (TH) (1:500) karşı birincil antikoru seyreltin.
      NOT: Optimal antikor konsantrasyonları antikor ve dokuya bağlı olarak değişebilir.
   3. Otomatik sistem 20 dakika boyunca epitop alma çözümü ve sistemin ilgili algılama reaktifi ile yerleşik ısı kaynaklı antijen alımı kullandığından, makinenin parametrelerinin şu şekilde ayarlanmasını sağlayın: Peroksidaz Engelleme, 5 dk; İstenilen konsantrasyona sahip birincil antikor, 15 dk; biyotinillenmiş anti-tavşan IgG ikincil antikor (1:500), 8 dk; Streptavidin HRP, 8 dk; karışık DAB yoğun substrat, 5 dk; ve Hematoksilin, 5 dk.
   4. Ayarlar ayarlandıktan sonra antikor tepsisini makineye yerleştirin. Slaytları etiketleyecek yeni bir servis talebi oluşturarak slaytları ayarlayın. Makine artık yüklendi ve çalışmaya hazır (dewaxing, boyama ve karşı lekeleme).
   5. Slaytlar otomatik makine kullanılarak dewaxed, lekeli ve sayaç olarak bir kez, her biri 5 dakika boyunca% 70, % 95 ve% 100 etanol gradyanlarında slaytları susuz bırakır. Bölümlerin slaytlarını 5 dakika boyunca tekrar% 100 taze etanolde batırın.
   6. Xylene'deki bölümleri 5 dakika, iki kez temizleyin veya fazla suyu daha iyi temizlemek için slaytları bir gecede ksilen içinde bırakın.
   7. Slaytların kimyasal duman kaputunda havayla kurumasını bekleyin ve ardından bir montaj ortamı kullanarak bir kapak kayması monte edin. Lekeli doku bölümlerini mikroskopi ile görselleştirin ve görüntüleyin.
   8. Balık modelinde metastazı kesin olarak doğrulamak için, nöroblastom belirtecine karşı antikorlarla lekelenmiş slaytları 7.
      NOT: H&E lekelenme ile tanımlanan tüm tümör hücrelerinde nöroblastom belirteci, TH için pozitif lekelenme görmeyi bekleyin. Ayrıca LMO1'de metastatik tümörlerin tanımlandığı bitişik dokularda TH için pozitif lekelenme beklenmez ; MYCN balığı. MYCN'ye benzer yaştaki kontrol WT ve YALNıZCA MYCN balıklarını seçtiğinizden emin olun ; Metastatik tümörlerin multifokal primer tümör olma olasılığını ekarte etmek için bu analiz için LMO1 balıkları.
2. Otomatik IHC boyama sistemi olmadan manuel boyama
   1. Slaytlar pişirildikten sonra, H&E ve IHC boyama arasında eşitsizleşme arasında daha iyi karşılaştırma sağlamak için 5.12 adımından bitişik slaytları seçin. Kimyasal duman kaputunun içinde, önceki adımlar 6.1 ve 6.2.'yi kullanarak slaytları ksilen ile dewax ve rehidrat.
   2. Deparaffinizasyon ve rehidrasyondan sonra, slaytları oda sıcaklığında 5 dakika boyunca endojen peroksit blokaj çözeltisinde (%0,1 sodyum azit ve % 0,3 hidrojen peroksit içeren 1x PBS) bekletin. Slaytları taze 1x PBS'de 3 dakika yıkayın ve toplam 3 kez iki kez tekrarlayın.
      DİkKAT: Sodyum azit akut toksiktir. Kurumunuzun yönetmeliklerine bağlı olarak ihtiyati prosedürleri ve reaktifin uygun şekilde bertaraf edilmesini sağlayın.
   3. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca proteinaz K (1x PBS'de 1:500) ile çözeltideki slaytları inkübe ederek antijeni alın. Slaytları her biri 3 dakika boyunca 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
   4. Rocker'da oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1x PBS'de% 5 keçi serumu ile inkübasyon yaparak slaytları engelleyin. Slaytları her biri 3 dakika boyunca iki kez taze 1x PBS ile yıkayın.
   5. Doğrudan kaydırağa 4 damla Avidin engelleme çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Her biri 3 dakika boyunca iki kez taze 1x PBS ile kaydıraları yıkadıktan sonra, 4 damla Biotin engelleme çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
   6. Slaytları bloke ettikten sonra, oda sıcaklığında 45-60 dakika veya gece boyunca 4 °C'de tirozin hidroksilazının (TH) (1:500) birincil antikorunda kuluçkaya yatırın.
      NOT: Primer tümör ve diğer metastatik bölgelerin fizyolojisini ve aktivitesini ele almak için transgenelere ve diğer ilgili belirteçlere karşı ek antikorlarla lekeleyin. Optimal antikor konsantrasyonları antikor ve dokuya bağlı olarak değişebilir.
   7. Slaytları taze 1x PBS ile 3 dakika boyunca yıkayın, toplam 3 kez iki kez tekrarlayın.
   8. Oda sıcaklığında 45-60 dakika boyunca blokaj çözeltisinde seyreltilmiş biyotinillenmiş anti-tavşan IgG ikincil antikorunun ikincil antikorunda (1:500) inkübasyon slaytları. Önceki yıkama adımı 7.2.7'yi tekrarlayın.
   9. HRP konjuge Avidin ekleyin (1x PBS'de 1:300) ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yaslayın. Slaytları her biri 5 dakika boyunca taze 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
   10. 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) çözeltisini (2,5 mL damıtılmış su, 1 damla kit tamponu, 1 damla hidrojen peroksit ve kitten 2 damla DAB) hazırlayın ve DAB damlalarını doğrudan mikroskop yakınındaki slaytlara yerleştirin. DAB ekledikten sonra, mikroskop altındaki slaytlardaki renk değişikliği reaksiyonlarını gözlemleyin. İstenilen lekeleme yoğunluğuna ulaşıldıktan sonra, slayt bölümlerini soğuk damıtılmış suya yerleştirerek reaksiyona son ver.
   11. Numuneleri birkaç saniyeliğine batırarak veya batırarak ve damıtılmış suya geri yerleştirerek slaytları taze% 50 hematoksilin ile karşılayın. İstenildiği gibi tekrarlayın, ancak normalde, doku bölümleri ince olduğu için bir kez yeterli olmalıdır.
   12. Daha önce adım 7.1.5'te açıklandığı gibi alkol gradyanındaki slaytlarda dehidrat doku örnekleri ve IHC analizini bitirmek için kalan adımlarla (son adım 7.1.8 olarak) devam edin.

8. Mekanizma çalışması olarak tümörlerde kollajen birikimi için parafin slaytlarının Picrosirius kırmızı lekesi

1. Slaytlardaki parafin bölümlerini dewax, hidrat ve yıkamak için 6.1-6.3 adımlarını yineleyin.
2. Slayt tutucusundan gelen fazla suyu profesyonel sınıf tüy bırakmayan mendillerle lekelendikten sonra, 10 dakika boyunca% 50 hematoksilin lekesi. Slaytları akan musluk suyuyla 10 dakika durulayın.
3. Slaytları Picrosirius Red'e aktarın ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.
4. Slaytları asitlenmiş suda (1 L musluk veya damıtılmış suda 5 mL buzul asetik asit) iki kez yıkayın, çalkalayıcıda 5 dakika inkübe edin.
5. Mümkün olduğunca fazla su çıkarmak için slaytlardaki bölümleri fiziksel olarak sallamadan ve şiştirmeden önce suyun çoğunu slaytlardan arındırın.
6. Parafin bölümlerini susuzmak için slaytları hızlı bir şekilde% 100 etanol üç değişikliğe yerleştirin.
7. Ksilen ve montaj örneğindeki slaytları temizlemek için 6.10 ve 6.11 adımlarını yineleyin. Ardından, bir kamera ile donatılmış bileşik mikroskoplu görüntü.
8. ImageJ kullanarak, her bölüm için en az üç rastgele alanda picrosirius kırmızı-pozitif kollajen liflerini sayın. MYCN ve MYCN slaytları arasında karşılaştırma; LMO1 balık bölümleri.

Sonuçlar

LMO1'in NB patogenezini etkilemek için MYCN ile sinerji oluşturup oluşturmadığını belirlemek için, dβh promotörünün kontrolündeki PSNS hücrelerinde LMO1 (dβh:LMO1 ve dβh:mCherry) veya MYCN (dβh:EGFP-MYCN) ekspresyonunun yönlendirici transgenik yapıları zebra balığı embriyolarına enjekte ^edildi13. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, kararlı transgenik çizgilerin geliştirilm...

Tartışmalar

Zebra balığı, son birkaç on yıldır, özellikle kanser araştırmalarında, bakım kolaylığı, sağlam üremesi ve in vivo görüntüleme için açık avantajları gibi bariz nedenlerden dolayı yaygın olarak ^{kullanılmaktadır1,28}. Zebra balığı modeli, büyük ölçekli genetik çalışmalar için sıçanlar ve fareler gibi memeli model organizmaları iyi tamamlayan dış döllenmeleri ve gelişimleri nedeniyle embriyonik olarak kolayca manip...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit	Vector	SK-4100
Acetic Acid	Fisher Scientific / Acros Organic	64-19-7
Agarose GP2	Midwest Scientific	009012-36-6
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody	Pel-Freez	P40101
Avidin/Biotin Blocking Kit	Vector	SP-2001
BOND Intense R Detection	Leica Biosystems	DS9263
BOND primary antibody diluent	Leica Biosystems Newcastle, Ltd.	AR9352
BOND-MAX IHC instrument	Leica Biosystems Newcastle, Ltd.	N/A	fully automated IHC staining system
CH211-270H11 BAC clone	BACPAC resources center (BRFC)	N/A
Compound microscope equipped with DP71 camera	Olympus	AX70
Cytoseal XYL (xylene based mounting medium)	Richard-Allan Scientific	8312-4
Eosin	Leica	3801601	ready-to-use (no preparation needed)
Ethanol	Carolina	86-1263
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
Gateway BP Clonase II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
Gateway LR Clonase II enzyme mix	Invitrogen, CA	11791-100
Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated)	Dako	E0432
Hematoxylin Solution, Harris Modified	Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC	HHS-32-1L
HRP Avidin D	Vector	A-2004
Hydrochloric Acid	Aqua Solutions	4360-1L
Hydrogen Peroxide, 3%	Fisher Scientific	H324-500
I-SceI enzyme	New England Biolabs, MA	R0694L
Kanamycin sulfate	Teknova, Inc.	K2150
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes	Fisher Scientific	34133
Lithium Carbonate	Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC	554-13-2
Microtome for sectioning	Leica Biosystems	RM2255
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404006
p3E-polyA	Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah	N/A	a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)
Parafin wax	Surgipath Paraplast	39603002	Parrafin to parafin
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	A11313
pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites)	Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany	N/A	a generous gift
pDONR 221 gateway donor vector	Thermo Fisher Scientific	12536-017
pDONRP4-P1R donor vector	Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah	N/A	a generous gift
Phenol red, 0.5%	Sigma Aldrich	P0290
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X	BioRad	1610780
Picrosirrius red stain kit	Polysciences	24901-250
pME-mCherry	Addgene	26028
Proteinase K, recombinant, PCR Grade	Roche	21712520
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
RDO Rapid Decalcifier	Apex Enginerring	RDO04
Sodium Azide (NaN3)	Sigma Aldrich	26628-22-8
Stereo fluorescence microscope	Leica	MZ10F
Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging	Nikon	SMZ-1500
Taq DNA Polymerase	New England Biolabs, MA	M0273L
Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor	Sakura	N/A	Model #: VIP-6-A1
Tricaine-S	Western Chemical Incorporated	20513
Xylene	Thermo Fisher Scientific	X3P1GAL